Catalytic Properties of Immobilized Phytase of Silvania hatchlandensis FG 3.9.1

Full Text

Фитаза (мио-инозитол-1,2,3,4,5,6-гексакис-фосфат-фосфогидролаза, КФ 3.1.3) входит в подкласс фосфатаз, которые расщепляют сложноэфирные связи фосфорной кислоты в молекуле фитиновой кислоты. Все фитазы в зависимости от того, с какого атома углерода инозитола начинается гидролиз фосфатов, подразделяются на четыре типа: 3-фитазы (КФ 3.1.3.8), 4-фитазы (КФ 3.1.3.26), 5-фитазы (КФ 3.1.3.72) и 6-фитазы (КФ 3.1.3.26). Различают кислые, нейтральные и щелочные фитазы в зависимости от рН-оптимума. На основании механизма катализа и структурных особенностей данные ферменты классифицируются на гистидиновые кислые фосфатазы (НАРs), β-пропеллерные фитазы (BPPs), пурпурные кислые фосфатазы (PAPs) и цистеиновые фосфатазы (CPs) [1].

Фитазы широко используются в качестве добавки в корма для рыб, свиней и птиц, так как в их пищеварительном тракте отсутствуют эти ферменты, поэтому большая часть фосфора из растительных продуктов не усваивается. Экзогенный неорганический фосфат, добавляемый в корма для восполнения недостатка этого элемента, выводится из организма животных и попадает в водоемы, что приводит к их эвтрофикации [2, 3]. Включение фитаз в рацион животных позволит увеличить доступность фосфора органических соединений и уменьшить или исключить минеральные добавки к кормам в виде неорганических фосфатов [4, 5]. Кроме того, органический фосфор составляет около 50% от общего содержания этого элемента в почве, и только менее 1% может напрямую усваиваться сельскохозяйственными культурами [6]. Фосфор фитатов, которые являются основным источником данного элемента в почвах, становится доступным для питания растений только после его высвобождения под действием фитаз [7]. Экзогенное добавление биопрепаратов в виде микроорганизмов-продуцентов данных ферментов или выделенного фермента в почвы будет способствовать повышению их плодородия и позволит снизить количество вносимых минеральных удобрений. Перспективным направлением применения фитаз является их внесение в побочные продукты животноводства в процессе компостирования. В результате этого получают органические удобрения, в которых питательные вещества становятся доступными для поглощения растениями. Однако применение фитаз в свободной форме в промышленных масштабах ограничено их низкой стабильностью, чувствительностью к денатурации под действием различных условий эксплуатации, изменений рН, температуры и минерализации [8].

Одним из наиболее широко используемых методов повышения активности, стабильности, а также возможности повторного использования ферментов является их иммобилизация. Иммобилизованные ферменты — биокатализаторы, искусственно закрепленные на нерастворимых носителях или включенные в их структуру. Неоспоримым преимуществом данного процесса является упрощение отделения биокатализатора от среды, которая содержит в себе целевые продукты, более долгая эксплуатация ферментов, повышение их устойчивости к действию различных внешних факторов. Эффективность иммобилизации зависит от применяемого метода и используемого носителя [9]. Метод включения ферментов в структуру геля является универсальным и позволяет получать препараты любой формы (сферические частицы, пленки, гранулы). При химической иммобилизации между белком и носителем создаются новые ковалентные связи, фермент прикрепляется многоточечно, что приводит к повышению его стабильности. Однако иммобилизация фермента может привести и к значительной потере активности фермента при взаимодействии между функциональными группами биокатализатора и носителя [10].

Сохранение сложной трехмерной молекулярной структуры фитаз имеет важное значение для их стабильности во время высокотемпературной обработки при производстве кормов [11]. Для получения высоко термостабильных фитаз используют несколько подходов: 1) поиск и выделение продуцентов термоустойчивых ферментов из природных источников; 2) создание генно-модифицированных организмов, экспрессирующих фитазы термофилов; 3) молекулярная инженерия фитаз; 4) иммобилизация фермента, использование носителей, создающих “защитную” оболочку [12].

Известны различные подходы к иммобилизации фитаз: закрепление на поверхности, включение в структуру органических и неорганических матриц, использование наноструктур, получение поперечно-сшитых агрегатов фермента, иммобилизация целых клеток [13]. Включение в гель альгината кальция и хитозана является дешевым, быстрым и нетоксичным для фермента методом иммобилизации. Изучение каталитических свойств фитазы рекомбинантной Klebsiella sp. ASR1, иммобилизованной в альгинате, показало, что, фермент проявлял максимальную активность при рН 6 и 70°C, тогда как неиммобилизованный — при рН 5 и 37°C [14]. В результате иммобилизации фитазы ризосферного почвенного гриба Penicillium purpurogenu GE1 в альгинате установили почти 3-кратное увеличение удельной активности и смещение температурного оптимума фермента с 27 до 45°C [15]. Термостабильность иммобилизованной в альгинате кальция фитазы, которую оценивали по остаточной ферментативной активности после нагревания, увеличилась до 80% по сравнению с таковой нативного фермента [16]. Высокостабильные ферментные препараты были получены при иммобилизации фитазы термофила Geobacillus sp. TF16 включением в гель альгината кальция и ковалентной сшивкой с хитозаном, активированным глутаровым альдегидом: фермент проявлял максимальную активность при pH 3.0 и 75°C и pH 5.0 и 95°C соответственно [17]. Была разработана гидрогелевая гранула для поддержания каталитической активности и защиты выделенной фитазы от воздействия температуры и протеаз. В такой гидрогелевой грануле присутствовало ядро, состоящее из комплекса фитаза-хитозан, и оболочка из ковалентно сшитого альгината и κ-каррагинана, которая обеспечивала термостойкость. Иммобилизованная в гидрогелевой грануле фитаза сохраняла 70.67 ± 5.51% активности по сравнению с нативным ферментом даже после термической обработки [18].

Несмотря на активное изучение иммобилизованных микробных фитаз, разработка наиболее предпочтительных методов и носителей для иммобилизации этого фермента остаются актуальными. Известно множество микроорганизмов-продуцентов фитаз, но очень немногие из них используются в коммерческих целях. Достичь производственного уровня мешает неспособность фермента выдерживать экстремальные температуры, его высокая стоимость, катализ в ограниченном диапазоне pH и недостаточная стабильность биокатализатора [19]. В связи с этим представляет интерес поиск микроорганизмов — новых продуцентов фитаз в экстремальных биотопах в сочетании со скринингом предпочтительных методов иммобилизации фермента, которые позволят получить биокатализатор, долговременно сохраняющий активность при повышенной температуре, минерализации и в широком диапазоне рН.

Цель работы — получение ферментного препарата, содержащего фитазу, из клеток галоалкалотолерантных энтеробактерий Silvania hatchlandensis ФГ 3.9.1, выделенных из среды антропогенного происхождения, иммобилизация фермента методами ковалентного присоединения к активированному хитозану и включения в структуру геля альгината бария, а также изучение каталитических свойств нативной и иммобилизованной фитазы.

МЕТОДИКА

Выделение, идентификация фитат-гидролизующих бактерий и определение фитазной активности микробных клеток. Из образцов грунта содового шламохранилища АО “Березниковский содовый завод”, г. Березники (Россия) был выделен изолят грамотрицательных бактерий ФГ 3.9.1. Накопительную культуру получали на питательной среде Phytase Screening Medium (PSM), следующего состава (г/л): CaCl₂ — 2; NH₄NO₃ — 5; KCl — 0.5; MgSO₄∙7H₂O — 0.5; FeSO₄∙7Η₂O — 0.01; MnSO₄∙H₂O — 0.01; глюкоза — 20; фитат натрия — 4 и высевали на агаризованную среду того же состава. Колонии, вокруг которых образовывалась зона просветления агаризованной среды, отбирали для определения фитазной активности.

Фитазную активность бактериальных клеток определяли по методу Грайнера [20]. Ферментативную реакцию проводили с 0.1 М фитатом натрия 30 мин при 37°С и рН 4.5. Оптическую плотность, пропорциональную концентрации свободного неорганического фосфора, измеряли на спектрофотометре SmartSpec Plus (“Bio-RAD”, США) при длине волны 355 нм (ОП₃₅₅). Удельную активность фитазы (Е) выражали в мкмоль неорганического фосфата/(мг·мин).

Идентификацию изолята ФГ 3.9.1 проводили физиолого-биохимическими, хемотаксономическими, морфологическими методами (окраска по Граму, морфология клеток и колоний, подвижность, тесты на наличие каталазы и оксидазы, рост на сахарах, состав клеточной стенки) и методом секвенирования гена 16S рРНК. ПЦР осуществляли с универсальными праймерами 27F и 1492R (27F 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3' и 1492R 5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'), сконструированными на основе последовательностей, представленных в базе данных GenBank. Синтез праймеров и секвенирование ампликонов проводили в ЗАО “Евроген” (Москва). Полученные нуклеотидные последовательности генов сравнивали с хранящимися в базе данных EzBioCloud (https:// www.ezbiocloud.net/). Сходство изолята ФГ 3.9.1 с типовым штаммом Silvania hatchlandensis H19S6^T составило 99.87%.

Выделение фитазы и получение ферментного препарата. Silvania hatchlandensis ФГ 3.9.1 культивировали в 1 л жидкой питательной среде БТН (“Биотехновация”, Россия) в колбах объемом 2 л на шейкере в течение 7 сут при температуре 25°С. Биомассу отделяли центрифугированием при 4500 g в течение 15 мин, клетки отмывали от среды калий-фосфатным буфером (рН 7.4 ± 0.2). Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗГ8 0.4/22 (ВНИИТВЧ, Россия) при частоте 22 кГц 7 раз по 20 с, охлаждая суспензию на ледяной бане.

Гомогенат центрифугировали при 4500 g 15 мин с охлаждением до 4°С. Белок выделяли ступенчатым осаждением сульфатом аммония (10–70% от насыщения) для получения отдельных фракций. В каждой из них определяли концентрацию белка по методу Брэдфорд с Кумасси бриллиантовым синим G-250. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Степень очистки фермента определяли как отношение удельной активности фракции к удельной активности исходного препарата.

Иммобилизация фитазы и определение каталитических характеристик иммобилизованного и свободного белка. Раствор хитозана (4% в 2%-ной уксусной кислоте) накапывали через шприц объемом 5 мл в 1 М раствор КОН. Гранулы хитозана после отвердевания отмывали 0.1 М фосфатным буфером (рН 7.4 ± 0.2) до нейтральной реакции промывных вод. Для активации микросферы выдерживали ночь в 0.1%-ном глутаровом альдегиде, после чего отмывали 0.1 М фосфатным буфером (рН 7.4 ± 0.2) от несвязанного сшивающего агента. Активированные гранулы смешивали с раствором фермента, выдерживали в течение 24 ч в статических условиях в холодильнике (6–8°С), затем отмывали 0.1 М калий-фосфатным буфером (рН 7.4 ± 0.2) от несвязавшегося белка. Количество связанного белка определяли по разности его концентрации до и после иммобилизации фермента. Полученный иммобилизованный препарат хранили при температуре 6°С.

Для иммобилизации фермента методом включения в структуру геля раствор фермента смешивали с 4%-ным альгинатом натрия в соотношении 1 : 2. Полученную смесь накапывали при помощи шприца, объемом 5 мл, в холодный 0.1 М раствор BaCl₂. Полученные гранулы выдерживали в свежем растворе хлорида бария в течение 24 ч при температуре 6°С, после чего отмывали дистиллированной водой и хранили в холодильнике.

Реакцию, катализируемую иммобилизованной фитазой и ферментом в растворе, проводили с 0.001–0.1 М фитатом натрия 30 мин при 37°С, pH 4.5. Активность фермента определяли по методу Грайнера. За единицу активности принимают количество фермента (мг), расщепляющего фитат натрия с образованием 1 мкмоля неорганического фосфата за 1 мин. Константу Михаэлиса (K_M) и максимальную скорость (V_max) ферментативной реакции, катализируемой иммобилизованным и нативным ферментом, вычисляли по графику Лайнуивера-Берка, построенному по методу двойных обратных координат.

Для определения операционной стабильности активности полученных биокатализаторов проводили последовательные циклы реакций иммобилизованного фермента с фитатом натрия, после каждой реакции иммобилизованный фермент отмывали от реакционной среды 0.1 М калий-фосфатным буфером (рН 7.4 ± 0.2) и использовали в следующем цикле.

Зависимость активности иммобилизованной фитазы и фермента в растворе от температуры определяли при гидролизе 0.01 М фитата натрия (рН 4.5) в течение 30 мин при температуре от 30 до 80°С в термостате ТС — 1/80 СПУ (“Лабтех”, Россия).

Для определения термостабильности иммобилизованную и нативную фитазу инкубировали в течение 15, 30, 45 и 60 мин при 50, 60 и 70°С и быстро охлаждали на ледяной бане. Гидролиз 0.01 М фитата натрия проводили при 37°С, рН 4.5. Константы термоинактивации фермента (К_ин) определяли по графику зависимости натурального логарифма активности от времени экспозиции при данной температуре и выражали в обратных минутах (мин^–1).

Зависимость активности иммобилизованной фитазы и свободного фермента от рН реакционной среды изучали при гидролизе 0.01 М раствора фитата натрия в течение 30 мин при 37°С в буферных растворах, содержащих лимонную кислоту (рН 3–6); трис(гидроксиметил)аминометан (рН 7), борную кислоту (рН 8–11), гидроксид натрия и хлорид калия (рН 12).

Результаты представлены средними значениями по трем независимым опытам, определяли стандартное отклонение и ошибку среднего (M ± m).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выделение фитазы из клеток S. hatchlandensis ФГ 3.9.1. В результате фракционирования сульфатом аммония супернатанта разрушенных ультразвуком клеток S. hatchlandensis ФГ 3.9.1 был получен ферментный препарат, содержащий фитазу, и определена степень очистки фермента (табл. 1).

 

Таблица 1. Стадии очистки ферментного препарата, содержащего фитазу

Стадия очистки	Удельная активность, мкмоль/(мл ∙ мин)	Концентрация белка, мг/мл	Удельная активность, мкмоль/(мг∙мин)	Степень очистки
Супернатант	32.3 ± 1.4	14.49 ± 0.44	2.229 ± 0.076	–
Осаждение сульфатом аммония, концентрация в % от насыщения
10	7.8 ± 2.8	1.653 ± 0.025	4.60 ± 1.60	2
35	6.8 ± 1.7	1.726 ± 0.012	3.89 ± 0.99	1.8
45	4.01 ± 0.19	4.464 ± 0.046	0.899 ± 0.053	0.4
60	74.09 ± 0.96	10.35 ± 0.23	7.18 ± 0.26	3.2
70	71.6 ± 2.1	11.730 ± 0.069	6.11 ± 0.18	2.8

 

Наибольшее количество белка (10–11 мг/мл) и наибольшее значение активности фермента (6–7 мкмоль/мин∙мг) наблюдалось во фракциях, полученных при 60 и 70%-ном насыщении сульфатом аммония. Известно, что молекулярная масса фитаз вариабельна и находится в пределах 38–100 кДа, при этом высокая молекулярная масса, связанная с гликозилированием этих ферментов, наблюдается у грибных и дрожжевых фитаз [21]. Для получения ферментного препарата грубой очистки, содержащего фитазу S. hatchlandensis ФГ 3.9.1, фракционирование сульфатом аммония может производиться в две ступени: удаление балластных белков при 45%-ном насыщении сульфатом аммония и последующее высаливание фитазы при 70%-ном насыщении солью.

Кинетические параметры ферментативной реакции, катализируемой иммобилизованной и нативной фитазой, операционная стабильность иммобилизованных биокатализаторов. Частично очищенная фитаза была иммобилизована включением в структуру геля альгината бария и ковалентной сшивкой с гранулами хитозана, активированными 0.1%-ным глутаровым альдегидом. Определено, что при иммобилизации сохранялось 97 и 95% активности нативного белка соответственно. На основании графика Лайнуивера-Берка определили V_max и К_M нативной и иммобилизованной фитазы. Показано, что К_M фитазы, включенной в гель альгината бария и связанной с активированным хитозаном, снижалась в 1.1 и в 1.7 раза соответственно, что может свидетельствовать о большем сродстве иммобилизованного фермента к фитату натрия, используемому в качестве субстрата (табл. 2).

Установлено, что при многоцикловом проведении реакции активность иммобилизованных ферментов постепенно снижалась, однако на протяжении 6 циклов сохранялось 70% активности, зафиксированной в первом цикле (рис. 1).

 

Таблица 2. Каталитические свойства свободной и иммобилизованной фитазы

Фитаза	KM, ммоль/л	Vmax, мкмоль/(мг·мин)
В растворе	2.2	7.1
Иммобилизованная в альгинате	1.9	5.8
Иммобилизованная на хитозане	1.3	5.5

 

Рис. 1. Операционная стабильность фитазы, иммобилизованной включением в структуру геля альгината бария (1) и ковалентным присоединением к активированному хитозану (2).

 

Зависимость фитазной активности от температуры и термоинактивация свободной и иммобилизованной фитазы. Зависимость активности фермента от температуры является результатом наложения двух факторов: ускорения движения молекул при повышении температуры и денатурации белка, которая происходит при воздействии высоких температур. Максимальная активность фитазы в растворе отмечалась при 40°С (рис. 2).

 

Рис. 2. Зависимость активности нативной фитазы (Е) от температуры.

 

Показано, что иммобилизованная фитаза обладала большей термостабильностью по сравнению с нативной формой фермента (рис. 3). Повышение термостабильности связано, по-видимому, с невозможностью диссоциации фермента на субъединицы при иммобилизации белковой молекулы.

 

Рис. 3. Термоинактивация фитазы при 50 (а), 60 (б) и 70°С (в): 1 — фитаза, иммобилизованная включением в гель альгината бария; 2 — фитаза, иммобилизованная на активированном хитозане; 3 — свободная фитаза.

 

Определены константы термоинактивации иммобилизованной фитазы и фермента в растворе (табл. 3). Иммобилизация фермента привела к уменьшению константы инактивации, следовательно, фитаза в растворе при повышении температуры характеризовалась более быстрой потерей активности в единицу времени.

 

Таблица 3. Термоинактивация свободной и иммобилизованной фитазы

Фитаза	Кин, мин–1
	50°С	60°С	70°С
В растворе	2.9 · 10–2	3.7 · 10–2	4.1 · 10–2
Иммобилизованная в альгинате	2.6 · 10–2	3.4 · 10–2	3.4 · 10–2
Иммобилизованная на хитозане	2.2 · 10–2	2.9 · 10–2	3.7 · 10–2

 

Зависимость активности свободной и иммобилизованной фитазы от рН. Показано, что рН-оптимумы нативного и иммобилизованного фермента соответствуют рН 5 (рис. 4). Однако удельная активность фермента, закрепленного на носителях, при рН, отличающемся от оптимума, была выше активности свободного фермента. При этом даже высокощелочная среда полностью не инактивировала фитазу.

 

Рис. 4. Зависимость активности фитазы, иммобилизованной в геле альгината бария (1), на активированном хитозане (2), и нативной (3) от рН.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск продуцентов промышленно значимых гидролаз, в том числе фитаз, перспективен среди экстремофильных и экстремотолерантных микроорганизмов [22]. Бактерии, обладающие фитазной активностью, выделяли с поверхности грунта антропогенно загрязненной территории содового шламохранилища с высокими рН и минерализацией, на которой более 50 лет назад прекращено складирование шлама производства соды (хлорида кальция) и на протяжении нескольких десятилетий восстанавливается растительность. Минерализация поверхности грунта достигала очень высоких значений, а рН приближался к 8 [23]. Штамм, который был выделен и идентифицирован как S. hatchlandensis ФГ 3.9.1, проявлял черты экстремотолерантности: рост энтеробактерий наблюдался при 5–50°С, при 5% NaCl и рН 9. Однако выделенный фермент проявлял максимальную активность при рН 5, так как являлся внутриклеточным. При этом устойчивость экстремотолерантного микроорганизма отражалась на каталитических свойствах фермента: так, было показано, что фитаза S. latchlandensis ФГ 3.9.1 обладала достаточно высокой термостабильностью и была способна гидролизовать фитат в широком диапазоне рН.

Перспективность используемых методов иммобилизации фитазы S. latchlandensis ФГ 3.9.1 оценивали по таким критериям, как сохранение ферментативной активности, термостабильность и возможность многократного использования. Метод ковалентной сшивки с хитозаном, активированным бензохиноном, был ранее использован для иммобилизации нитрилгидратазы. Было отмечено сохранение ферментативной активности при иммобилизации, высокая операционная стабильность и увеличение термостабильности фермента [24]. Для разработки биокатализатора, гидролизующего акриламид до акриловой кислоты, клетки актино- и протеобактерий были включены в гель альгината бария, и показано сохранение амидазной активности при многоцикловом использовании [25]. Данные методы с модификациями были использованы для иммобилизации фитаз. Свойства полученных биокатализаторов сравнили с известными ферментными препаратами на основе фитаз, иммобилизованными подобными методами (табл. 4).

 

Таблица 4. Сравнение каталитических свойств фитаз (опубликованные данные) и фитазы S. hatchlandensis ФГ 3.9.1, иммобилизованных на активированном хитозане и в альгинатном геле

Способ иммобилизации	Источник выделения	Фитаза							Сохранение активности, %	Ссылка
		Свободная			Иммобилизованная
		Тopt, °С	рНopt	KM, ммоль/л	Тopt, °С	рНopt	KM, ммоль/л	Vmax, мкмоль/мин
Включение в структуру альгинатного геля	S. latchlandensis ФГ 3.9.1	40	5.0	2.2	–	5.0	1.9	5.8	97	Данная статья
	Aspergillus oryzae SBS50	50	5.0	0.2	50	5.0	0.66	39.9	53	[26]
	Geobacillus sp. TF16	85	4.0	1.31	75	3.0	7.5	5011.12	>100	[17, 29]
Сшивка с активированными хитозановыми микросферами	S. latchlandensis ФГ 3.9.1	40	5.0	2.2	–	5.0	1.3	5.5	95	Данная статья
	Рисовые бобы (Vigna umbellata Thunb.)	40	4.0	0.2	40	4.0	0.62	3.42	77	[27]
	Geobacillus sp. TF16	85	4.0	1.31	95	5.0	2.38	3401.36	>100	[17, 29]

 

Показано, что максимальная скорость ферментативной реакции фитазы S. hatchlandensis ФГ 3.9.1 отличалась более низкими значениями по сравнению с фитазой Aspergillus oryzae [26] и фитазой термофила Geobacillus sp. TF16 [17], но превышала таковую фитазы рисовых бобов [27]. Константа Михаэлиса у фитазы S. hatchlandensis ФГ 3.9.1 в несколько раз превосходила этот показатель фитаз, каталитические свойства которых изучены в работах [26, 27]. У нативной, ковалентно сшитой с активированным хитозаном и иммобилизованной в геле альгината кальция фитазы Geobacillus sp. TF16 K_M составляла 1.31, 2.38 и 7.5 мМ соответственно, что указывает на снижение сродства фермента к субстрату при иммобилизации [17]. В большинстве изученных случаев K_M иммобилизованной фитазы возрастала [13]. При иммобилизации фитазы S. hatchlandensis ФГ 3.9.1, наоборот, было показано снижение K_M и высокая доля сохранения активности фермента (95–97%). При этом рН оптимум активности фитазы S. hatchlandensis ФГ 3.9.1 указывает на более эффективный катализ в кислой среде, как и в работах [17, 26, 27].

Операционная стабильность иммобилизованных в альгинате и на поверхности активированных хитозановых гранул фитаз S. hatchlandensis ФГ 3.9.1 была достаточно высока по сравнению с таковой известных иммобилизованных на таких носителях биокатализаторов. Так, к 6 циклу гидролиза фитата сохранялось 70% ферментативной активности от проявляемой в первом цикле и тенденции к резкому снижению активности не наблюдалось. Напротив, иммобилизованная в альгинате и хитозане фитаза E. coli и S. aureus сохраняла после 5 цикла гидролиза фитата лишь 38 и 43% активности соответственно [28], а фитаза Aspergillus oryzae SBS50 в альгинате кальция — более 50% после 5 циклов [26], фитаза рисовых бобов, иммобилизованная на активированном глутаровом альдегидом хитозане — 58% после 4 циклов [27].

* * *

Таким образом, в данной работе было показано влияние двух методов иммобилизации фитазы на кинетические параметры реакции гидролиза фитата натрия, операционную стабильность и термостабильность фермента. Иммобилизация методом ковалентной сшивки с активированным хитозаном и включением фермента в структуру альгинатного геля способствовали уменьшению величины K_M, что указывало на увеличение сродства фермента к субстрату. Оба метода иммобилизации незначительно снижали V_max с сохранением 95–97% удельной активности нативного фермента, в то же время термоинактивация закрепленного на носителях фермента происходила медленнее (K_ин иммобилизованного фермента при 70°С снижалась в 1.1–1.2 раза). При воздействии 70°С в течение 1 ч не происходило полного ингибирования ни свободного, ни иммобилизованного фермента. Иммобилизация не приводила к изменению рН-оптимума действия фермента, но позволила увеличить его удельную активность, особенно при рН, отличающихся от оптимума. Кроме того, иммобилизованные ферменты обладали значительной операционной стабильностью, что обеспечивает возможность многократного использования биокатализаторов с сохранением активности.

Иммобилизованная фитаза, выделенная из S. hatchlandensis ФГ 3.9.1, может быть использована в качестве добавки в корма сельскохозяйственных животных. Кроме того, иммобилизованный препарат этого фермента может быть внесен при компостировании органических отходов с целью увеличения концентрации доступного фосфора, что улучшит качество полученного удобрения.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследование выполнено и в рамках государственного задания, номер госрегистрации темы — 124020500028-4, и частично при финансовой поддержке Правительства Пермского края в рамках научного проекта № С-26/507.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ

Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.

About the authors

K. G. Semenova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russia Academy of Sciences, Perm Federal Research Center; Perm National Research Polytechnic University

Author for correspondence.
Email: yul_max@mail.ru
Russian Federation, Perm, 614081; Perm, 614990

Y. G. Maksimova

Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch of the Russia Academy of Sciences, Perm Federal Research Center; Perm State National Research University

Email: yul_max@mail.ru
Russian Federation, Perm, 614081; Perm, 614068

References

Supplementary files