Разработка ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y

Полный текст

Введение

В настоящее время известно 52 вида вирусов, поражающих картофель [1]. В Российской Федерации (далее – РФ) пять наиболее опасных видов: вирус картофеля Y (PVY), вирус картофеля X (PVX), вирус скручивания листьев (PLRV) и вироид веретеновидности клубней (PSTVd). Менее опасными, но при этом увеличивающими потери урожая при совместном заражении с другими вирусами, являются вирусы картофеля М и S (PVM и PVS соответственно) [2].

Вирус картофеля Y вызывает серьезные потери урожая картофеля (до 30 % и более в зависимости от времени воздействия, типа вируса, устойчивости сорта растения-хозяина), причем он поражает не только картофель, но и другие сельскохозяйственные культуры как в РФ, так и в других регионах планеты. Все эти факторы делают вирус картофеля Y экономически важным фитопатогеном [3, 4].

Вирус картофеля Y относится к роду Potyvirus, семейству Potiviridae. Вирусные частицы нитевидные, размер составляет 730×11 нм, осаждаются как единый компонент с коэффициентом седиментации около 150S [5]. Геном представлен одноцепочечной позитивной молекулой РНК, длина которой составляет 9.7 тыс. нуклеотидов, 5’-конец РНК ковалентно соединен 5’-концевым терминальным белком (Vpg), на 3’-конце располагается полиА-тракт [6]. Молекула РНК содержит 10 открытых рамок считывания, транслируемых одним полибелком [7].

Вирус картофеля Y передается при контакте поврежденных клубней, а также через семена. Другим агентом распространения вируса являются тли [8].

Симптомы заражения вирусом картофеля Y вариабельные и зависят от таких факторов, как штамм вируса, сорт и условия выращивания растения-хозяина. Может развиваться резкий некроз вдоль жилок, вплоть до полного отмирания листьев. Некроз может быть мозаичным, и сопровождаться морщинистостью листьев, которая может проявляться и без некротических изменений [9].

Множественность путей распространения вируса, вариабельность симптомов выявляют необходимость разработки достаточно быстрого, точного, чувствительного метода для выявления вируса как в организме растения-хозяина, так и в организмах переносчиков.

В настоящее время обычно используется метод иммуноферментного анализа (далее – ИФА) – это высокоточный и высокочувствительный метод, но он достаточно дорог, и для него может быть использован только свежий материал [10]. Второй метод, активно используемый для выявления возбудителей заболеваний, – метод ПЦР, но его классический вариант нельзя применять, так как матрицей для ПЦР является молекула ДНК, а вирус картофеля Y (PVY) РНК-содержащий. Но существует модификация метода ПЦР – обратная транскрипция ПЦР (далее – ОТ-ПЦР), которая позволяет выявлять РНК различных возбудителей [там же]. Метод ОТ-ПЦР по себестоимости сопоставим с иммуноферментным анализом, но позволяет работать не только со свежим, но и фиксированным материалом.

Цель данной работы – разработка ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y в растительном материале. Разработка включает в себя подбор структуры праймеров, условий реакции ОТ-ПЦР, анализ размера амплифицируемого фрагмента, воспроизведение ОТ-ПЦР на растительном материале, определение нуклеотидной последовательности полученного фрагмента, что является подтверждением того факта, что данная ПЦР-тест система выявляет именно наличие РНК вируса картофеля Y.

Материалы и методы

Последовательности геномов вируса картофеля Y (PVY) были скопированы из базы данных Genome, Nucleotide (www.ncbi.nlm.nih.gov). Названия последовательностей и их паспортные номера представлены в табл. 1.

Данные последовательности были проанализированы в программе AliBee - Multiple alignment Release 3.0 на сайте http://www.genebee.msu.su/genebee.html. В выявленных консервативных участках отбирали фрагменты 20–25 нуклеотидов, начинающиеся и заканчивающиеся на гуанин или цитозин (предполагаемые праймеры, представленные в табл. 2). Далее для праймеров проводился расчет температуры отжига по формуле:

Т_отжига = (2×(количество аденина + тимина) + 4×(количество гуанина + циозина)) – 5 .            (1)

Также в программе Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) проверялась уникальность праймеров и присваивался номер от 0 – последовательность не выявляется в нужных видах и генах, до 10 – последовательность выявляется только в геноме вируса и больше нигде.

Из табл. 1 были выбраны два уникальных праймера (уровень уникальности – от 8 и выше) с одинаковыми температурами отжига (допускаются различия температуры отжига до 2 ^оС), которые были синтезированы в фирме Синтол.

В качестве источника нуклеиновых кислот использовались пазушные почки клубня картофеля и покровная ткань вокруг них. Суммарные нуклеиновые кислоты выделялись с помощью модификации гуанидин-изотиоцианатного метода [11].

Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом: 50 нг РНК растворяли в 4 мкл воды, добавляли по 1 мкл обратного праймера в концентрации 40 рМ/мкл, прогревали при 95 ^оС 5 мин, затем добавляли 1 мкл 10Х буфера для обратной транскрипции, 1 мкл смеси dNTPs (концентрация 4 мкМ), 1 мкл обратной транскриптазы MMLV (15 е.а./мкл) (Сибэнзим) и деионизированную воду до 10 мкл. Полученную смесь инкубировали при 37 ^оС 1 ч 10 мин. Затем переосаждали и вносили на реакцию ПЦР: 2 мкл раствора матрицы после обратной транскрипции, 1 мкл буфера для ПЦР с 1.5 мМ MgCl₂, 0.5 мкл смеси dNTPs (концентрация 4 мкМ), по 1 мкл праймеров, концентрация каждого 10 рМ/мкл, 0.75 мкл Taq-полимеразы (5 ед.а./мкл) (Сибэнзим) и деионизированную воду до 10 мкл. Реакция ПЦР состоит из трех этапов 1-й и 3-й состоят из одного цикла, так как не требуется циклическое изменение температуры. Продукты реакции амплификации разделяли в 6 %-ной нативном полиакриламидном геле, который окрашивался бромистым этидием [там же].

ПЦР-продукты экстрагировали из геля [там же] и определяли нуклеотидную последовательность в фирме Евроген. Полученные результаты сравнивали в программе Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) с уже имеющимися в них последовательностями генома различных изолятов вируса картофеля Y.

Результаты и их обсуждение

Вирус картофеля Y имеет белковый капсид, протеомеры которого могут быть использованы для детекции вируса в растительных тканях методом иммуноферментного анализа, однако этот метод достаточно дорог. Метод ПЦР дешевле, при этом имеет сопоставимые чувствительность и точность. Но геном вируса представлен молекулой РНК. Данная молекула не может быть матрицей для стандартного метода ПЦР. Поэтому был выбран метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией.

Для выявления РНК вируса PVY необходимо разработать праймеры. Для этого в базе данных (www.ncbi.nlm.nih.gov) было выбрано 16 последовательностей полных геномов различных изолятов вируса картофеля Y. Последовательности полных геномов использовали для большей простоты выравнивания и получения максимального количества фрагментов последовательности РНК вируса, которые можно было бы использовать в качестве праймеров.

Названия изолятов и их номера в базе данных представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Названия изолятов вируса картофеля Y (PVY) и их идентификационные номера в базе данных Genome, Nucleotide

Table 1. Names of Potato virus Y (PVY) isolates and their identification numbers in the database Genome, Nucleotide

№	Название	Идентификационный номер
1	Potato virus Y isolate May4B, complete genome	MK563993
2	Potato virus Y isolate Egypt35 polyprotein gene, complete	KY863551
3	Potato virus Y isolate Egypt7 polyprotein gene, complete cds	KY863549
4	Potato virus Y isolate Egypt11 polyprotein gene, complete cds	KY863548
5	Potato virus Y isolate VarB, complete genome	KT290512
6	Potato virus Y isolate VarA, complete genome	KT290511
7	Potato virus Y isolate GF_YL20, complete genome	KJ634023
8	Potato virus Y genomic RNA, complete genome, isolate: T13	AB714135
9	Potato virus Y isolate WWA150131_G4_8, complete genome	MT200673
10	Potato virus Y isolate MT12_Oth288, complete genome	MT200671
11	Potato virus Y isolate BL2, complete genome	MT200669
12	Potato virus Y strain N, complete genome	MT350290
13	Potato virus Y strain O, complete genome	MT350288
14	Potato virus Y isolate P097, complete genome	MT264732
15	Potato virus Y isolate PVYO_R3S16L8, complete genome	MK572844
16	Potato virus Y isolate PVYN_O_R3S2L8, complete genome	MK572835

 

Так как геном вируса представляет собой мРНК (+ цепь РНК), кодирующую один полибелок, который транслируется, а затем разрезается на отдельные субъединицы, выбор открытых рамок считывания, кодирующих отдельный белок, не производился, а анализу подвергались нуклеотидные последовательности всего генома.

Далее последовательности были проанализированы в программе AliBee - Multiple alignment Release 3.0 на сайте http://www.genebee.msu.su/genebee.html. В результате сравнения последовательностей выявлены идентичные у всех исследованных изолятов участки геномов, в которых выбирали последовательности для будущих праймеров. Последовательности для праймеров должны быть длиной 20–25 нуклеотидов, начинаться и заканчиваться на гуанин или цитозин.

Затем с помощью формулы (1) были рассчитаны температуры отжига, а также посчитано количество нуклеотидов во всех фрагментах. Далее в программе Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov) проверяли уникальность праймеров. Для этого сравнивали исследуемую последовательность с уже имеющимися в базе. В зависимости от уникальности исследуемым последовательностям присваивалось значение уникальности от 10 (обнаруживается только в геномах различных изолятов вируса картофеля Y) до 0 (не обнаруживается в геномах PVY, но выявляется в геномах других организмов).

Последовательности и их положение в геноме, температура отжига, количество нуклеотидов и его уникальность представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Последовательности, использованные для праймеров, их положение в геноме, длина, температура отжига и степень уникальности

Table 2. Sequences used for primers, their position in the genome, length, annealing temperature and degree of uniqueness

№	Вирус	Положение праймера	Последовательность	Tотжига, °С	Уникальность 0–10
1	PVY	2130 – 2157	GACATGTGTGTGCCAAAGCTTGGAACC	59	8
2	PVY	2140 – 2166	GTGCCAAAGCTTGGAACCTGGCCAAC	60	7
3	PVY	2220 – 2244	CATGATGCAGAACTGCCTAGAATA	52	7
4	PVY	2434 – 2457	ATATCACCTTTCAGAGAAGGAGG	52	9
5	PVY	2811 – 2835	GATGGTGTTGCAAGTTGTTAAGAA	50	7
6	PVY	2962 – 2983	GAAAAATTATCCGCAACATGG	47	7
7	PVY	3163 – 3189	AATATTTCATCCTTTTTCATTCGTAG	48	7
8	PVY	3683 – 3705	AGGGGAGCTGTTGGGTCTGGAA	57	7
9	PVY	4480 – 4503	GTTGATGGCAGAACAATGAAGCA	52	7
10	PVY	4948 – 4976	GATGGATCAATGCATCCTGTCATACATG	56	7
11	PVY	4959 – 4986	GCATCCTGTCATACATGACATTCTTAA	53	7
12	PVY	5323 – 5346	CAGAGCCAATTCAGAAGTCTCAT	52	7
13	PVY	5349 – 5377	GAAGGATGCTCAAGCATGTTTTCAATTG	55	7
14	PVY	5806 – 5833	GAATTCTTTGGATCTGCATACAGGAA	53	7
15	PVY	5857 – 5884	GTTGGTATGGGCAAGTCAAGCAGGAGG	60	7
16	PVY	6085 – 6111	TACTTCAGGAAAGATTGGTCTGACAA	53	8
17	PVY	7152 – 7175	TTCTTCAGGCCTTTGATGGATGC	53	7
18	PVY	7562 – 7586	GGACATTCACTGCTGCACCTTTAG	55	7
19	PVY	7804 – 7829	AGAAGCACATACATGGAAGATTGGG	54	7
20	PVY	7832 – 7857	TGGGGTTGCAAATGTTGCGCAATTT	54	7
21	PVY	7885 – 7908	TCAACTCCAGATGGAACAATTGT	50	7
22	PVY	8346 – 8374	CACCAAATCAGGAGATTCTACTCATGGT	56	7
23	PVY	8567 – 8591	ACACAATCGATGCAGGAGGAAGCA	55	8
24	PVY	8703 – 8730	GCTATCACGTCCAAAATGAGAATGCCC	57	8
25	PVY	8812 – 8839	GCAACTCAATCACAGTTTGATACGTGG	56	7
26	PVY	8900 – 8927	GGCTTATGGTTTGGTGCATTGAAAATG	54	7
27	PVY	8907 – 8935	GGTTTGGTGCATTGAAAATGGAACCTCG	58	8
28	PVY	8942 – 8969	CAACGGAGTTTGGGTTATGATGGATGG	57	9
29	PVY	8992 – 9019	TGAAACCAATCGTTGAGAATGCAAAAC	53	8
30	PVY	9025 – 9051	CTTAGGCAAATCATGGCACATTTCTC	54	8
31	PVY	9038 – 9065	TGGCACATTTCTCAGATGTTGCAGAAG	56	8, 5
32	PVY	9051 – 9079	GATGTTGCAGAAGCGTATATAGAAATGC	55	8
33	PVY	9080 – 9108	GCAACAAAAAGGAACCATATATGCCACG	56	8
34	PVY	9094 – 9118	CCATATATGCCACGATATGGTTTA	50	8
35	PVY	9208 – 9231	CACATTCAAATGAAGGCCGCAGC	55	8
36	PVY	9272 – 9300	AACACAGAGAGGCACACCACCGAGGATG	62	8
37	PVY	9322 – 9351	TCTCCAAGTATGCATACTCTACTTGGAGT	56	8, 5

 

Наибольшей степенью уникальности обладают фрагменты под №№ 28 (уникальность – 9), 31 и 37 (уникальность – 8.5), но у фрагмента № 28 температура отжига составила 57 °С. Фрагменты №№ 31 и 37 имеют одинаковую температуру отжига (56 °С). Поскольку в температурах отжига допускается различие до 2 °С, все три фрагмента могут быть использованы в качестве праймеров, но также необходимо учитывать размер ПЦР-продукта. Оптимальным для разделения с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле являются фрагменты ДНК длиной от 150 до 300 пар нуклеотидов. Фрагменты №№ 28 и 31 будут образовывать ПЦР-продукт длиной 158 пар нуклеотидов, такая длина ближе к нижней границе оптимума. Пары фрагментов №№ 28/37 и №№ 31/37 будут образовывать фрагменты длиной 451 и 313 пар нуклеотидов. Соответственно, такие фрагменты длиннее оптимальных.

Поэтому были рассмотрены фрагменты с №№ 32 по 36, их уникальность составила 8. По температуре отжига совпал фрагмент № 33, у остальных температура отжига не совпадает больше допустимых различий. Определение длины ПЦР-продукта показало, что для пары №№ 33 и 37 она будет составлять 271 пару нуклеотидов, которая попадает в пределы оптимальных длин фрагмента.

Следует отметить, что фрагмент № 4 (уникальность – 9) не рассматривался в связи с далеким расположением от фрагмента № 28, с вероятностью не получить ампликон обычными методами и низкой уникальностью соседнерасположенных фрагментов.

Таким образом, последовательности №№ 33 и 37 были использованы для создания праймеров.

 

Таблица 3. Последовательность праймеров для выявления вируса картофеля Y (PVY)

Table 3. Potato virus Y (PVY) primer sequence

Название праймера	Последовательность праймера	Tотжига, °С	Размер ПЦР-продукта
PVY 1 F	5’ - GCAACAAAAAGGAACCATATATGCCACG - 3’	56	271 п.н.
PVY 1 R	5’ - ACTCCAAGTAGAGTATGCATACTTGGAGA - 3’	56

 

Название и последовательность, температура отжига праймеров представлены в табл. 3, а также предполагаемый размер ПЦР-продукта, рассчитанный по последовательности генома вируса.

Праймеры после обработки были заказаны в фирме Синтол. Далее проводилась проверка работы праймеров в реальных условиях. Для анализа использованы образцы пазушных почек клубней картофеля, так как растущие ткани более пригодны для выделения нуклеиновых кислот как ткани с меньшим размером клеточных стенок и большим объемом генетического материала. Клубни были предоставлены с фермерского поля в Куменском районе Кировской области.

Выбрано восемь клубней с прорастающими пазушными почками, из которых брался материал для обратной транскрипции и ПЦР. Продукты реакции визуализировали методом электрофореза в нативном полиакриламидном геле. Полученный результат представлен на рис. 1.

 

Рисунок 1. Гель-электрофорез в 6 %-ном нативном полиакриламидном геле, продуктов реакции ОТ-ПЦР на наличие вируса PVY. Дорожки 1–8 – реакции с образцами картофеля №№ 1–8; № 9 – отрицательный контроль; М – маркер длин фрагментов ДНК (Сибэнзим). Ожидаемый размер ПЦР-продукта PVY – 271 п.н.

Figure 1. Gel electrophoresis in 6 % native polyacrylamide gel of the RT-PCR reaction products for the presence of PVY. Lanes 1–8 – reactions with potato samples № 1 – № 8; № 9 – negative control; M – marker of DNA fragment lengths (Sibenzyme). The expected size of the PVY PCR product is 271 bp.

 

Как видно из результатов гель-электрофореза, положительный результат выявлен в образце № 1. В дорожке 1 видна единственная четкая полоса чуть ниже полосы маркера длиной 300 пар нуклеотидов. Также слабо светящаяся полоса на том же уровне присутствует в дорожке 6 (образец картофеля № 6). Наличие полос означает, что праймеры провзаимодействовали с матрицей, а размер полученного фрагмента ДНК соответствует ожидаемому. Эти факты позволяют предполагать, что в образцах картофеля №№ 1 и 6 присутствует РНК вируса PVY. Тогда как в других образцах вирус отсутствует. Отсутствие дополнительных полос на дорожках 1 и 6 указывает на то, что праймеры отжигаются только на одном участке в образце нуклеиновых кислот, что подтверждает высокую степень уникальности, которая была определена теоретически. Отсутствие одинаковых полос во всех образцах подтверждает отсутствие реакции праймеров с РНК хозяина, а также их уникальность.

Кроме того, задачей являлась оценка возможности использовать данные праймеры в существующих условиях реакции ПЦР для выявления вируса картофеля Y.

Так как положительный контроль – образец ткани картофеля, зараженного вирусом Y, отсутствовал, проверку того, что данный амплифицированный фрагмент и есть ДНК-копия генома вируса картофеля Y, проводили, определяя нуклеотидную последовательность полученного ПЦР-продукта.

Образец РНК № 1 использовали для получения ПЦР-продукта, который был очищен и отправлен на определение нуклеотидной последовательности в фирму Евроген.

Получена следующая последовательность нуклеотидов: TGGCATTCTCATTTTGGACGTGATAGCTAAGCCTAAATATGCAATGCAGGGATATTTACAATTTTTTATAAAAACACCCAGACCAAAACAAGTATCAACAGTCTGCTTCCTCCTGCATCGATTGTGTCA.

Она короче, чем размер ПЦР-продукта, так как секвенирование ПЦР-продуктов затруднено, поэтому в текстовый редактор переведен только тот участок, в котором были наиболее точные результаты капиллярного гель-электрофореза.

Полученная последовательность проанализирована в Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov). Результаты представлены на рис. 2.

 

Рисунок 2. Результаты проверки нуклеотидной последовательности в Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Figure 2. Results of verification of the nucleotide sequence in Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov).

 

Как видно из результатов сравнения последовательности с последовательностями из базы данных генов в Nucleotide blast (www.ncbi.nlm.nih.gov), исследуемая последовательность на 100 % совпадает с последовательностью генома вируса картофеля Y (PVY). Соответственно, данная пара праймеров в выбранных условиях обеспечивает амплификацию с матрицы РНК PVY и может быть использована как пара праймеров для ПЦР-тест системы для выявления вируса картофеля Y.

Данная система апробирована с использованием материалов, предоставленных Институтом агробиотехнологий ФИЦ Коми НЦ УрО РАН (Республика Коми, г. Сыктывкар). Проанализировано 48 клубней картофеля по окончании периода зимней лежкости в хранилище Института. Клубни отобраны от 16 селекционных сортообразцов питомников предварительного, основного и конкурсного испытаний по три клубня от каждого номера. В данном случае повторность не учитывалась, так как клубни были выкопаны с разных участков полей и не могли быть перезаражены через насекомых или какие-либо микромеханические повреждения. Поэтому можно было анализировать клубни как отдельных представителей, возможно, зараженные патогеном. Из 48 образцов зараженными оказались восемь, т.е. процент общей зараженности составил 16.7 %. Только в одном сортообразце отмечено заражение двух клубней из трех, в остальных же случаях заражен был только один клубень из трех. Можно предположить, что, с одной стороны, это показывает, что механические микроповреждения, получаемые клубнями в ходе уборки копателем и контактом с его рабочим органом, обеспечивают непосредственно перенос патогена, так как сами клубни не контактировали и находились на разных участках полей, а с другой – заражение произошло в ходе контакта уже непосредственно во время закладки в лечебный период и при последующем зимнем хранении. Таким образом, данная аналитическая система требует дальнейшей проверки с подбором материала.

Заключение

Разработана ПЦР-тест система для выявления генетического материала вируса картофеля Y. По результату анализа генома подобраны праймеры, апробированные в условиях реакции. Таким образом, праймеры PVY 1 F и PVY 1 R готовы для разработки тест-системы для выявления материала вируса PVY. Так же были подобраны условия реакции, и за счет определения нуклеотидной последовательности подтверждена достоверность реакции.

Об авторах

Екатерина Андреевна Бессолицына

Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого

Email: bess2000@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5582-1709

кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики и селекции

Россия, 610007, Киров, ул. Ленина, д. 166а

Алексей Геннадьевич Тулинов

Институт агробиотехнологий ФИЦ Коми НЦ УрО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: toolalgen@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7184-6113

кандидат сельскохозяйственных наук, научный сотрудник отдела сельскохозяйственной геномики

Россия, 167023, Сыктывкар, ул. Ручейная, д. 27

Нина Владиславовна Новоселова

Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого

Email: syllvana@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0638-4258

младший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики и селекции

Россия, 610007, Киров, ул. Ленина, д. 166а

Анастасия Владимировна Харина

Федеральный аграрный научный центр Северо-Востока имени Н. В. Рудницкого

Email: Khavchas@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0554-5814

кандидат сельскохозяйственных наук, заведующая лабораторией молекулярной генетики и селекции

Россия, 610007, Киров, ул. Ленина, д. 166а

Список литературы

Дополнительные файлы