Assessment of radiobiological effects of γ-irradiation of barley seeds Hordeum vulgare L.

Full Text

Анализ механизмов стрессовых реакций у растительных организмов на воздействие низкими дозами ионизирующего излучения является важной фундаментальной задачей современной радиобиологии, решение которой позволит продвинуться в понимании адаптивных реакций на слабые внешние воздействия. Изучение влияния γ-облучения семян на дальнейшее развитие растений является одним из приоритетных направлений в современной науке, так как является основной частью работы по научному обоснованию технологии предпосевного облучения семян.

Известно, что предпосевное γ-облучение семян стимулирует развитие растений в условиях солевого стресса [1].

Положительное воздействие стимулирующих доз γ-облучения на значимые хозяйственные признаки отмечали при выращивании в вегетационные сезоны, контрастные по погодным условиям. Однако слишком сухие или экстремально влажные условия могут свести до минимума стимулирующий эффект облучения семян [2].

Главным препятствием для широкого использования предпосевного облучения семян является нестабильность эффекта гормезиса как в лабораторных, так и в полевых условиях [1, 3, 4]. Несмотря на это, исследование влияния γ-облучения на сельскохозяйственные культуры внесет вклад в расшифровку адаптивных реакций растений и позволит повысить эффективность создания стрессоустойчивых сортов [4]. Стоит отметить, что сортовые отличия сельскохозяйственных культур по радиочувствительности различаются в 1.5–5.0 раз, необходимо накопление новых экспериментальных данных по изучению эффекта стимуляции при γ-облучении семян сельскохозяйственных растений различных сортов.

Поэтому целью настоящей работы была оценка влияния γ-облучения на морфологические и биохимические показатели проростков ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare L.) сорта Витязь.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

В качестве объекта исследования был выбран ячмень обыкновенный сорта Витязь, так как данный сорт характеризуется высокой адаптацией к неблагоприятным абиотическим факторам и хорошей урожайностью [5]. Схема эксперимента заключалась в следующем: воздействию облучения γ-квантами подвергались семена ячменя обыкновенного сорта Витязь, которые затем проращивали в рулонных культурах согласно ГОСТу 12038-84 [6]. Изменения изучаемых показателей исследовали на проростках ячменя. Для количественной оценки влияния ионизирующего излучения были выбраны следующие показатели: морфологические – длина проростка и главного корня; биохимические – концентрация основных фотосинтезирующих пигментов (хлорофилла a, хлорофилла b, каротиноидов). Облучение семян γ-квантами проводили на базе Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба ‒ филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (МРНЦ им. А.Ф. Цыба ‒ филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России) на установке «Луч-1» (⁶⁰Со) при мощности дозы 97 сГр/мин в бумажных конвертах с площадью поверхности 25 см². В каждом конверте находилось по 30 семян, три пакета на каждую дозу γ-облучения. Серии опытов проводили 3 раза.

Диапазон исследуемых доз облучения был выбран на основании большого количества литературных данных, где было показано, что стимуляция роста проростков наблюдается в диапазоне доз от 10 до 20 Гр при мощности дозы 55–60 Гр/ч [1, 7–9]. Для наших экспериментальных исследований был выбран следующий диапазон доз – 2, 5, 10, 15, 20, 25, 50 Гр.

Проращиваемые семена выдерживали в рулонных культурах в термостате при температуре 22–24,5 ^оС, на 5-е сутки помещали под фитолампу Osram Fluora L 18W/77 (Германия), световой поток – 550 лм, мощность – 18 Вт. На 7-е сутки измеряли длину главного корня и ростков. На 10-е сутки проводили измерение количественного содержания фотосинтетических пигментов (хлорофилла a, хлорофилла b и каротиноидов) в ацетоновой вытяжке [10] путем пересчета оптической плотности.

Проростки отрезали и взвешивали на весах навеску массой 100 мг. Навеску помещали в керамическую ступку и растирали в течение 5–7 мин до гомогенного состояния, порционно добавляя 10 мл 100%-ного ацетона. Осадок и надосадочную жидкость количественно переносили на стеклянный фильтр, укрепленный в колбе Бунзена. Фильтрование производили с помощью водоструйного насоса. Фильтрат собирали в мерную колбу и доводили 100%-ным ацетоном до 25 мл. Экстракт помещали в кювету фотометра КФК-3-01 (Россия) толщиной 1 см. В кювету с холостой пробой наливали растворитель (100%-ный ацетон). Определение концентрации хлорофиллов и каротиноидов проводили по регистрации оптической плотности при длинах волн 470, 646 и 663 нм. Для каждой пробы проводили пять измерений.

Количественное содержание хлорофилла a (C_a) в мг/л определяли по формуле (1):

C_a = 12.21D₆₆₃ – 2.81D₆₄₆. (1)

Содержание хлорофилла b (C_b) в мг/л определяли по формуле (2):

C_b = 20.13D₆₄₆ – 5.03D₆₆₃. (2)

Содержание каротиноидов (С_кар) в мг/л определяли по формуле (3):

C_кар = (1000D₄₇₀ – 3.27С_a − 100С_b) / 229, (3)

где D₄₇₀, D₆₄₆ и D₆₆₃ – оптическая плотность вытяжки при 470, 646 и 663 нм соответственно, С – концентрация пигмента в вытяжке (мг/л).

Установив концентрацию пигментов в вытяжке, определяли его содержание в исследуемой ткани с учетом объема вытяжки и массы пробы (4):

F = VC / P, (4)

где F − содержание пигмента в растительном материале (мг/г сырой массы), V − объем вытяжки (л), C − концентрация пигмента (мг/л), P − навеска растительного материала (г).

Статистический анализ данных. Оценки средних и доверительных интервалов проводили стандартными методами математической статистики. Обработка полученной информации проводилась с использованием пакета приложений Microsoft Excel 2016. Для проверки гипотезы о нормальном распределении использовали критерий Шапиро – Уилка. В ходе статистической обработки для оценки достоверности различий по морфометрическим показателям использовали параметрический критерий Стьюдента, а для оценки биохимических показателей – непараметрический расширенный критерий Манна – Уитни, так как длина вариационного ряда не превышала пяти значений в каждой повторности. Наблюдаемые различия считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0.05. Экспериментальные данные были проверены на наличие выбросов, которые исключали из дальнейшего анализа. На диаграммах представлены средние значения и стандартные ошибки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе экспериментальных исследований были выявлены статистически значимые различия в длине главного корня и ростков, появившихся при прорастании облученных семян на 7 сутки после облучения (рис. 1).

 

Рис. 1. Зависимость длины ростков (а) и длины главного корня (б) от дозы γ-излучения облученных семян на 7-е сутки проращивания, данные приведены в виде: среднее ± SE.

* Статистически значимое отличие от контроля при р < 0.05

Fig. 1. Dependence of the length of sprouts (a) and the length of the main root (b) on the dose of γ-irradiation of irradiated seeds on the 7th day of germination, the data are given as: mean ± SE

* Statistically significant difference from control at р < 0.05

 

Из рис. 1, а видно, что при всех исследуемых дозах γ-облучения, кроме 50 Гр, длина ростков либо не отличается от контрольных растений, либо при действии γ-излучения в дозе 15 и 20 Гр значимо превышает контроль (максимальное увеличение длины ростка отмечено при облучении семян в дозе 15 Гр (на 31% по сравнению с контролем)), что может свидетельствовать о наличии стимулирующего эффекта. Облучение в дозе 50 Гр значимо снижает длину ростков. Эти данные свидетельствуют о том, что количество возникших повреждений меристематических клеток зародыша семени велико и отражается на способности растений к росту. Полученные данные хорошо соотносятся с результатами других исследований, выявленных при облучении злаковых растений [1, 7, 9].

На панели (б) рис. 1 показано изменение длины главного корня у проростков ячменя, облученных в тех же диапазонах доз. Видно, что в этом случае облучение семян в дозах 5–20 Гр вызывает статистически значимый прирост корня (максимальное увеличение длины главного корня на 27% по сравнению с контролем наблюдалось при облучении семян в дозе γ-облучения 20 Гр). Тогда как и в предыдущем случае ионизирующее излучение в дозе 50 Гр оказывает угнетающее действие.

Хорошо известно, что морфологические показатели растений напрямую зависят от запаса питательных веществ в семени на ранних стадиях развития, а затем от интенсивности фотосинтеза. Поэтому особый интерес представляло изучить влияние ионизирующего излучения на концентрацию фотосинтетических пигментов – хлорофилла a, хлорофилла b и каротиноидов и выявить возможную корреляцию между изменениями морфологических и биохимических показателей.

Результаты изменения концентрации фотопигментов представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Зависимость содержания хлорофилла a (а) и хлорофилла b (б) (мг/г сырой массы) от дозы γ-излучения облученных семян на 10-е сутки проращивания, данные приведены в виде: среднее ± SE.

* Статистически значимое отличие от контроля при р < 0.05.

Fig. 2. Dependence of the content of chlorophyll a (a) and chlorophyll b (b) (mg/g fresh weight) on the dose of γ-radiation of irradiated seeds on the 10th day of germination, the data are given as: mean ± SE.

* Statistically significant difference from control at р < 0.05.

 

По результатам исследования видно, что концентрация хлорофилла a статистически значимо снижается при облучении семян в дозах 2, 5, 10, 25 и 50 Гр, при действии ионизирующего излучения в дозе 15 Гр выявлено стимулирующее действие (рис. 2, а). Аналогичные данные получены и при изучении изменения содержания хлорофилла b от дозы излучения (рис. 2, б).

На рис. 3 представлены результаты зависимости содержания каротиноидов от дозы γ-излучения.

 

Рис. 3. Зависимость содержания каротиноидов (мг/г сырой массы) от дозы γ-излучения облученных семян на 10-е сутки проращивания, данные приведены в виде: среднее ± SE

* Статистически значимое отличие от контроля при р < 0.05.

Fig. 3. Dependence of the content of carotenoids (mg/g fresh weight) on the dose of γ-radiation of irradiated seeds on the 10th day of germination, the data are given as: mean ± SE.

* Statistically significant difference from control at р < 0.05.

 

Отмечено, что повышение концентраций пигмента наблюдается при воздействии излучения в дозе 15 и 20 Гр (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

Данные, полученные в ходе экспериментальных исследований, позволяют сделать следующие выводы: действие γ-излучения в дозе 15 и 20 Гр значимо увеличивает длину ростков, однако увеличение длины главного корня у проростков ячменя происходит при γ-облучении в диапазоне доз от 5 до 20 Гр. Исследователи [8] предлагают связывать увеличение длины главного корня и ростка с более ранним развитием проростков ячменя, семена которых были облучены в стимулирующих дозах по сравнению с контрольными. Возможное объяснение данного эффекта связано с увеличением содержания индолилуксусной кислоты, зеатина, индолилмасляной кислоты и уменьшением концентраций абсцизовой кислоты [11]. Стоит отметить, что в диапазоне доз 4–20 Гр экспрессия генов катаболизма последнего фитогормона усиливается [12]. Помимо фитогормонов важное влияние оказывает ферментативная система, контролирующая важные метаболические пути и антиоксидантную защиту в растительных клетках. В работе [13] авторы показывают, что каталаза, гваяколовая пероксидаза, пируваткиназа и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы вносят вклад в эффект стимуляции роста проростков при γ-облучении в диапазоне доз 10–20 Гр.

Ионизирующее излучение может оказывать разнонаправленное действие на содержание биохимических компонентов в облученных растениях и влиять на их метаболизм [14]. Можно предположить, что при низких дозах с увеличением поглощенной дозы ионизирующего излучения увеличивается количество свободных радикалов, что является не только следствием нарушения гомеостаза, а представляет собой важный компонент фенотипической адаптации, так как активные формы кислорода (АФК) являются сигнальными молекулами при развитии стрессовой реакции у растений [15]. При облучении в дозах 5–20 Гр наблюдается эффект стимуляции, однако он не всегда повторяется, и его природа объясняется неодинаково [16]. При облучении γ-квантами в стимулирующих дозах формируются адаптационно-приспособительные признаки: модулируются антиоксидантная и фитогормональная системы, усиливается интенсивность работы пентозофосфатного пути окисления глюкозы, благодаря изменению окислительно-восстановительного гомеостаза хлоропластов увеличивается содержание хлорофиллов и каротиноидов, которые защищают структуры клеток от повреждающего действия свободных радикалов [4]. АФК косвенно изменяют клеточный метаболизм и активируют важнейшие физиологические функции, которые выражаются в интенсификации накопления ауксинов, повышении активности деления клеток меристемы зародышевых корешков и, как следствие этого, усилении роста корешков и ростков [17].

Дальнейшее увеличение поглощенной дозы ионизирующего излучения вызывает повышение концентрации ингибитора прорастания – абсцизовой кислоты, вследствие чего тормозится рост корней и проростков. В исследовании [11] показано, что γ-облучение семян ячменя сорта Нур в дозе 50 Гр вызывало накопление абсцизовой кислоты в проростках на ранних этапах онтогенеза.

У высших растений молекулы хлорофилла a и хлорофилла b входят в состав пигмент-белковых комплексов, поскольку в свободном виде, будучи сильнейшими фотосенсибилизаторами, они могут вызвать разрушение мембран тилакоидов и стромы хлоропласта за счет фотодинамического эффекта. Под действием ионизирующего излучения усиливается распад белковых комплексов, происходит растяжение тилакоидных мембран и потеря гран в хлоропластах, что приводит к уменьшению концентрации фотосинтезирующих пигментов и сдвигу в обмене веществе в целом [4, 18].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в ходе проведенного исследования выявлено стимулирующее действие γ-облучения в дозах 15 и 20 Гр на длину ростка ячменя обыкновенного сорта Витязь, на длину корня стимулирующее действие γ-облучения выявлено в диапазоне доз 5–20 Гр. Анализ содержания хлорофиллов a и b выявил повышение концентраций у проростков облученных семян в дозе 15 Гр. По содержанию каротиноидов стимулирующими дозами γ-облучения являлись 15 и 20 Гр. Наблюдаемые в настоящей работе эффекты хорошо согласуются с данными, полученными другими авторами на других сортах ячменя. Безусловно, необходимо продолжать исследования механизмов формирования эффекта гормезиса, преимущественно на генетическом уровне, так как не существует единой концепции формирования данного феномена.

Вклад авторов: все авторы внесли эквивалентный вклад в подготовку публикации.

Contribution of the authors: the authors contributed equally to this article.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией статьи.

Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interests.

About the authors

Svetlana O. Afonina

Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering

Author for correspondence.
Email: astakhina@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-3776-1703
Russian Federation, Obninsk

Liudmila N. Komarova

Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering

Email: komarova_l411@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0491-4486
Russian Federation, Obninsk

Marina M. Rasskazova

Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering

Email: rassmarina@mail.ru
Russian Federation, Obninsk

References

Supplementary files