Rhodococcus erythropolis A-27 as a Biocatalyst for Enantioselective Reduction of Ketones in the Presence of High Concentrations of Isopropanol

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

It has been shown that in the presence of the cells of five strains of Rhodococcus erythropolis, isolated from various anthropogenically polluted ecosystems, and an exogenous reducing agent (isopropanol), enantioselective reduction of ketones (acetophenone and 6-methyl-5-hepten-2-one) occurs with the formation of the corresponding S-configuration alcohols with high enantiomeric excess. Using the most active strain of R. erythropolis A-27 at the optimal concentration of isopropanol, products (S-1-phenylethanol and S-6-methyl-5-hepten-2-ol) were obtained with an enantiomeric excess of at least 99.9 % and a yield of 92 and 93% respectively. This strain was found to be tolerant to isopropanol and could effectively reduce 6-methyl-5-hepten-2-one to S-6-methyl-5-hepten-2-ol in a buffer containing 50% isopropanol.

Full Text

Энантиоселективное восстановление кетонов с помощью биокатализаторов — перспективный подход для получения энантиомерно чистых вторичных спиртов, использующихся в качестве предшественников в синтезе различных биологически активных веществ (лекарственных соединений, средств защиты растений и др.) [1–8].

В литературе представлено много примеров применения энантиоселективных алкогольдегидрогеназ (КФ 1.1.1.x., также называемых кеторедуктазами или карбонилредуктазами), выделенных из клеток различных микроорганизмов, для восстановления кетонов с целью формирования хирального центра заданной пространственной конфигурации в молекуле вторичного спирта [1–8]. Однако имеются проблемы, ограничивающие успешную реализацию таких процессов в промышленных масштабах. Одна из них связана с необходимостью использования в качестве восстановителя НАДН или НАДФН в количествах, сопоставимых с субстратом, что значительно увеличивает стоимость продукта [1, 2, 4–8]. Другая проблема обусловлена плохой растворимостью гидрофобных субстратов в водных средах, что существенно ограничивает скорость реакции [3, 9].

Для снижения затрат в процессах получения энантиомерно чистых вторичных спиртов биовосстановлением кетонов целесообразно использовать в качестве биокатализатора клетки микроорганизмов, содержащие внутриклеточные энантиоселективные дегидрогеназы/карбонилредуктазы, а также ферменты, катализирующие регенерацию НАДН или НАДФН за счет окисления экзогенного восстановителя (глюкозы, изопропанола, формиата и др.) [1, 2, 4–7]. Для увеличения растворимости кетонов в водных растворах могут быть использованы гомогенизаторы — смешиваемые с водой со-растворители (органические и глубокие эвтектические растворители, ионные жидкости) [3, 9].

К наиболее доступным со-растворителям относится изопропанол, который в реакциях восстановления кетонов может не только увеличивать растворимость субстрата, но и выполнять роль экзогенного восстановителя [8, 10, 11]. Кроме того, изопропанол может улучшать проницаемость клеток, облегчая транспортировку субстрата и продукта реакции через клеточную мембрану [11].

Для разработки эффективных процессов восстановления кетонов в присутствии изопропанола необходимы клеточные биокатализаторы, которые могут работать при высоких концентрациях этого спирта. Однако многие известные биокатализаторы быстро теряют карбонилредуктазную активность уже в присутствии 20% изопропанола [10, 12]. В связи с этим проводится поиск новых клеточных биокатализаторов, устойчивых к органическим растворителям, включая изопропанол [13–18].

Большой интерес представляют клетки актинобактерий рода Rhodococcus, которые отличаются повышенной толерантностью к различным органическим растворителям [14] и широко применяются в синтезе биологически активных веществ благодаря наличию у них различных регио- и энантиоселективных ферментов (дегидрогеназ, монооксигеназ, эпоксидгидролаз, дегалогеназ, нитрилаз, амидаз и др.) [19–22].

На базе штаммов Rhodococcus opacus B-4 и R. rhodochrous NBRC15564, клеточная поверхность которых характеризуется высокой липофильностью, разработаны биокатализаторы, содержащие энантиоселективные ферменты других микроорганизмов (карбонилредуктазу OCR дрожжей Ogataea minuta и термофильные алкогольдегидрогеназы бактерии Thermus thermophilus HB27), способные восстанавливать кетоны в чистых полярных растворителях (циклогексаноле, изобутаноле и изопропаноле) [23, 24].

Энантиоселективные дегидрогеназы/карбонилредуктазы найдены в клетках некоторых штаммов родококков (R. ruber DSM 44541, R. erythropolis WZ010, R. pyridinivorans, R. jostii TMP1, R. kyotonensis) [25–30]. Один из ферментов (АДГ-А из R. ruber DSM 44541) проявляет высокую толерантность по отношению к органическим растворителям и может катализировать реакцию в присутствии 50% изопропанола [25, 26].

Следует отметить, что не все штаммы родококков, обладающие высокоселективными дегидрогеназами/редуктазами, пригодны для использования в качестве клеточных катализаторов в процессах энантиоселективного восстановления кетонов. В ряде случаев с помощью таких биокатализаторов получаются продукты с низким энантиомерным избытком, как полагают, из-за присутствия в клетках сопутствующих дегидрогеназ с противоположным энантионаправленным каталитическим действием [31]. Энантиоселективное восстановление кетонов в присутствии высоких концентраций изопропанола осуществлено с помощью клеток R. ruber DSM 44541 — продуцента высокотолерантной алкогольдегидрогеназы [32–34]. В присутствии 22% изопропанола этот клеточный биокатализатор восстанавливает широкий спектр кетонов в спирты S-конфигурации высокой энантиомерной чистоты (более 99%) [32, 33]. Биокатализатор проявляет активность даже при 50%-ной концентрации изопропанола и восстанавливает ряд кетонов (6-метил-5-гептен-2-он, октанон-2) [32, 34]. Ранее было показано [17], что клетки R. erythropolis ВКМ Ас-1161 способны энантиоселективно восстанавливать 6-метил-5-гептен-2-он и п-хлорацетофенон в буфере, содержащем 20% изопропанола. С помощью клеток этих актинобактерий получены S-6-метил-5-гептен-2-ол (99.9% ее) и S-1-(4-хлорфенил)этанол (96.4% ее) с выходом 93.8% и 84% соответственно.

Цель настоящей работы — продолжение поиска новых штаммов родококков, перспективных для разработки высокоселективных клеточных биокатализаторов, способных катализировать восстановление кетонов в энантиомерно чистые спирты в присутствии высоких концентраций изопропанола.

МЕТОДИКА

Объекты исследования. В работе использовали 5 штаммов бактерий (А7-1, А4-72, А15-23, А18-19 и А-27) из коллекции микроорганизмов кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета. Штаммы были выделены из различных антропогенных экосистем Республики Башкортостан (почва и сточные воды предприятий нефтехимии и нефтепереработки) как деструкторы фенола, гексадекана, нефти, эпихлоргидрина или дихлоргидрина глицерина. Все исследуемые штаммы — грамположительные аэробы, некислотоустойчивые, неспорообразующие, неподвижные. Клетки палочковидные, слабо ветвящиеся. Характерен трехстадийный морфогенетический цикл развития (кокки–палочки–кокки). На питательном агаре образуют непрозрачные круглые колонии бледно-розового или оранжевого цвета без воздушного мицелия.

Условия культивирования. Микроорганизмы выращивали при температуре 30 ± 1°C на агаризованной питательной среде, следующего состава (г/л): гидролизат рыбной муки — 25, глюкоза– 10, дрожжевой экстракт — 5, агар-агар микробиологический — 15.

Идентификация микроорганизмов. Для определения видовой принадлежности штаммов были проведены амплификация, секвенирование и филогенетический анализ гена 16S рРНК. Геномную ДНК выделяли согласно методике, описанной в работе [35]. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили с использованием бактериальных праймеров 27F (5'-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3') и 1492R (5'-АСGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3') на амплификаторе C1000 TouchTM Thermal Cycler (“Bio-Rad Laboratories”, США). Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК осуществляли на секвенаторе Genetic Analyser 3500XL (“Applied Biosystems”, США) с использованием набора реактивов Big Dye Terminator Cycles equencing Kit v 3.1 (“Applied Biosystems”, США), согласно рекомендациям производителя. Филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК осуществляли с использованием программ Sequence Scanner v1.0 и MEGA 7.0 (http://www.megasoftware.net). Поиск гомологичных последовательностей осуществляли при использовании баз данных GenBank (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzBioCloud (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon). Филогенетическое дерево строили с помощью программы MEGA7 c использованием метода “neighborjoining”.

Восстановление кетонов. Для восстановления кетонов использовали биомассу трехсуточной культуры микроорганизмов, собранную с поверхности агаризованной среды. Тестирование способности клеток исследуемых микроорганизмов осуществлять восстановление кетонов проводили при 30 ± 1°С в 0.1 М фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5% изопропанола, 5 г/л субстрата и 200 г/л сырой биомассы. В экспериментах по изучению влияния концентрации изопропанола на восстановление кетонов содержание спирта в буфере варьировали от 0 до 50%.

Анализ субстратов и продуктов восстановления кетонов. Для текущего контроля реакции отбирали пробы реакционной смеси. Полученные пробы центрифугировали при 10000 об./мин в течение 3 мин на центрифуге СМ-50 (“ELMI”, Латвия), дважды экстрагировали этилацетатом. Объединенный экстракт осушали безводным сульфатом магния. Концентрацию субстрата и продукта в пробах определяли на хроматографе “Хроматек Кристалл 5000.2” (ЗАО “СКБ Хроматек”, Россия) с пламенно-ионизационным детектором на хиральной капиллярной колонке Supelco BetaDEX 110 (30 м × 0.25 мм × 0.25 мкм). Режим анализа: температура испарителя — 220°С, температура детектора — 220°С, температура колонки — 60–220°С, скорость нагрева — 5°С/мин, давление газа-носителя — 100 кПа, расход водорода — 25 мл/мин, расход воздуха — 250 мл/мин, газ-носитель — гелий.

Для выделения продуктов реакции реакционную массу центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин на центрифуге MPW-351 (“MPW Med. Instruments”, Польша). Продукты трансформации высаливали NaCl и троекратно экстрагировали равным объемом диэтилового эфира. Экстракт осушали безводным сульфатом магния, концентрировали на ротационном испарителе RV 10 digital (“IKA”, Германия) и фракционировали на хроматографической колонке с силикагелем Merk 60 (0.063–0.2 мм), элюент — гексан:этилацетат (8 : 1).

Конфигурацию продуктов определяли поляриметрически на поляриметре PerkinElmer-141-МС (“PerkinElmer”, США). Спектры ЯМР регистрировали на спектрометре “BRUKER AM-300” (“BRUKER BIOSPIN”, Германия) в растворах CDCl3 (рабочая частота 500.13 МГц для 1Н и 126.76 МГц для 13С). За внутренний стандарт принимали значение сигналов хлороформа: в ЯМР 1Н — примесь протонов в дейтерированном растворителе (δ 7.27 м.д.), в ЯМР 13С — средний сигнал CDCl3 (δ 77.00 м.д.). Спектральные характеристики S-1-фенилэтанола и S-6-метил-5-гептен-2-ола совпадают с литературными данными [36, 37].

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в трех повторностях. Полученные данные обрабатывали с использованием компьютерной программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация исследуемых штаммов. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК исследуемых штаммов показал 100%-ное сходство с Rhodococcus qingshengii JCM 15477T. Филогенетическое положение штаммов, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, представлено на рис. 1. В соответствии с современной номенклатурой прокариот R. qingshengii является более поздним синонимом R. erythropolis (https://lpsn.dsmz.de/species/rhodococcus-qingshengii), поэтому исследуемые штаммы были отнесены к виду R. erythropolis.

 

Рис. 1. Положение исследуемых штаммов рода Rhodococcus на филогенетическом дереве, построенном на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК с использованием метода “neighbor-joining”. Масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 1000 альтернативных деревьев.

 

Исследование способности микроорганизмов энантиоселективно восстанавливать кетоны в присутствии 5% изопропанола. Для выявления возможности применения клеток исследуемых штаммов R. erythropolis в качестве биокатализаторов энантиоселективного восстановления кетонов исследовали трансформацию ацетофенона (1) и 6-метил-5-гептен-2-она (2) в присутствии низкой (5%-ной) концентрации спирта (табл. 1). В качестве контроля использовали реакционную смесь без микроорганизмов.

 

Таблица 1. Выход (Р, %) и энантиомерный избыток (ее, %) продуктов восстановления 6-метил-5-гептен-2-она и ацетофенона с помощью штаммов R. erythropolis в буфере, содержащем 5% изопропанола, в течение 2 ч

Субстрат

Штамм

Продукт

Р, %

ее, %

ацетофенон (1)

А-27

S-1-фенилэтанол (3)

79 ± 3.2

99.1 ± 0.1

А18-19

65 ± 2.7

99.3 ± 0.1

А4-72

64 ± 2.4

99.2 ± 0.1

А7-1

51 ± 2

98.4 ± 0.3

А15-23

64 ± 2.4

98.7 ± 0.2

6-метил-5-гептен-2-он (2)

А-27

S-6-метил-5-гептен-2-ол (4)

93 ± 2.5

99.9 ± 0.1

А18-19

96 ± 2.3

99.9 ± 0.1

А4-72

93 ± 2

99.9 ± 0.1

А7-1

93 ± 2.4

99.9 ± 0.1

А15-23

86 ± 2.1

69.0 ± 0.5

 

В результате исследования было обнаружено, что все штаммы энантиоселективно восстанавливают оба субстрата (1, 2) в спирты S-конфигурации: S-1-фенилэтанол (3) и S-6-метил-5-гептен-2-ол (4) соответственно (табл. 1). Наиболее высокий выход продукта (около 86–96%) был достигнут в реакции восстановления 6-метил-5-гептен-2-она (2). При использовании в качестве субстрата ацетофенона (1) выход продукта составил 51–79%. В контрольном варианте без микроорганизмов реакция восстановления кетонов не протекала.

Исследование энантиомерного состава продуктов трансформации показало, что три штамма R. erythropolis (А-27, А18-19 и А4-72) позволяют получать S-1-фенилэтанол и S-6-метил-5-гептен-2-ол высокой энантиомерной чистоты (не менее 99.9% ее, табл. 1). В случае штамма R. erythropolis А7-1 продукт с энантиомерным избытком 99.9% был получен только в реакции восстановления 6-метил-5-гептен-2-она (2). При восстановлении ацетофенона (1) с помощью этого штамма, также как и штамма R. erythropolis А15-23, был получен S-1-фенилэтанол более низкой энантиомерной чистоты (98.4 и 98.7% ее соответственно). Наименее селективно протекала реакция восстановления алкенкетона (2) с помощью штамма R. erythropolis А15-23, приводящая к S-6-метил-5-гептен-2-олу с низким энантиомерным избытком (69% ее).

Влияние начальной концентрации изопропанола на восстановление кетонов. С целью выявления оптимальной концентрации со-растворителя и оценки устойчивости к нему клеточных биокатализаторов далее было исследовано влияние изопропанола на начальную скорость реакции, выход и энантиомерную чистоту продуктов.

При исследовании влияния концентрации изопропанола на начальную скорость восстановления кетонов (1 и 2) с помощью клеток штаммов R. erythropolis установлено, что в отсутствие спирта обе реакции протекают медленно (рис. 2). Внесение спирта в оптимальных концентрациях существенно ускоряло процессы восстановления кетонов, что подтверждало роль изопропанола как экзогенного восстановителя.

 

Рис. 2. Зависимость начальной скорости (г/л‧ч) восстановления ацетофенона (а) и 6-метил-5-гептен-2-она (б) от концентрации изопропанола (%) в присутствии клеток штаммов R. erythropolis: 1 — А-27; 2 — А18-19; 3 — А4-72; 4 — А7-1; 5 — А15-23.

 

Оптимальные значения концентрации изопропанола в реакционной смеси варьировали в зависимости от используемого субстрата и штамма (рис. 2). Так, трансформация ацетофенона в S-1-фенилэтанол в присутствии клеток большинства исследуемых штаммов наиболее быстро протекала в буфере, содержащем 5%-ный изопропанол (рис. 2а), тогда как в случае использования R. erythropolis А-27 оптимальная концентрация спирта была 7.5%. При восстановлении 6-метил-5-гептен-2-она с помощью большинства штаммов, наибольшая скорость реакции достигалась при 10%-ном содержании изопропанола в буфере, а в случае R. erythropolis А18-19 — при 20%-ной концентрации спирта (рис. 2б).

Дальнейшее увеличение концентрации изопропанола до 20% приводило к значительному снижению скорости восстановления ацетофенона независимо от используемого штамма, а при 30–40% спирта реакция не протекала (рис. 2а).

В тоже время восстановление 6-метил-5-гептен-2-она с помощью исследуемых штаммов, хотя и медленнее, чем в оптимальных условиях, происходило в присутствии 40% изопропанола, а в случае наиболее активного штамма R. erythropolis А-27 осуществлялось даже в 50%-ном изопропаноле с высокой скоростью (рис. 2б).

При исследовании выхода продуктов, полученных при двухчасовой продолжительности реакции восстановления 6-метил-5-гептен-2-она, было установлено, что он достигал максимального значения не только при оптимальной концентрации изопропанола, обеспечивающей наибольшую начальную скорость реакции, но и при большем содержании спирта (рис. 3а). В случае штаммов R. erythropolis А18-19, А7-1 и А15-23 концентрация изопропанола может быть увеличена до 20%, а при использовании R. erythropolis А4-72 и А-27 — до 40 и 50% соответственно. Анализ энантиомерного состава полученных продуктов показал, что в отсутствии изопропанола большинство штаммов, за исключением R. erythropolis А18-19, восстанавливали кетон (2) с низкой энантиоселективностью. Увеличение концентрации изопропанола приводило к улучшению энантиомерного состава S-6-метил-5-гептен-2-ола (рис. 3б). Даже с наименее селективным штаммом R. erythropolis А15-23 в присутствии 40–50% изопропанола образовывался продукт с энантиомерным избытком 99.9%.

 

Рис. 3. Зависимость выхода (а, Р, %) и энантиомерного избытка S-6-метил-5-гептен-2-ола (б) от начальной концентрации изопропанола (%) в процессе восстановления 6-метил-5-гептен-2-она с помощью клеток штаммов R. erythropolis: 1 — А-27; 2 — А18-19; 3 — А4-72; 4 — А7-1; 5 — А15-23.

 

При исследовании восстановления ацетофенона было обнаружено, что наибольший выход S-1-фенилэтанола (при 4-х часовой продолжительности реакции) в присутствии клеток большинства штаммов, за исключением R. erythropolis А-27, достигается только при оптимальной концентрации изопропанола (рис. 4а). В случае R. erythropolis А-27 высокий выход продукта был получен также при 10%-ной концентрации спирта. Установлено, что увеличение концентрации изопропанола при использовании штаммов R. erythropolis А-27 и А18-19 не оказывало существенного влияния на энантиомерную чистоту S-1-фенилэтанола, но снижало ее при использовании штамма R. erythropolis А4-72 и увеличивало при использовании штаммов R. erythropolis А7-1 и А15-23 (рис. 4б).

 

Рис. 4. Зависимость выхода (а, Р, %) и энантиомерного избытка (б, ее, %) S-1-фенилэтанола от начальной концентрации изопропанола (%) при восстановлении ацетофенона с помощью клеток штаммов R. erythropolis: 1 — А-27; 2 — А18-19; 3 — А4-72; 4 — А7-1; 5 — А15-23.

 

Динамика восстановления кетонов при оптимальной концентрации изопропанола. Исследование динамики восстановления ацетофенона при оптимальной концентрации изопропанола показало, что после 2 ч трансформации скорость реакции существенно снижалась, что ограничивало выход продукта на уровне 68–92% (рис. 5а). Такое замедление реакции биовосстановления кетонов в присутствии изопропанола может быть связано с накоплением продукта окисления этого спирта (ацетона) в реакционной смеси [15, 38, 39]. Наиболее высокий выход ∼ 92% S-1-фенилэтанола в исследуемых условиях был получен с помощью штамма R erythropolis А-27. Для достижения более высокого выхода целевого продукта необходимо удалять ацетон in situ [15, 38, 39].

 

Рис. 5. Динамика выхода продуктов реакции (Р, %) в процессе восстановления ацетофенона (а) и 6-метил-5-гептен-2-она (б) с помощью клеток штаммов R. erythropolis при оптимальных начальных концентрациях изопропанола: 1 — А-27; 2 — А18-19; 3 — А4-72; 4 — А7-1; 5 — А15-23.

 

Аналогичные результаты были получены при восстановлении 6-метил-5-гептен-2-она (рис. 5б). Однако в отличие от ацетофенона, большинство штаммов восстанавливало кетон (2) с выходом продукта близким к 93–94%. Только при использовании штамма R. erythropolis А15-23 выход продукта оставался на уровне 86%. Следует отметить, что время реакции, необходимое для достижения максимального выхода продукта (4), может быть сокращено до 0.5–1 ч при использовании наиболее активных штаммов R. erythropolis А-27, А18-19 и А4-72.

В результате текущего контроля энантиомерного состава продуктов (3 и 4), образующихся при восстановлении кетонов (1, 2), было обнаружено, что использование наименее активного штамма R. erythropolis А15-23 энантиомерный избыток продуктов в начале реакции увеличивался (табл. 2), но останавливался на уровне около 85% для S-6-метил-5-гептен-2-ола и 98.5% для S-1-фенилэтанола.

При использовании в качестве биокатализатора клеток R. erythropolis А7-1 было обнаружено, что только при восстановлении 6-метил-5-гептен-2-она в ходе реакции образуется высокочистый S-6-метил-5-гептен-2-ол (табл. 2). В случае ацетофенона энантиомерный избыток S-1-фенилэтанола снижался с 99.3 до 96.2% с увеличением продолжительности реакции от 1 до 4 ч. Подобное снижение энантиомерного избытка S-1-фенилэтанола в ходе реакции наблюдалось у ряда штаммов R. erythropolis, как полагают, из-за присутствия в клетках альтернативного фермента, катализирующего восстановление субстрата преимущественно в R-1-фенилэтанол [17, 31].

 

Таблица 2. Изменение энантиомерного избытка (ее, %) продуктов (3, 4) в процессе восстановления ацетофенона и 6-метил-5-гептен-2-она с помощью штаммов R. erythropolis при оптимальных концентрациях изопропанола

Штамм

S-1-фенилэтанол (3)

S-6-метил-5-гептен-2-ол (4)

1 ч

2 ч

4 ч

0.25 ч

0.5 ч

2 ч

4 ч

А-27

99.4 ± 0.1

99.1 ± 0.1

99.2 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

А18-19

99.3 ± 0.1

99.3 ± 0.1

99.5 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

А4-72

99.3 ± 0.1

99.2 ± 0.1

99.0 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

А7-1

99.3 ± 0.1

98.7 ± 0.1

96.2 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

99.9 ± 0.1

А15-23

97.2 ± 0.2

98.2 ± 0.2

98.5 ± 0.2

73.4 ± 0.5

83.4 ± 0.5

85.6 ± 0.5

84.6 ± 0.5

 

В то же время было установлено, что в случае трех штаммов R. erythropolis (А-27, А18-19 и А4-72) в ходе реакции образуются спирты исключительно высокой энантиомерной чистоты (не менее 99% ее, табл. 2).

Таким образом, полученные результаты показали, что штаммы R. erythropolis, выделенные из различных антропогенно загрязненных экосистем, отличались друг от друга своим биокаталитическим потенциалом в процессах энантиоселективного восстановления кетонов. Это соответствует имеющимся представлениям о внутривидовом полиморфизме родококков, формирующемся в результате развития штаммов в различных экосистемах [40].

Наиболее перспективным для применения в процессах энантиоселективного восстановления кетонов является штамм R. erythropolis А-27, выделенный из почвы, загрязненной нефтепродуктами, который показал наибольшую активность и высокую энантиоселективность в процессах восстановления обоих субстратов (1, 2).

Отличительная особенность R. erythropolis А-27 как биокатализатора процессов энантиоселективного восстановления кетонов, протекающих в присутствии изопропанола, — более высокая устойчивость к высоким концентрациям спирта по сравнению с другими штаммами данного вида, представленными в настоящей работе, а также описанными в литературе [17, 41, 42]. Подобно известному наиболее устойчивому штамму R. ruber DSM 44541, нашедшему широкое применение в асимметрическом синтезе различных вторичных спиртов [3, 32–34], клетки штамма R. erythropolis А-27 способны восстанавливать 6-метил-5-гептен-2-он в энантиомерно чистый S-6-метил-5-гептен-2-ол даже в 50%-ном изопропаноле. Как показано для штамма R. ruber DSM 44541, в этих условиях процесс может протекать с высокой скоростью при очень высокой концентрации плохо растворимого в воде субстрата (95.2 г/л 6-метил-5-гептен-2-она) [34]. Это делает перспективным дальнейшее исследование свойств найденного биокатализатора с целью разработки на его основе эффективных методов получения практически важных гидрофобных спиртов, в том числе S-1-фенилэтанола — предшественника в синтезе ряда лекарственных соединений [43–45], и S-6-метил-5-гептен-2-ола, на базе которого могут быть синтезированы экологически безопасные инсектициды [36, 46, 47].

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм

В настоящей статье не использовались в качестве объектов люди или животные.

×

About the authors

N. I. Petukhova

Ufa State Petroleum Technological University

Author for correspondence.
Email: biocatNP@yandex.ru
Russian Federation, Ufa, 450062

A. V. Mityagina

Ufa State Petroleum Technological University

Email: a_mityagina@mail.ru
Russian Federation, Ufa, 450062

V. V. Zorin

Ufa State Petroleum Technological University

Email: biocatNP@yandex.ru
Russian Federation, Ufa, 450062

References

  1. Goldberg K., Schroer K., Lütz S., Liese A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. V. 76. P. 249–255.
  2. Patel R.N. // Coord. Chem. Rev. 2008. V. 252. P. 659−701.
  3. Musa M.M., Phillips R.S. // Catal. Sci. Technol. 2011. V. 1. P. 1311–1323.
  4. Milner S.E., Maguire A.R. // ARKIVOC. 2012. P. 321–382. http://dx.doi.org/10.3998/ark.5550190.0013.109
  5. Kratzer R., Woodley J.M., Nidetzky B. // Biotechnology Advances. 2015. V. 33. P. 1641–1652.
  6. de Carvalho C.C.C.R. // Microb. Biotechnol. 2017. V. 10. № 2. P. 250−263.
  7. Hollmann F., Opperman D.J., Paul C.E. // Angew. Chem. Int. Ed. 2021. V. 60. P. 5644–5665.
  8. Simić S., Zukić E., Schmermund L., Faber K., Winkler Ch.K., Kroutil W. // Chem. Rev. 2022. V. 122. P. 1052−1126.
  9. Aranda C., de Gonzalo G. // Molecules. 2020. V. 25(13). Article 3016. https://doi.org/10.3390/molecules25133016
  10. Sorgedrager M.J., van Rantwijk F., Huisman G.W., Sheldon R.A. // Adv. Synth. Catal. 2008. V. 350. P. 2322–2328.
  11. Jia Q., Zheng Yu.-C., Li H.-P., Qian X.-L., Zhang Zhi.-J., Xu J.-H. // Appl. Environ. Microbiol. 2022. V. 88. № 9. P. 1–16.
  12. Itoh N., Isotani K., Nakamura M., Inoue K., Isogai Y., Makino Y. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. № 93. P. 1075–1085.
  13. Шакиров А.Н., Петухова Н.И., Зорин В.В. // Башкирский химический журнал. 2013. Т. 20. № 4. С. 59–63.
  14. Коршунова И.О., Писцова О.Н., Куюкина М.С., Ившина И.Б. // Прикл. биохимия и микробиология. 2016. Т. 52. № 1. С. 53–61.
  15. Yang Z., Fu H., Ye W., Xie Y., Liu Q., Wang H., Wei D. // Catal. Sci. Technol. 2020. № 10. Р. 70–78.
  16. Митягина А.В., Петухова Н.И., Прищепов Ф.А., Зорин В.В. // Башкирский химический журнал. 2021. Т. 28. № 3. С. 41–46.
  17. Митягина А.В., Рахманов Т.Р., Петухова Н.И., Зорин В.В. // Башкирский химический журнал. 2022. Т. 29. № 1. С. 29–36.
  18. Xu S., Lin Q., Chen W., Lin R., Shen Y., Tang P. et al. // Catalysts. 2023. V. 13(1). Article 52. https://doi.org/10.3390/catal13010052
  19. Kim D., Choi K.Y., Yoo M., Zylstra G.J., Kim E. // J. Microbiol. Biotechnol. 2018. V. 28. P. 1037–1051.
  20. Busch H., Hagedoorn P.-L., Hanefeld U. // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. Article 4787. https://doi.org/10.3390/ijms20194787
  21. Qin L., Wu L., Niе Y., Xu Y. // Catal. Sci. Technol. 2021. V. 11. P. 2637–2651.
  22. Ivshina I., Bazhutin G., Tyumina E. // Front. Microbiol. 2022. V. 13. Article 967127. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.967127
  23. Hibino A., Ohtake H. // Process Biochemistry. 2013. V. 48. P. 838–843.
  24. Honda K., Ono T., Okano K., Miyake R., Dekishima Y., Kawabata H. // J. Biosci. Bioeng. 2019. V. 127. № 2. P. 145–149.
  25. Kosjek B., Stampfer W., Pogorevc M., Goessler W., Faber K., Kroutil W. // Biotechnol. Bioeng. 2004. V. 86. P. 55–62.
  26. de Gonzalo G., Lavandera I., Faber K., Kroutil W. // Org. Lett. 2007. V. 9. № 11. P. 2163–2166.
  27. Yang C., Ying X., Yu M., Zhang Y., Xiong B., Song Q., Wang Z. // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 2012. V. 39. P. 1431–1443.
  28. Stankeviciute J., Kutanovas S., Rutkiene R., Tauraite D., Striela R., Meskys R. // Peer J. 2015. V. 3. Article e1387. https://doi.org/10.7717/peerj.1387
  29. Xu G.-Ch., Tang M.-H., Ye Ni // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 2016. V. 123. P. 67–72.
  30. Hu J., Li G., Liang C., Shams S., Zhu S., Zheng G. // Process Biochemistry. 2020. V. 92. P. 232–243.
  31. Hummel W., Abokitse K., Drauz K., Rollmann C., Gröger H. // Adv. Synth. Catal. 2003. V. 345. P. 153–159.
  32. Stampfer W., Kosjek B., Moitzi C., Kroutil W., Faber K. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2002. V. 41. P. 1014–1017.
  33. Stampfer W., Kosjek B., Faber K., Kroutil W. // J. Org. Chem. 2003. V. 68. P. 402–406.
  34. Stampfer W., Kosjek B., Kroutil W., Faber K. // Biotechnol. Вioeng. 2003. V. 81. № 7. P. 865–869.
  35. Short Protocols in Molecular Biology. 3rd Ed. / Eds. F.M. Ausbel, R. Brent , R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl N.Y.: John Wiley & Sons, 1995. 450 p.
  36. Ишмуратов Г.Ю., Газетдинов Р.Р., Выдрина В.А., Харисов Р.Я., Яковлев М.П., Муслухов Р.Р. и др. // Вестник Башкирского университета. 2012. Т. 17. № 4. С. 1691–1699.
  37. Шакиров А.Н., Петухова Н.И., Зорин В.В. // Башкирский химический журнал. 2013. Т. 20. № 4. С. 59–63.
  38. Schroer K., Tacha E., Lutz S. // Org. Process Res. Dev. 2007. V. 11. № 5. P. 836–841.
  39. Calvin S.J., Mangan D., Miskelly I., Moody T.S., Stevenson P.J. // Org. Process Res. Dev. 2012. V. 16. P. 82–86.
  40. Чернявская М.И., Букляревич А.А., Делеган Я.А., Охремчук А.Э., Филонов А.Е., Титок М.А. // Микробиология. 2018. Т. 87. № 5. С. 581–594.
  41. Yang C., Ying X., Yu M., Zhang Y., Xiong B., Song Q., Wang Z. //J. Ind. Microbiol. Biotech. 2012. V. 39. Р. 1431–1443.
  42. Chen H., Qian F., Lin H., Chen W., Wang P. // Catalysts. 2020. V. 10. Article 30. https://doi.org/10.3390/catal10010030
  43. Costa L.F.A., Lemos F., Ramôa Ribeiro F., Cabral J.M.S. // Catalysis Today. 2008. V. 133. P. 625–631.
  44. Vieira G., de Freitas Araujo D., Lemos T., de Mattos M., de Oliveira M., Melo V. et al. // J. Braz. Chem. Soc. 2010. V. 21. № 8. Р. 1509–1516.
  45. Шейко Е.А., Медникова Е.Э., Воробьева Т.Е., Чанышева А.Р. // Башкирский химический журнал. 2018. Т. 25. № 1. С. 55–58.
  46. Mori K., Puapoomchareon P. // Liebigs Ann. Chem. 1989. P. 1261–1262.
  47. Flechtmann C.A.H., Berisford C.W. // J. Appl. Ent. 2003. V. 127. P. 189–194.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. The position of the studied strains of the genus Rhodococcus on the phylogenetic tree based on a comparative analysis of the nucleotide sequences of 16S rRNA gene fragments using the “neighbor-joining" method. The scale corresponds to 5 nucleotide substitutions for every 1000 nucleotides. The figures show the statistical reliability of the branching order, determined using a "bootstrap" analysis of 1000 alternative trees.

Download (193KB)
Indexing metadata
3. 2. Dependence of the initial rate (g/l/h) of acetophenone (a) and 6-methyl-5-hepten-2-one (b) reduction on the concentration of isopropanol (%) in the presence of R. erythropolis strain cells: 1 — A-27; 2 —A18-19; 3 — A4-72; 4 — A7-1; 5 — A15-23.

Download (181KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Dependence of the yield (a, P, %) and the enantiomeric excess of S-6-methyl-5-hepten-2-ol (b) on the initial concentration of isopropanol (%) during the reduction of 6-methyl-5-hepten-2-one using R. erythropolis strain cells: 1 — A-27; 2 — A18-19; 3 — A4-72; 4 — A7-1; 5 — A15-23.

Download (181KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Dependence of the yield (a, P, %) and enantiomeric excess (b, e, %) of S-1-phenylethanol on the initial concentration of isopropanol (%) during the reduction of acetophenone using R. erythropolis strain cells: 1 — A-27; 2 — A18-19; 3 — A4-72; 4 — A7-1; 5 — A15-23.

Download (180KB)
Indexing metadata
6. 5. Dynamics of the yield of reaction products (P, %) during the reduction of acetophenone (a) and 6-methyl-5-hepten-2-one (b) using R. erythropolis strain cells at optimal initial concentrations of isopropanol: 1 — A-27; 2 — A18-19; 3 — A4-72; 4 — A7-1; 5 — A15-23.

Download (180KB)
Indexing metadata
7. 1

Download (14KB)
Indexing metadata
8. 2

Download (15KB)
Indexing metadata
9. 3

Download (14KB)
Indexing metadata
10. 4

Download (14KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».