Quantitative and Qualitative Analysis of Serum Exosomes at Different Stages after Ischemic Stroke

Texto integral

Список сокращений:

ИИ – ишемический инсульт

КТ – компьютерная томография

МРТ – магнитная резонансная томография

NIHSS – шкала Национального института здравоохранения США (The National Institutes of Health Stroke Scale)

MoCA – монреальская когнитивная шкала (Montreal Cognitive Assessment)

HADS – госпитальная шкала тревоги и депрессии (Hospital Anxiety and depression Scale)

ТМТ – тандемная массовая метка (tandem mass tag)

PSM – соответствие пептидного спектра (peptide-spectrum match)

FDR – частота ложного обнаружения (False Discovery Rate)

ЛП – липопротеины

Апо- – аполипротеин

ЛПНП – липопротеины низкой плотности

ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности

ВВЕДЕНИЕ

Ишемический инсульт (ИИ), нарушение мозгового кровообращения с повреждением ткани мозга и изменением его функций, чаще всего бывает обусловлен стенозом внутричерепной артерии и окклюзией средней мозговой артерии [1]. Патологическое повреждение ишемизированных тканей, кровеносных сосудов и нервной системы зависит от длительности сосудистой эмболии и часто приводит к необратимым последствиям. Восстановление после ИИ включает в себя ряд патофизиологических процессов, происходящих как в самом мозге, так и за его пределами [2, 3]. Первые сутки после ИИ обозначают как сверхострую фазу, первые семь суток как острую фазу, первые 3–6 месяцев как подострую фазу, а начиная с 6 месяцев как хроническую фазу [4]. Обоснование этой классификации заключается в том, что процессы, связанные с восстановлением после инсульта, зависят от времени. Было показано, что уже в первые сутки после ИИ запускается каскад механизмов, связанных с воспалением в области ишемического очага с активацией резидентной глии, массивной секрецией медиаторов воспаления и инфильтрацией периферических иммунных клеток через нарушенный гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) [5]. По данным литературы, наиболее значительные улучшения после ИИ происходят в первый месяц после инсульта, часто достигая относительного плато через 3 месяца, особенно в отношении двигательных симптомов [6]. Через 6-12 месяцев выздоровление обычно достигает своего предела, приводя к более или менее стабильному, хроническому состоянию с разной степенью выраженности функционального восстановления. Несмотря на существующее мнение о том, что восстановление после ИИ следует определенным закономерностям, нет однозначного понимания причин разной индивидуальной степени и скорости выздоровления пациентов после инсульта. Комплексная оценка патогенеза ИИ на разных его стадиях имеет основополагающее значение для разработки подходов к персонализированному лечению пациентов, перенесших инсульт.

Как кратковременные, так и отсроченные процессы восстановления после ИИ обусловлены высокоорганизованным взаимодействием структур и клеток мозга с другими органами и тканями. От полноценности и направленности этих взаимодействий во многом зависят скорость и степень восстановления пациентов после ИИ. Многочисленные исследования показали, что экзосомы участвуют в модуляции патофизиологических процессов после ИИ, опосредуя коммуникацию между клетками и тканями, в первую очередь, путем доставки таких молекул, как белки и микроРНК [7, 8].

Экзосомы представляют собой подмножество внеклеточных везикул диаметром от 30 до 150 нм, которые высвобождаются из мультивезикулярных тел, липидной двухслойной мембранной структуры и несут функциональное содержимое, включающее нуклеиновые кислоты, белки, липиды и метаболиты [9, 10]. После инсульта экзосомы могут синтезироваться и высвобождаться клетками головного мозга, пересекать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и обнаруживаться в периферической крови или спинномозговой жидкости, а также высвобождаться в кровоток из клеток крови в ответ на инсульт [11]. Показано, что высвобождение экзосом из разных типов поврежденных клеток мозга в периферическое кровообращение после инсульта запускает продукцию циркулирующих воспалительных цитокинов и модулирует периферические иммуновоспалительные реакции путем рекрутирования и активации Т- и В-лимфоцитов [12]. Получены данные о том, что экзосомы участвуют в повышении долгосрочной нейропротекции после инсульта, способствуют регенерации нервов, ускоряют неврологическое восстановление и регулируют периферические иммунные реакции. Есть данные об их участии в модуляции процессов ангиогенеза, нейрогенеза и ремоделирования аксональных дендритов [13]. Уникальные способности экзосом целенаправленно переносят информационные биомолекулы через ГЭБ в обоих направлениях, модулируя биологические процессы и сохраняя переносимый “груз” от разрушения в биологических жидкостях организма, делают их перспективным объектом для исследования многих патологий мозга, включая ИИ. Показано, что экзосомы являются перспективными кандидатами на роль биомаркеров для ранней диагностики и прогнозирования инсульта, а также для разработки способов его лечения [11].

Белковый состав внеклеточных везикул на данный момент хорошо изучен, сведения о нем собраны в базе данных Vesiclepedia (http://microvesicles.org) и постоянно пополняются. Кроме того, данные о составе экзосом, включая РНК и липиды, содержатся в базе ExoCarta (http://www.exocarta.org). Сравнительный анализ белкового состава экзосом сыворотки крови пациентов, обследованных на разных сроках после ИИ, направлен на поиск потенциальных мишеней для оценки состояния пациентов с целью снижения рисков развития неблагоприятных исходов. В настоящее время методы протеомного анализа позволяют количественно оценить белковые профили различных биологических жидкостей, клеток и их производных практически при любой патологии.

Цель исследования: в работе был проведен сравнительный количественный анализ белковых профилей экзосом сыворотки крови пациентов, обследованных на разных сроках после ИИ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты. В исследовании приняли участие 30 человек, проходившие лечение в ГБУЗ им. Кончаловского в 2021–2023 гг. Пациенты были отобраны в исследование согласно следующим критериям: возраст 45–80 лет; ишемический инфаркт головного мозга полушарной локализации; легкая и средняя тяжесть ИИ; поступление в стационар не позже 48 часов после ИИ. Критериями исключения были: наличие инсульта, черепно-мозговой травмы в анамнезе с остаточными очаговыми изменениями на КТ/МРТ; наличие когнитивных и депрессивных нарушений в анамнезе; острые и хронические соматические и гормональные заболевания; алкогольная или наркотическая зависимость. Было обследовано: 9 человек в первые сутки после ИИ, 5 человек через 1 месяц после ИИ, 5 человек через 1 год после ИИ и 11 человек через 1.5-2 года после ИИ.

Социально-демографические сведения, анамнез заболевания и жизни были собраны у пациентов после ИИ в период первичной госпитализации. Оценка неврологических, психиатрических и когнитивных показателей состояния испытуемых проводилась с использованием следующих психометрических инструментов: NIHSS [14]; MoCA [15]; HADS [16]. Информированное согласие на участие в исследовании было подписано каждым включенным в исследование испытуемым.

Подготовка образцов для исследования. Забор крови у пациентов на всех сроках обследования проводился из локтевой вены в утренние часы натощак в вакуумные системы с активатором свертывания для получения сыворотки крови с последующим центрифугированием при 2000 g 15 мин при 4°С.

Оценка концентрации экзосом в сыворотке крови в каждой пробе была выполнена методом иммуноферментного анализа наборами ELISA EXO-TEST (HansaBioMed) в соответствии с инструкцией производителя.

Для получения экзосом из сыворотки крови пациентов были использованы наборы для выделения экзосом Exo-prep (HansaBioMed). Далее для удаления загрязняющих компонентов проводили экстракцию белка в системе хлороформ-метанол по следующему протоколу. К исходным образцам в объеме 100 мкл добавляли 400 мкл метанола 99.8%, перемешивали 30 с. Добавляли 100 мкл хлороформа 99.5%, перемешали 30 с. Добавляли 300 мкл воды, перемешали 30 сек. Смесь центрифугировали в течение 2 мин при 14000 g. Удаляли надосадочную жидкость и к нижней фракции добавляли 400 мкл метанола, перемешивали 30 с, центрифугировали в течение 5 мин при 13000 g, удаляли супернатант. Осадок высушивали при комнатной температуре.

Полученный осадок экзосом крови пациентов и растворенный по инструкции производителя стандарт экзосом HBM-PES-100 (HansaBioMed) лизировали в кратном объёме буфера, содержащего 10% SDS в 50 мM триэтиламмония бикарбонате (ТЕАБ). Далее был проведен гидролиз белков трипсином с использованием фильтров S-Trap. На гидролиз белков трипсином брали по 50 мкг белка для образцов экзосом, выделенных из крови пациентов и все доступное количество (93 мкг) для образца-стандарта экзосом.

После гидролиза белков в супернатантах проб определяли общую концентрацию пептидов методом колориметрического анализа с использованием набора Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) в соответствии с рекомендациями производителя. Пептиды высушивали и растворяли в 0.1% муравьиной кислоте до конечной концентрации 0.3 мкг/мкл.

Хромато-масс-спектрометрия образцов и идентификация белков. Полученные пептиды разделяли с использованием хроматографической ВЭЖХ системы Ultimate 3000 RSLCnano (“Thermo Scientific”, США).

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре Q-Exactive HFX (“Thermo Scientific”, США), как описано ранее [17]. Идентификацию белков проводили при помощи программного обеспечения MaxQuant v. 2.0.3.0 с использованием поискового алгоритма Andromeda [18]. Для идентификации белков использовали базу данных протеома человека в UniProt (UP000005640). Для валидации сопоставлений (образования пар) спектров и пептидов PSM (Peptide-Spectrum Matches), идентификации пептидов и идентификации белков устанавливали пороговую величину FDR (False Discovery Rate) 0.01. Белки рассматривались в качестве достоверно идентифицированных, если для них было обнаружено, по крайней мере, два пептида.

Мечение пептидов проводили с использованием 10-плексного набора меток ТМТ. Перед хромато-масс-спектрометрией образцов с использованием ТМТ и идентификацией белков было проведено обессоливание образцов. Меченые ТМТ пептиды разделяли с использованием хроматографической ВЭЖХ системы Ultimate 3000 RSLCnano (“ThermoScientific”, США).

Масс-спектрометрический анализ проводили на масс-спектрометре Q-Exactive HFX (“Thermo Scientific”, США), как описано ранее [17].

Идентификацию белков проводили при помощи программного обеспечения MaxQuantv.2.0.3.0 с использованием поискового алгоритма Andromeda [18]. Включали опцию “Matchbetweenrun” и выбирали тип нормализации “weighted ratio to reference channel”, определяя вес в соответствии с рекомендациями из публикации [19]. Для валидации сопоставлений (образования пар) спектров и пептидов PSM, идентификации пептидов и идентификации белков использовали величину FDR не более 1.0%. Для сравнительного количественного анализа при помощи ТМТ проводилась дополнительная нормализация. Для этого рассчитывался суммарный сигнал для всех белков в каждом ТМТ-канале.

Дальнейший анализ данных, полученных в ходе идентификации и дополнительной нормализации, проводили в программе Perseus.2.0.11. Для количественной оценки содержания белков в программу загружали величины нормализованной интенсивности “NormRIC”. Данные фильтровали, удаляя белки-контаминанты, ложно-положительные идентификации, оставляя в анализе белки, которые были идентифицированы по 2 и более пептидам. Группы белков, не имеющие 85% достоверных значений нормализованной интенсивности “NormRIC”, хотя бы в одной экспериментальной группе, были удалены.

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов, включая пробоподготовку, был проведен на базе ЦКП “Протеом человека” ИБМХ им. В.Н. Ореховича, г. Москва.

Статистический анализ. Статистическая обработка и визуализация данных были проведены в программах STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc., Tulsa, OKUSA) и GraphPad Prism version 9.4.1. software (GraphPad Software, Inc., SanDiego, CA, USA), а также в среде программирования R с использованием как встроенных пакетов, так и дополнительных (heatmap2, ggplot2 и др.). Нормальность распределения определяли при помощи теста Шапиро-Уилка. Для сравнения двух количественных несвязанных выборок с нормальным распределением данных был использован t-тест Стьюдента. Для поиска различий в частотах встречаемости различных признаков использовали точный тест Фишера. Результаты на графиках представлены как среднее и стандартная ошибка среднего. Корреляции рассчитывали при помощи теста Пирсона. При p < 0.05 различия считали достоверными; при p < 0.1 различия считали на уровне тенденции к достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика пациентов, включенных в исследование. Были проанализированы показатели 30 пациентов: 9 человек через сутки после ИИ, 5 человек через месяц после ИИ, 5 человек через год после ИИ, 11 человек через 1.5–2 года после ИИ. Пациенты сравниваемых групп не отличались по возрасту, по соотношению мужчин и женщин в группах, по сопутствующим заболеваниям, по локализации и латерализации инсульта, по данным психометрическим шкал, а также по показателям рутинных лабораторных исследований (табл. 1). Включенные в исследование пациенты перенесли ИИ легкой/умеренной степени тяжести (средний балл по NIHSS при поступлении составлял 5.9 ± 4.3). Пациенты, обследованные на 1-е сутки после ИИ, закономерно имели более высокие показатели по шкале NIHSS по сравнению с данными пациентов, протестированных на более поздних сроках (через месяц, через год и через 1.5–2 года после ИИ).

 

Таблица 1. Показатели групп пациентов на разных сроках после ИИ. Статистические различия количественных переменных между временными точками оценивались с помощью one-way ANOVA теста с последующим post-hoc анализом при помощи теста Тьюки. Статистические различия качественных переменных оценивались при помощи точного теста Фишера. *p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.0001

Показатель mean ±SD	1 сутки n = 9	1 месяц n = 5	1 год n = 5	1,5-2 года n = 11	p-value
Возраст, годы	54.4 ± 13.2	55.8 ± 12.05	57.2 ± 5.1	59.5 ± 6.6	0.72
Пол (муж/жен), n	5/4	3/2	3/2	9/2	0.63
Дислипидемия (да/нет), n	5/4	3/2	3/2	4/7	0.78
Курение (да/нет), n	4/5	3/2	1/4	6/5	0.67
Локализация (средняя/задняя, мозговая артерия), n	7/2	3/2	2/3	8/3	0.56
Латерализация (правосторонний/левосторонний), n	4/5	1/4	2/3	8/3	0.25
NIHSS, баллы	5.4 ± 2.6	1.6 ± 1.8	1.2 ±١ .6	0.8 ± 1.5	0.0001 1 сутки-1 месяц p = 0.01**; 1 сутки-1 год p = 0.003**; 1 сутки-2 года p = 0.0001****
MoCA, баллы	26.4 ± 2.6	26.8 ± 2.1	27.2 ± 1.3	24.3 ± 3.5	0.14
HADS тревога, баллы	3.9 ± 3.3	2.8 ± 1.3	2.6 ± 1,6	2.6 ± 2.2	0.66
HADS депрессия, баллы	2.8 ± 3.5	2 ± 1.7	2.2 ± 2.1	3.4 ± 2.5	0.76
Глюкоза, нмоль/л	6.2 ± 0.9	5.5 ± 0.5	5.8 ± 0.8	5.4 ± 0.4	0.1
Холестерин, мкмоль/л	5.3 ± 1.4	4.8 ± 1.6	5.0 ± 0.8	4.4 ± 0.9	0.37
Протромбиновый индекс, отн. ед.	101.4 ± 8.1	100.8 ± 5.6	110.4 ± 9.0	103.7 ± 3.7	0.33
Лейкоциты, 109 в мл	7.7 ± 4.3	7.0 ± 1.4	6.2 ± 1.6	7.3 ± 1.6	0.83
Лимфоциты, %	30.5 ± 19.0	38.0 ± 4.6	27.7 ± 4.9	26.7 ± 10.3	0.44
Нейтрофилы, %	53.1±26.5	49.2±5.6	60.1±9.5	62.6±12.6	0.46
Кол-во белка/частицу, μg/μl	6.4 ± 3.2	4.9 ± 2.4	7.1 ± 4.06	7.5 ± 3.52	0.55
Количество экзосом/мл^109	5.2 ± 1.3	5.4 ± 0.9	4.5 ± 1.4	9.4 ± 3.5	0.002 1 сутки-2 года p = 0.01**; 1 месяц-2 года p = 0.03* 1 год-2 года p = 0.01*

 

У пациентов, обследованных через 1.5–2 года после ИИ, был выявлен достоверно повышенный уровень экзосом в сыворотке крови по сравнению с пациентами других групп на фоне сходного количества суммарного белка на частицу (экзосому) (табл. 1).

Протеомный анализ экзосом сыворотки крови пациентов после ИИ. В результате протеомного анализа экзосом сыворотки крови было определено 228 белков без учета белков-контаминант. В качестве стандарта был использован коммерческий образец экзосом сыворотки крови человека HBM-PES-100 (HANSA BIOMED). Данный образец анализировали при помощи панорамной масс-спектрометрии для определения его белкового состава и сравнения с белками экзосом, выделенных из сыворотки крови пациентов в разное время после ИИ.

В результате хромато-масс-спектрометрического анализа в образце-стандарте было достоверно идентифицировано 200 белков без учета белков-контаминантов. Для сравнения белкового состава образца-стандарта экзосом и образцов экзосом, полученных из сыворотки крови пациентов, построили диаграммы Венна при помощи ресурса: https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/ (рис. 1). Для того, чтобы избежать разночтений при наличии синонимичных изоформ белков в образцах пациентов и в стандарте, диаграмму Венна строили на основе названия гена. При этом для стандарта количество уникальных записей для названий генов составляло 175, а для образцов от пациентов – 159. Более 75% белков (n = 122) из образцов сыворотки крови пациентов являлись общими с белками образца-стандарта HBM-PES-100. Полученные результаты свидетельствуют о приемлемом качестве выделения внеклеточных везикул (экзосом) из сыворотки крови пациентов в разные сроки после ИИ.

 

Рис. 1. Диаграмма Венна, демонстрирующая различие белкового состава образцов экзосом: стандарта HBM-PES-100 (n = 175), обозначенного как EV_STD, и образцов экзосом, выделенных из сыворотки крови пациентовEV_patient (n = 159)

 

Для сравнительного анализа белков экзосом пациентов на разных сроках после ИИ отбирали белки с количественной оценкой на основе ТМТ, для которых было определено, по меньшей мере, 85% валидных значений хотя бы для одной из экспериментальных групп (n = 162). При сравнительной оценке белковых профилей экзосом сыворотки крови не было выявлено четкого разделения образцов по белковым профилям на разных сроках после ИИ. Тем не менее, были выявлены некоторые аполипопротеины и иммуноглобулины, уровень которых была различной в экзосомальной фракции сыворотки крови пациентов на выбранных сроках после ИИ.

Аполипопротеины экзосомальной фракции сыворотки крови с различным уровнем на разных сроках после ИИ. Известно, что аполипопротеины обеспечивают растворимость липидных комплексов и их транспорт, а также действуют как лиганды для рецепторов ЛП, регулируют образование ЛП, служат активаторами или ингибиторами ферментов, участвующих в метаболизме ЛП. При сравнении белкового состава экзосом сыворотки крови пациентов на ранних и поздних сроках после ИИ были найдены достоверные различия по уровням аполипопротеинов: Апо-А1 (рис. 2а), Апо-L1 (рис. 2б) и Апо-В (рис. 2в). Известно, что Апо-А1 играет важную роль в транспортировке избытка холестерина. Помимо атеропротекторного эффекта, Апо-А1 оказывает также противовоспалительное и антиоксидантное действие. Есть данные, что снижение уровня Aпо-A1 в сыворотке крови увеличивает риск глубокого подкоркового инфаркта, который часто сопряжен с поражением белого вещества головного мозга [20]. Известно, что Апо-L1 всегда ассоциирован с Апо-А1 и представлен не только в крови, но и в центральной нервной системе. Напротив, Aпо-B, являющийся основным структурным белком ЛПНП и ЛПОНП при окислении создает множество провоспалительных продуктов и способствует распространению атерогенеза в артериальной стенке [21].

 

Рис. 2. Уровень аполипопротеинов: Апо-А1(а), Аpo-L1 (б), Апо-В (в) в экзосомах сыворотки крови пациентов на разных сроках после ИИ. Статистические различия между временными точками оценивались при помощи one-way ANOVAтеста с post-hoc анализом при помощи теста Тьюки. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001

 

Сравнительный анализ аполипопротеинов экзосомальной фракции сыворотки крови из семейства липокалинов Апо-Dи Апо-М, входящих в состав ЛПВП и обладающих способностью связывать и транспортировать малые липофильные белки, представлен на рис. 3а и рис. 3б. Достоверные различия по уровням этих белков были найдены при сравнении экзосомальных фракций пациентов, обследованных в первые сутки и в отдаленный период после ИИ. Известно, что указанные белки связаны с нейропротекцией. Есть данные, что нейропротекторный и противовоспалительный эффект Апо-D может быть результатом его способности стабилизировать арахидоновую кислоту на клеточной мембране или изолировать ее, тем самым предотвращая ее трансформацию в провоспалительные молекулы. Известно, что у человека Апо-D концентрируется в цитозоле глиальных клеток белого вещества. В сером веществе Aпо-D преимущественно локализован в протоплазматических астроцитах и в некоторых нейронах. Aпо-D также обнаруживается в цитозоле периваскулярных клеток и в лизосомах перицитов стенок кровеносных сосудов неокортекса [22].

 

Рис. 3. Уровень аполипопротеинов: Апо-D(а), Апо-М(б), в экзосомах сыворотки крови пациентов на разных сроках после ИИ. Статистические различия между временными точками оценивались при помощи one-way ANOVA теста с post-hoc анализом при помощи теста Тьюки. *p < 0.05, **p < 0.01

 

При сравнительном анализе белков экзосомальной фракции сыворотки крови групп пациентов, обследованных на разных сроках после ИИ, также были найдены различия в уровнях свободной каппа-цепи иммуноглобулина 1–8 и соединительной (J) цепи иммуноглобулина (рис. 4а, 4б). Известно, что оба иммуноглобулина задействованы в регуляции иммунного ответа, располагаются во внеклеточном пространстве и входят в состав циркулирующих иммуноглобулиновых комплексов.

 

Рис. 4. Уровни иммуноглобулинов: Свободная каппа-цепь иммуноглобулина 1-8 (а) и Соединительная (J) цепь иммуноглобулина (б) в экзосомах сыворотки крови пациентов на разных сроках после ИИ. Статистические различия между временными точками оценивались при помощи one-way ANOVA теста с post-hoc анализом при помощи теста Тьюки. *p < 0.05

 

Выявленные достоверные различия при попарном сравнительном анализе уровней белков экзосом сыворотки крови групп пациентов на разных сроках после ИИ. При сравнении белковых профилей экзосом сыворотки крови пациентов, обследованных в первые сутки после ИИ и через месяц после ИИ, не было выявлено существенных различий в экспрессии белков.

При сравнительной оценке белков экзосом сыворотки крови групп пациентов, обследованных через 1 месяц и через 1 год после ИИ, были найдены достоверные различия по экспрессии 13 белков. Среди них 50% составляли белки, участвующие в процессе свертывания крови, около 30% ‒ иммуноглобулины и приблизительно 20 % Aпо- B и Aпо-D (табл. 2).

 

Таблица 2. Уровни белков для которых были выявлены достоверные различия при попарном сравнительном анализе протеома экзосом сыворотки крови пациентов через 1 месяц и через 1 год после ИИ. Статистические различия между группами оценивались при помощи t-теста. Различия считали достоверными при p < 0.05

Название белка	Название гена	Уровень месяц→год	p-value
Свободная лямбда-цепь иммуноглобулина 3-10	IGLV3-10	↑	0.022
Тяжелая цепь иммуноглобулина 6-1	IGHV6-1	↓	0.010
Аполипопротеин D	APOD	↓	0.026
Церулоплазмин	CP	↓	0.007
Альфа-2-макроглобулин	A2M	↓	0.004
Кининоген-1	KNG1	↓	0.049
Свободная каппа-цепь иммуноглобулина 5-1	LOC644704	↓	0.045
Альфа-1-микроглобулин	AMBP	↓	0.027
Аполипопротеины B-100; B-48	APOB	↓	0.033
Кофактор гепарина 2	SERPIND1	↓	0.037
Тяжелая цепь ингибитора интер-альфа-трипсина H2	ITIH2	↓	0.007
Тяжелая цепь ингибитора интер-альфа-трипсина H1	ITIH1	↓	0.039
Тяжелая цепь ингибитора интер-альфа-трипсина H4	ITIH4	↓	0.029

 

Уровни практически всех белков, для которых были найдены достоверные различия между группами, была ниже у пациентов, обследованных через год после ИИ, по сравнению с показателями пациентов, обследованных через месяц после ИИ. Полученные данные не противоречат имеющейся информации о том, что через 6–12 месяцев после ИИ восстановительный процесс обычно достигает своего предела, приводя к более или менее стабильному, хроническому состоянию организма [23].

При попарном сравнении белковых профилей экзосом сыворотки крови групп пациентов через 1 месяц и 1.5–2 года после ИИ были найдены достоверные различия по уровням 31 белка. При этом уровни примерно 30% из них на поздних сроках после ИИ были повышены по сравнению с ранним постинсультным периодом. Примечательно, что все белки с выявленным повышенным уровнем через 1.5–2 года после ИИ имели отношение к активации/регуляции иммунной системы. Уровни остальных белков экзосомальной фракции сыворотки крови (примерно 20% белков, регулирующих липидный обмен, 50% белков, связанных со свертываемостью крови и гомеостазом) была понижена у пациентов через 1.5–2 года после ИИ по сравнению с пациентами, обследованными через 1 месяц после ИИ (табл. 3). Повышенные уровни в экзосомальной фракции пациентов, обследованных через 1.5–2 года после ИИ, имели белки комплемента: C1q, C1s, C1r, образующие комплекс макромолекул C1 и инициирующие классический путь комплемента, C7 компонент комплемента, который входит в комплекс мембранной атаки, а также различные иммуноглобулины. Повышенные уровни белков системы комплемента и иммуноглобулинов, выявленные в экзосомальной фракции пациентов на поздних сроках после ИИ, наблюдались на фоне пониженного уровня белка каллистатина, предположительно участвующего в противодействии воспалительным реакциям, ретинол-связывающего белка и транстиретина. Необходимо отметить, что в недавнем исследовании было показано, что низкий уровень сывороточного транстиретина, оцененного в первый месяц и через год после инсульта, оказался независимым предиктором неблагоприятного исхода ИИ [24].

 

Таблица 3. Уровни белков для которых были выявлены достоверные различия при попарном сравнительном анализе протеома экзосом сыворотки крови пациентов через 1 месяц и через 1.5–2 года после ИИ. Статистические различия между группами оценивались при помощи t-теста. Различия считали достоверными при p < 0.05

Название белка	Название гена	Уровни 1 месяц→1.5–2 года	p-value
Лямбда-цепь иммуноглобулина 3-10	IGLV3-10	↑	0.000
Субкомпонент комплемента C1s	C1S	↑	0.000
Субкомпонент комплемента C1r	C1R	↑	0.000
Соединительная (J) цепь иммуноглобулина	IGJ; JCHAIN	↑	0.001
Субъединица субкомпонента С комплемента C1q	C1QC	↑	0.001
Компонент комплемента c7	C7	↑	0.003
Свободная каппа-цепь иммуноглобулина 1-6	IGKV1-6	↑	0.002
Тяжелая цепь иммуноглобулина 3/OR16-12	IGHV3OR16-12	↑	0.001
Субъединица субкомпонента B комплемента C1q	C1QB	↑	0.002
Лямбда-цепь иммуноглобулина 5-1 HA; VOR	GLV	↑	0.002
Пренилцистеин оксидаза 1	PCYOX1	↓	0.002
Кофактор гепарина 2	SERPIND1	↓	0.002
Калликреин плазмы	KLKB1	↓	0.002
Каллистатин	SERPINA4	↓	0.002
Антитромбин-III	SERPINC1	↓	0.001
Ретинол-связывающий белок 4	RBP4	↓	0.002
Бета-2-гликопротеин 1	APOH	↓	0.001
Белок, родственный гаптоглобину	HPR	↓	0.002
Аполипопротеин A-I	APOA1	↓	0.001
Аполипопротеин C-IV	APOC4	↓	0.001
Фиколин-3	FCN3	↓	0.001
Транстиретин	TTR	↓	0.001
Тяжелая цепь ингибитора интер-альфа-трипсина H4	ITIH4	↓	0.000
Кининоген-1	KNG1	↓	0.000
Аполипопротеин А	LPA	↓	0.000
Протромбин	F2	↓	0.000
Альфа-2-макроглобулин	A2M	↓	0.000
Аполипопротеин E	APOE	↓	0.000
Аполипопротеин L1	APOL1	↓	0.000
Аполипопротеин B-100; B-48	APOB	↓	0.000

 

Полученные данные дают основание предполагать, что период 1.5–2 года после ИИ может оказаться принципиально важным для оценки процессов, связанных с постинсультным иммуновоспалением и его распространением с привлечением экзосомального транспорта [23]. Для проверки этого предположения был проведен сравнительный анализ белковых профилей экзосом пациентов, разделенных на две группы: пациенты, обследованные в период до года после ИИ, и пациенты, обследованные более, чем через года после ИИ.

Сравнительный анализ уровней белков экзосом сыворотки крови пациентов, обследованных в периоды до года и более года после ИИ. На рис. 5 приведена тепловая карта, на которой представлены результаты иерархической кластеризации белков и образцов пациентов, обследованных до года и более года после ИИ.

 

Рис. 5. Тепловая карта (heatmap), демонстрирующая результаты иерархической кластеризации образцов и белковых профилей всех пациентов после ИИ. Показана кластеризация уровней белков у групп пациентов до года и более года после ИИ

 

При иерархической кластеризации произошло разделение образцов по белковым профилям групп пациентов, обследованных до года и более года после ИИ, которое в целом подтвердило результаты, полученные при попарном сравнительном анализе уровней белков экзосом сыворотки крови пациентов через 1 месяц и 1.5–2 года после ИИ. При сравнении экзосомальных белковых профилей пациентов, обследованных до года после ИИ с данными пациентов, обследованными в период более года после ИИ, были выявлены повышенные уровни белков C1q, C1s, C1r, образующие комплекс макромолекул C1 комплемента, C7 компонента комплемента и различных иммуноглобулинов. Также в экзосомальной фракции сыворотки крови у этих пациентов были выявлены повышенные уровни фибриногена, фактора фон Виллебранда, известного не только своей гемостатической ролью, но и в качестве одного из медиаторов сосудистого воспаления [25] и фибронектина. По данным ряда исследований фибронектин, белок, связанный с интегринами, участвует в индукции периваскулярного отложения амилоида-β после инсульта [26, 27].

ОБСУЖДЕНИЕ

Пациенты, принявшие участие в исследовании, перенесли ИИ легкой/средней степени тяжести. Полученные результаты указывают на то, что даже относительно невысокий уровень повреждения структур головного мозга, приводящий к ишемическим изменениям, может активировать иммунные и воспалительные процессы как в самом мозге, так и за его пределами, провоцируя длительные системные нарушения в периферических органах.

Известно, что экзосомы задействованы в патофизиологии ИИ [28‒30]. Сравнительная оценка протеома экзосом сыворотки крови пациентов на разных сроках после ИИ выявила достоверные изменения в уровнях примерно 30 белков между ранним и поздним постинсультным периодом. В частности, на поздних сроках после ИИ в экзосомальной фракции сыворотки крови пациентов были выявлены повышенные уровни некоторых белков системы комплемента, иммуноглобулинов, фактора фон Виллебранда и фибронектина по сравнению с показателями пациентов, обследованных до года после ИИ.

Хорошо известно, что система комплемента задействована в патофизиологии ИИ, и часто ее активация на поздних сроках связана с неблагоприятным исходом [31, 32]. Показано также, что активация каскадов свертывания крови дополнительно генерирует воспалительные сигналы [33]. Недавние исследования свидетельствуют о том, что активированные после инсульта эндотелиальные и иммунные клетки и иммунные комплексы могут способствовать тромбовоспалению, аберрантной и чрезмерной активации иммунотромбоза [34]. Совокупность функционально связанных между собой процессов воспаления и коагуляции способна усугублять реакции, запущенные ишемическим повреждением мозга, и способствовать вторичным осложнениям инсульта на поздних сроках восстановления [35]. Ранее было показано, что экзосомы содержат белки воспаления, которые способствуют распространению воспаления после травмы головного мозга, включая инсульт [36]. Выявленные повышенные уровни белков, связанных с иммунной системой и свертываемостью крови в экзосомальной фракции сыворотки крови у пациентов, обследованных более года после ИИ, по сравнению с ранним периодом после ИИ свидетельствуют о возможном участии экзосом в распространении иммуновоспаления, приводящего к вторичным осложнениям. Достоверно повышенное количество экзосом в сыворотке крови пациентов, обследованных в период 1.5-2 года после ИИ, по сравнению с показателями пациентов, обследованных на более ранних сроках, косвенно подтверждает это предположение.

Полученные результаты также подтверждают многочисленные исследования о многофазности иммунного ответа при восстановлении после ИИ, подчеркивая различную степень выраженности системного воспаления на ранних и поздних стадиях заболевания [35]. Ранее было показано, что в острой фазе после инсульта периферическая иммунная система быстро активируется в ответ на повреждение головного мозга, вызванное инсультом. За этим первым острым системным ответом следует состояние иммуносупрессии, которое характеризуется потерей и резистентностью иммунных клеток. Хроническая, менее изученная фаза после ИИ характеризуется устойчивым остаточным воспалением низкой степени тяжести, которое потенциально способно влиять на долгосрочный исход пациентов после ИИ [23]. Полученные результаты могут свидетельствовать о более высоком уровне активации иммунной системы на отдаленных сроках после инсульта по сравнению с ранним постинсультным периодом и указывают на участие экзосом в этих процессах.

В настоящее время большинство критериев, оценивающих долгосрочные последствия инсульта, опираются на клинические данные пациентов с ограниченным использованием информации об их молекулярно-биохимических показателях. Поэтому дальнейшее исследование динамики изменения количества и молекулярно-биохимических показателей экзосом на отдаленных сроках после инсульта позволит получить информацию, необходимую для более объективной оценки рисков неблагоприятных исходов ИИ, связанных с иммуновоспалением, и поиска потенциальные мишеней для их снижения.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность сотрудникам ГБУЗ ГКБ им. М.П. Кончаловского ДЗМ: зав. отделением, врачу-неврологу Владимировой Е.Е. и нейропсихологу Ереминой Н.Н. за предоставление клинической информации по пациентам; сотрудникам ЦКП “Протеом человека” ИБМХ им. В.Н. Ореховича за выполнение хромато-масс-спектрометрического анализа предоставленных проб и помощь в обработке и интерпретации полученных результатов.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект номер 21-75-20112).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическое одобрение. Исследование проведено в соответствии с рекомендациями Хельсинкской декларации и одобрено этическим комитетом ГБУЗ Научно-практического психоневрологического центра имени З.П. Соловьева ДЗМ (протокол № 42 от 23.08.2019).

Информированное согласие. Информированное согласие было получено от всех испытуемых, участвовавших в исследовании.

Sobre autores

M. Zhanina

Research and Clinical Center for Neuropsychiatry of Moscow Healthcare Department; Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of the Russian Academy of Sciences

Email: druzhkova.tatiana@mail.ru
Rússia, Moscow; Moscow

T. Druzhkova

Research and Clinical Center for Neuropsychiatry of Moscow Healthcare Department

Autor responsável pela correspondência
Email: druzhkova.tatiana@mail.ru
Rússia, Moscow

A. Yakovlev

Research and Clinical Center for Neuropsychiatry of Moscow Healthcare Department; Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of the Russian Academy of Sciences

Email: druzhkova.tatiana@mail.ru
Rússia, Moscow; Moscow

A. Gekht

Research and Clinical Center for Neuropsychiatry of Moscow Healthcare Department; Pirogov Russian National Research Medical University

Email: druzhkova.tatiana@mail.ru
Rússia, Moscow; Moscow

N. Gulyaeva

Research and Clinical Center for Neuropsychiatry of Moscow Healthcare Department; Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology of the Russian Academy of Sciences

Email: druzhkova.tatiana@mail.ru
Rússia, Moscow; Moscow

Bibliografia

Arquivos suplementares