Methods for pre-processing cane to obtain enzymative hydrolysates with high sugar content

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Methods of cane pretreatment (grinding, hydrothermal treatment, treatment with acid or alkali solutions, organosolv, deep eutectic solvents) and their effect on its subsequent enzymatic hydrolysis by cellulases and hemicellulases complexes have been studied. Substrates with the highest reactivity were obtained by exposing the cane to a weakly alkaline deep eutectic solvent (DES) and an alkali solution. The depth of enzymatic hydrolysis of these pretreated substrates was 63 and 59%, and the degree of conversion of polysaccharides (cellulose and hemicellulose) into monosaccharides taking into account the yield of the substrate at the pre-processing stage was 60 and 34%, respectively. After pre-treatment of the cane with acid DES, water steam, water or water/organic solution of sulfuric acid the depth of enzymatic hydrolysis was 45, 25, 20 and 11%, and the degree of polysaccharide conversion was 26, 18, 13 and 10%, respectively. The industrial enzyme preparation Agrocell Plus with a predominant content of cellobiohydrolases and endoglucanases was most effective in hydrolyzing the dust fraction of cane, as well as cane pretreated with a solution of sulfuric acid or DES (acidic or alkaline). The industrial enzyme preparation Agroxil Plus, containing endoxylanase and cellobiohydrolases, was more effective in hydrolyzing cane after hydrothermal pretreatment or alkali solution. The results of the hydrolysis of cane pretreated with acidic or weakly alkaline DES under the action of individual (homogeneous) cellulases indicate that in both cases the key enzyme was cellobiohydrolase 1.

Full Text

Возобновляемая растительная биомасса, основными компонентами которой являются целлюлоза, гемицеллюлозы и лигнин, составляет основную часть органического материала на Земле и является практически неисчерпаемым источником сырья и энергии [1]. Использование быстрорастущих травянистых растений как источника природных полисахаров, несомненно, имеет преимущество перед использованием древесины. Тростник обыкновенный – почти космополит, встречается в России повсеместно. Он распространен на почвах с близкими грунтовыми водами, на болотах, зарастающих озерах, пойменных лугах; особенно многочислен он в низовьях рек, где часто образует обширные заросли. Тростник относится к злакам, содержание лигнина от 18 до 26% в разных частях растения. Легкогидролизуемые полисахариды (преимущественно ксиланы) составляют 20–25%, трудногидролизуемые (целлюлоза) – до 37% [2]. Таким образом, тростник является источником С5 и С6 сахаров, которые могут быть конвертированы в коммерчески востребованные продукты (биоэтанол, этилен, бутены, этиленгликоль и другие соединения) [1, 3–5].

Ферментативный гидролиз растительной биомассы затруднен из-за ее низкой реакционной способности вследствие присутствия лигнина, который является физическим барьером, препятствующим воздействию ферментов на целлюлозу; кроме того, на лигнине происходит непродуктивная адсорбция ферментов. Для повышения реакционной способности необходима предварительная обработка субстрата, основными задачами которой являются удаление лигнина, разрушение кристаллической структуры целлюлозных волокон, увеличение поверхности субстрата, доступной для ферментов [6–10].

Существуют различные методы предобработки, основанные на использовании разных принципов воздействия на растительную биомассу: механические, физические, химические, физико-химические, биологические [11, 12]. Каждый из них имеет ряд положительных (повышение реакционной способности субстрата за счет увеличения доступной площади, удаления лигнина, гемицеллюлозы и пр.) и отрицательных факторов таких как высокая стоимость, необходимость переработки реагентов, образование вредных побочных продуктов и др.). Измельчение (как сухое, так и влажное) является весьма эффективным методом предварительной обработки многих видов растительного сырья. Кроме того, это один из наиболее экологически чистых видов предобработки [13–15]. Факторами, ограничивающими его применение, являются высокие энергозатраты, относительно низкая производительность и необходимость интенсивного теплоотвода, особенно при глубоком измельчении массы.

При гидротермической предобработке лигнин плавится под действием горячей воды с последующим образованием его микрочастиц (псевдолигнина) с понижением температуры, а также происходит частичный гидролиз гемицеллюлоз. Такой метод предобработки сохраняет целлюлозу в волокнистом состоянии, при этом увеличивается ее доступность для ферментов [16, 17]. Предобработка горячей водой является одним из наиболее перспективных методов, поскольку не требует использования химических веществ и является “зеленой” технологией.

Предварительная обработка щелочами приводит к удалению (солюбилизации) лигнина за счет разрыва химических связей между гемицеллюлозами и лигнином, к некоторому снижению степени полимеризации целлюлозы и набуханию ее волокон с увеличением объема пор и площади внутренней поверхности, что повышает ее реакционную способность при ферментативном гидролизе [18–22]. Этот метод является спорным с экологической точки зрения, так как приводит к необходимости утилизации и обеззараживания сточных вод, при этом используемые химикаты безвозвратно теряются в виде солей.

Широко распространена предобработка водными растворами кислот. Это приводит к разрушению лигноцеллюлозной матрицы за счет разрыва гликозидных связей, солюбилизации гемицеллюлоз и частично лигнина [23–26]. Предобработку можно проводить как с использованием концентрированных, так и разбавленных растворов кислот. Однако, использование концентрированных кислот менее предпочтительно, так как требует соблюдения более строгих мер безопасности, применения оборудования с повышенной коррозионной стойкостью, регенерацию кислот, а также приводит к более интенсивному образованию фурановых соединений – фурфурола из С5 сахаров и гидроксиметилфурфурола из С6 сахаров, способных к ингибированию микроорганизмов [27].

Предварительная органосольвная обработка направлена на сольватацию лигнина и гемицеллюлоз и проводится с использованием различных органических или водно-органических растворителей с добавлением катализаторов (или без них) при температуре 100–250°С [28–30]. Этанол получил широкое применение в качестве растворителя благодаря высокой эффективности предобработки растительной биомассы, а также простоте регенерации путем дистилляции. В качестве катализатора используют различные кислоты, чаще всего серную, соляную или уксусную. Органосольвная предобработка приводит к весьма значительному увеличению реакционной способности целлюлозы. К недостаткам можно отнести относительно высокую стоимость процесса и необходимость регенерации органических растворителей.

Делигнификация с использованием глубоких эвтектических растворителей (ГЭР, deep eutectic solvents) – класса растворителей, состоящих из двух компонентов, способных образовывать эвтектическую смесь с температурой плавления значительно более низкой, чем у каждого отдельного компонента – приводит к эффективной солюбилизации лигнина и гемицеллюлозы и повышает реакционную способность целлюлозы. Один из компонентов смесей выступает акцептором водородных связей (четвертичные соли аммония, например, холинхлорид), второй компонент – донором водородных связей (органические кислоты, многоосновные спирты, мочевина и другие соединения) [31–35]. Большим преимуществом метода является нетоксичность и биоразлагаемость используемых реагентов. Недостатком является относительно высокая стоимость процесса, высокая вязкость растворителей, а также необходимость рекуперации химических веществ, используемых в качестве компонентов растворителя.

При выборе способа предобработки растительной массы следует учитывать возможность гидролиза гемицеллюлоз, что создает технологический поток С5 сахаров, кроме того, могут образовываться токсичные для ферментов и микроорганизмов продукты. Учитывая это, вводят стадию разделения твердой и жидкой фракций после предобработки. Потоки С5 и С6 сахаров могут быть объединены после ферментативного гидролиза целлюлозы, или (пентозы или гексозы) могут быть использовать порознь [4, 5, 36]. В любом случае на каждой стадии следует контролировать образование С5 и С6 сахаров.

Цель настоящей работы – найти наиболее эффективный способ предобработки тростника для повышения его реакционной способности и подобрать оптимальный ферментный комплекс, обеспечивающий максимальный выход сахаров в ходе ферментативного гидролиза предобработанного тростника.

МЕТОДИКА

Ферментные препараты. В работе были использованы коммерческие препараты Агроцелл Плюс, Агроксил Премиум и Агроксил Плюс, произведенные на основе различных штаммов микроскопического гриба Penicillium verruculosum на предприятии ООО “Агрофермент”. Кроме того, были использованы лабораторные ферментные препараты (ФП), полученные с помощью штамма P. verruculosum В537 (продуцент целлюлаз) и штамма P. verruculosum F10 (продуцент целлобиазы или β-глюкозидазы) [37, 38].

Штаммы P. verruculosum культивировали в качалочных колбах Эрленмейера емкостью 750 мл в 100 мл ферментационной среды следующего состава (%): KH2PO4 – 1.5, (NH4)2SO4·7H2O – 0.5, MgSO4·7H2O – 0.03, CaCl2·2H2O – 0.03, глюкоза – 1.0, дрожжевой экстракт – 1.0, пшеничные отруби – 1.0, микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) – 40.0. После культивирования в течение 144 ч на качалке при 220 об./мин и 30°С культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелия центрифугированием в течение 10 мин при 10000 g. Препараты B537 и F10 были получены путем лиофильного высушивания КЖ, продуцируемой штаммами P. verruculosum В1-537 (ΔniaD) и P. verruculosum F10 на лиофильной сушке Benchtop 6K ES (SP Scientific/Virtis, США).

Реагенты. В работе использовали сухой тростник обыкновенный из Астраханской области (Россия) грубо дезинтегрированный и измельченный на ножевой мельнице и пылевую фракцию тростника, которая накапливается в фильтрах пылеуловителя ножевой мельницы. Дезинтегрированный тростник также подвергался обработке водяным паром, растворами гидроксида натрия или серной кислоты, органосольвом, ГЭР.

В качестве субстратов для определения активностей использовали Na-соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), ксилан бука, п-нитрофенил-β-глюкопиранозид (пНФГ) – производства “Sigma” (США) и микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ, ТУ 20.16.59-001-40693384-209, производства “Кристацелл”,Россия). Для приготовления буферных смесей и солевых растворов использовали реактивы фирм “Bio-Rad Laboratories” (США), “Panreac” (Германия), “Helicon” и “Реахим” (Россия). Для получения ГЭР использовали холин хлорид (ХХл) (“Molekula”, Англия), молочную кислоту (МК) (“Acros Organics”, Бельгия), моноэтаноламин (МЭА) (“Компонент-Реактив”, Россия).

Предобработка тростника. Предобработка проводилась в герметичных контейнерах из нержавеющей стали объемом 60 мл, помещенных в лабораторный аппарат для предобработки. Аппарат состоял из масляной бани, терморегулятора и двух термопар для контроля и управления температурой.

5 г дезинтегрированного тростника помещали в контейнер и добавляли 50 мл воды (обработка паром), раствора серной кислоты или гидроксида натрия нужной концентрации (0.25, 0.5, 1, 1.25% серной кислоты или 0.5, 1, 1.5, 2% гидроксида натрия) или смеси этанола с водой (40, 60, 80% этанола), содержащей 0.5% серной кислоты. Обработка велась в течение 1 ч при 120°С (кислотная или щелочная предобработка), 140°С (органосольвная) или 160°С (водяным паром).

После проведения предобработки тростник извлекали из контейнера и промывали 10 мл воды. Значение рН полученной суспензии тростника в воде доводили до 4.5–5.5 с помощью щелочи или кислоты соответственно. Затем суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 4000 g. Супернатант удаляли (отбирали пробу для проведения анализа состава сахаров с помощью ВЭЖХ), а к оставшемуся твердому остатку добавляли 50 мл воды, ресуспендировали и снова центрифугировали при тех же условиях. Супернатант удаляли. В осадке определяли содержание сухих веществ гравиметрическим методом. На всех стадиях определяли массы супернатанта и осадка.

Получение ГЭР. Оба вида ГЭР получали путем смешивания компонентов при постоянном перемешивании в течение 6 ч при 40°С (ХХл и МК в молярном соотношении 1 : 5) или в течение 4 ч при 60°С (ХХл и МЭА в молярном соотношении 1 : 6).

Предобработка тростника ГЭР. Для выбора оптимальных условий предобработки использовали ГЭР различного состава: кислый на основе ХХл и МК, а также слабощелочной на основе ХХл и МЭА. В типичном эксперименте к 500 мг дезинтегрированного тростника добавляли 9.5 г ГЭР (загрузка 5% по массе) и прогревали при перемешивании при 80°С в течение 24 ч. Полученные растворы охлаждали до комнатной температуры и добавляли по 10 мл 50%-ного водно-этанольного раствора. Смесь перемешивали, затем центрифугировали при 7000 g. Надосадочную жидкость, содержащую лигнин и компоненты ГЭР, отделяли, осадок многократно промывали водно-этанольной смесью, затем водой.

После предобработки тростник не подвергался дополнительной сушке, хранился при 4°С не более 2 недель.

Выход субстрата после предобработки определяли, как отношение массы предобработанного тростника после высушивания до постоянного веса к массе исходного тростника.

Определение активности и концентрации ферментов. За 1 ед. активности к специфическому субстрату принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль продукта за 1 мин при рН 5.0 и 50°С.

Активность по отношению к МКЦ, КМЦ и ксилану определяли по скорости накопления восстанавливающих сахаров (ВС), анализируемых методом Шомоди-Нельсона; активность по отношению к пНФГл – по скорости накопления п-нитрофенола [39].

Содержание белка в ФП определяли методом Лоури, используя БСА в качестве стандарта.

Ферментативный гидролиз предобработанного тростника. Гидролиз субстрата (100 г/л по сухой массе в реакционной смеси) проводили под действием ФП В537, Агроцелл Плюс, Агроксил Плюс или Агроксил Премиум (10 мг белка/г субстрата или 1 мг белка/мл реакционной смеси) с добавлением ФП F10 (1 мг белка/г субстрата или 0.1 мг белка/мл реакционной смеси) в пластиковых пробирках объемом 2 или 50 мл (объем реакционной смеси 1.5 или 20 мл соответственно) в термостатируемом шейкере. Процесс гидролиза вели в присутствии 0.1 г/л антибиотика ампициллина (“Белмедпрепараты”, Республика Беларусь) в 0.1 М Na-ацетатном буферном растворе рН 5.0 при 50°С в течение 48 ч.

Гидролиз субстратов, проявивших наибольшую реакционную способность, проводили также с помощью индивидуальных очищенных ферментов (целлобиогидролаз 1 и 2, эндоглюканаз 1 и 2, эндоксиланазы – все из P. verruculosum, β-глюкозидазы Aspergillus niger). Очистку ферментов проводили в соответствии с методиками, приведенными в работах [37, 38, 40]. Условия гидролиза: концентрация субстрата 40 г/л по сухой массе в реакционной смеси, концентрация фермента (целлобиогидролаз, эндоглюканаз или эндоксиланазы) 10 мг белка/г субстрата или 0.4 мг белка/мл реакционной смеси. Концентрация β-глюкозидазы 1 мг белка/г субстрата или 0.04 мг белка/мл реакционной смеси. Прочие условия гидролиза были аналогичны.

Из реакционной смеси отбирали аликвоты, в которых определяли концентрацию ВС методом Шомоди-Нельсона и состав низкомолекулярных продуктов с помощью ВЭЖХ-системы Agilent 1100 (“Agilent”, США) на колонке Диасфер-110-Амин (5 мкм, 4.0 × 250 мм); в качестве элюента использовали смесь ацетонитрил-вода 75 : 25 при скорости элюции 1 мл/мин, объем анализируемого образца 10×100 мкл. В качестве стандартов использовали ксилозу, арабинозу, глюкозу, ксилобиозу и целлобиозу.

Эксперимент проводился в трех повторностях.

Глубину ферментативного гидролиза (ГФГ) рассчитывали, как отношение концентрации ВС после 48 ч ферментативного гидролиза к исходной концентрации субстрата (100 г/л); выражали в процентах. Степень конверсии субстрата рассчитывали, умножив концентрацию продукта (ВС или глюкозы) после 48 ч ферментативного гидролиза на выход субстрата в процессе его предобработки (в долевом эквиваленте); выражали в процентах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Предобработка субстрата должна обеспечивать увеличение пористости поверхности субстрата, разрушению кристаллической структуры целлюлозных волокон, удалению лигнина и/или гемицеллюлозы. Изменение свойств предобработанного субстрата влечет за собой необходимость подбора и корректировки состава ферментного комплекса, используемого для гидролиза предобработанного субстрата.

В работе использовались ФП с различным содержанием ключевых гидролитических ферментов (целлобиогидролаз, эндоглюканаз, β-глюкозидазы и эндоксиланазы) (табл. 1), необходимых для разрушения основных полисахаров тростника – целлюлозы и ксилана. Так, ФП Агроцелл Плюс характеризовался высоким содержанием эндоглюканаз (около 50% от всех белков) и, соответственно, высокой активностью по отношению к КМЦ (48 ед./мг белка). В ФП Агроксил Премиум одновременно было повышенное содержание эндоглюканаз (28%) и эндоксиланазы (32%) и активности по отношению к КМЦ и ксилану составляли 19 и 34 ед./мг белка соответственно. ФП Агроксил Плюс характеризовался высоким содержанием эндоксиланазы (40%) и высокой активностью по отношению к ксилану (66 ед./мг белка). В перечисленных трех ФП содержание целлобиогидролаз составляло 22–25%, а в ФП 537 целлобиогидролазы были основными ферментами (около 60%). ФП F10 содержал 75% β-глюкозидазы, которой было недостаточно в других ФП. Соответственно, результаты гидролиза разных видов предобработанного тростника под действием этих препаратов должны отображать изменение состояния целлюлозы и ксилана в субстрате в ходе предобработки.

 

Таблица 1. Содержание общего белка (мг/г), индивидуальных ферментов (% от общего белка) и удельная активность (ед./мг белка) по отношению к различным субстратам в ФП

ФП

Белок,

мг/г

Фермент*

Активность

ЦБГ

ЭГ

ЭК

β-Г

МКЦ

КМЦ

ксилан

пНФГ

Агроцелл Плюс

71 ± 3

23 ± 2

50 ± 4

3.0 ± 0.3

1.4 ± 0.1

0.76 ± 0.07

48 ± 4

9.2 ± 0.8

0.73 ± 0.04

Агроксил Премиум

92 ± 4

22 ± 2

28 ± 2

32 ± 2

1.0 ± 0.1

0.53 ± 0.04

19 ± 2

34 ± 3

0.58 ± 0.03

Агроксил Плюс

90 ± 4

25 ± 2

2.0 ± 0.1

40 ± 4

1.5 ± 0.1

0.66 ± 0.06

5.2 ± 0.4

66 ± 6

0.76 ± 0.04

В537

950 ± 30

58 ± 5

2.6 ± 0.1

3.3 ± 0.3

3.1 ± 0.2

0.86 ± 0.08

13 ± 1

20 ± 2

1.8 ± 0.1

F10

660 ± 20

13 ± 1

2.2 ± 0.2

3.1 ± 0.3

75 ± 7

0.30 ± 0.03

3.4 ± 0.2

3.3 ± 0.2

61 ± 3

* ЦБГ – целлобиогидролаза, ЭГ – эндоглюканаза, ЭК – эндоксиланаза, β-Г – β-глюкозидаза.

 

Измельчение (рис. 1) тростника на ножевой мельнице не привело к улучшению результатов ферментативного гидролиза, в то время как глубина гидролиза более мелкой (пылевой) фракции, полученной при этом виде измельчения, увеличилась в 3 раза (табл. 2). В гидролизатах пылевой фракции концентрация ВС, ксилозы, арабинозы и глюкозы составила 18–20, 5–6, 0.2–0.3 и 13–14 г/л соответственно (табл. 3), что свидетельствовало о частичном гидролизе целлюлозы и гемицеллюлозы. Существенной разницы между действием на измельченный тростник того или иного из использованных в работе ФП выявлено не было.

 

Рис. 1. Тростник с разной степенью измельчения на ножевой мельнице: 1 – пылевая фракция, 2 – грубая фракция, 3 – исходный тростник.

 

Таблица 2. Выход субстрата* (%) после предобработки, глубина последующего ферментативного гидролиза** (ГФГ, %) под действием лучшего ФП и степень конверсии*** (%)

Способ и условия предобработки

Выход субстрата

ГФГ, %

Степень конверсии, %

полисахариды

целлюлоза

Без обработки

100

7 ± 1

7 ± 1

6 ± 1

Измельчение

Грубая фракция

100

7 ± 1

7 ± 1

6 ± 1

Пылевая фракция

100

20 ± 2

20 ± 2

14 ± 2

Водяной пар

70

25 ± 2

18 ± 2

11 ± 2

Щелочь

0.5% NaOH

92

22 ± 2

20 ± 2

13 ± 2

1% NaOH

64

40 ± 3

26 ± 3

19 ± 2

1.5% NaOH

58

59 ± 4

34 ± 4

25 ± 3

2% NaOH

57

48 ± 4

27 ± 2

22 ± 2

Кислота

0.25% H2SO4

73

16 ± 2

12 ± 2

9 ± 1

0.5% H2SO4

69

17 ± 2

12 ± 2

9 ± 1

1% H2SO4

67

17 ± 2

11 ± 2

9 ± 1

1.25% H2SO4

65

20 ± 2

13 ± 2

10 ± 2

Органосольв (+0.5% H2SO4)

40% EtOH

91

11 ± 2

10 ± 2

7 ± 1

60% EtOH

89

11 ± 2

10 ± 2

7 ± 1

80% EtOH

86

10 ± 2

9 ± 2

6 ± 1

ГЭР

ХХл/МК

57

45 ± 3

26 ± 2

20 ± 2

ХХл/МЭА

96

63 ± 4

60 ± 4

40 ± 3

* Выход субстрата – отношение массы предобработанного тростника после высушивания до постоянного веса к массе исходного тростника, в%.

** Глубина ферментативного гидролиза – отношение концентрации ВС после 48 ч ферментативного гидролиза к исходной концентрации субстрата, в %.

*** Степень конверсии – произведение концентрации продукта (ВС или глюкозы) после 48 ч ферментативного гидролиза и выхода субстрата в процессе его предобработки (в долевом эквиваленте).

 

Таблица 3. Концентрация сахаров (г/л) после 48 ч ферментативного гидролиза предобработанного тростника (100 г/л) при рН 5.0 и 50°С, концентрация ФП 10 мг белка/г субстрата

Субстрат

ФП*

Сахара, г/л

ВС

ксилоза

арабиноза

глюкоза

ксилобиоза

Исходный тростник

В537

5.2 ± 0.4

1.1 ± 0.1

0.18 ± 0.02

3.4 ± 0.2

0

АЦ

7.0 ± 0.6

1.5 ± 0.2

0.23 ± 0.02

4.8 ± 0.3

0

АкПр

6.5 ± 0.5

1.4 ± 0.1

0.14 ± 0.01

4.3 ± 0.3

0

АкПл

6.9 ± 0.5

1.5 ± 0.1

0.19 ± 0.01

4.4 ± 0.3

0

Пылевая фракция

В537

19 ± 2

5.7 ± 0.4

0.23 ± 0.02

13 ± 2

0

АЦ

20 ± 2

5.9 ± 0.4

0.25 ± 0.02

14 ± 2

0

АкПр

18 ± 2

5.1 ± 0.4

0.24 ± 0.02

13 ± 2

0

АкПл

19 ± 2

5.9 ± 0.4

0.25 ± 0.02

13 ± 2

0

Обработанный водяным паром

В537

21 ± 2

3.5 ± 0.2

0.26 ± 0.02

12 ± 1

0.51 ± 0.03

АкПр

23 ± 2

4.3 ± 0.3

0.30 ± 0.02

14 ± 1

0.63 ± 0.04

АкПл

25 ± 2

4.8 ± 0.3

0.28 ± 0.02

16 ± 2

0.72 ± 0.06

Обработанный раствором 1.5% NaOH

В537

46 ± 3

2.8 ± 0.2

0.76 ± 0.04

29 ± 2

0.56 ± 0.03

АкПр

58 ± 4

7.8 ± 0.5

1.2 ± 0.1

40 ± 3

0.68 ± 0.04

АкПл

59 ± 4

7.2 ± 0.5

1.3 ± 0.1

43 ± 3

0.73 ± 0.04

Обработанный раствором 1.25% H2SO4

В537

20 ± 2

1.9 ± 0.2

0.18 ± 0.02

15 ± 2

0.63 ± 0.05

АкПр

18 ± 2

2.4 ± 0.2

0.21 ± 0.02

11 ± 1

0.60 ± 0.04

АкПл

19 ± 2

2.1 ± 0.2

0.19 ± 0.02

13 ± 2

0.61 ± 0.05

Обработанный 40% EtOH, 0.5% H2SO4

В537

8.8 ± 0.9

1.2 ± 0.1

0.14 ± 0.01

6.5 ± 0.5

0.30 ± 0.02

АкПр

10 ± 1

1.5 ± 0.1

0.16 ± 0.01

7.0 ± 0.6

0.31 ± 0.02

АкПл

11 ± 2

1.6 ± 0.1

0.17 ± 0.02

7.7 ± 0.6

0.32 ± 0.02

Обработанный ГЭР (ХХл/МК)

В537

40 ± 3

4.0 ± 0.3

0

32 ± 2

4.1 ± 0.3

АЦ

45 ± 3

6.5 ± 0.5

0

35 ± 2

3.8 ± 0.3

АкПр

38 ± 2

6.0 ± 0.5

0

29 ± 2

2.8 ± 0.2

АкПл

39 ± 3

5.6 ± 0.4

0

30 ± 2

3.3 ± 0.3

Обработанный ГЭР (ХХл/МЭА)

В537

47 ± 3

6.4 ± 0.4

0.9 ± 0.1

31 ± 2

8.7 ± 0.6

АЦ

63 ± 4

12 ± 1

1.7 ± 0.2

42 ± 3

6.3 ± 0.4

АкПр

56 ± 4

13 ± 1

1.8 ± 0.2

36 ± 3

5.2 ± 0.3

АкПл

58 ± 4

10 ± 1

1.3 ± 0.1

40 ± 3

6.2 ± 0.3

* АЦ – Агроцелл Плюс, АкПр – Агроксил Премиум, АкПл – Агроксил Плюс.

 

Накопление арабинозы в гидролизатах объясняется, по-видимому, присутствием в используемых ФП небольшого количества ферментов-гликозидаз, способных гидролизовать связи между арабинозой и ксилозой в гемицеллюлозе тростника. Так, в ферментном комплексе близкородственного гриба P. canescens были обнаружены арабинофуранозидаза, отщепляющая арабинозу от арабиноксилана пшеницы [41].

Следует отметить, что измельчение тростника до пылевой фракции привело к возможности проведения ферментативного гидролиза при концентрации субстрата значительно выше, чем в случае грубо измельченного тростника. Так, глубина гидролиза пылевой фракции под действием ФП Агроцелл Плюс не зависела от концентрации субстрата в диапазоне 100–250 г/л (дальнейшее увеличение концентрации субстрата приводило к проблемам с массопереносом), в то время как наибольшая концентрация грубо измельченного тростника, при которой достигалась максимальная глубина гидролиза, составляла 200 г/л (рис. 2). При увеличении концентрации грубо измельченного тростника до 250 г/л в реакционной смеси отсутствовала жидкая фаза.

 

Рис. 2. Глубина гидролиза грубой (1) и пылевой фракций (2) измельченного тростника после 48 ч обработки ФП Агроцелл Плюс (10 мг белка/г субстрата) и F10 (1 мг белка/г субстрата) при 50°С, рН 5.0. На оси абсцисс указана концентрация субстрата.

 

Выход субстрата (нерастворимого осадка) после гидротермической предобработки тростника составил 70%, а в супернатанте была обнаружена ксилоза (2.5% от исходной массы тростника), то есть произошло частичное разрушение гемицеллюлоз и, вероятно, сольватация лигнина. Глубина гидролиза предобработанного субстрата увеличилась в 3.5 раза относительно исходного тростника (табл. 2). Наилучшие результаты при ферментативном гидролизе были получены с использованием ФП Агроксил Плюс (с увеличенным содержанием эндоксиланазы): концентрация ВС, ксилозы, ксилобиозы, арабинозы и глюкозы в реакционной среде составила 25, 4.8, 0.7, 0.3 и 16 г/л соответственно (табл. 3). Таким образом, гидротермическая предобработка тростника и последующий ферментативный гидролиз под действием ФП Агроксил Плюс позволяли извлечь 18% сахаров, в том числе 11% глюкозы (табл. 2).

Выход субстрата после предобработки тростника щелочью уменьшался с увеличением концентрации щелочи и составил 92% в случае 0.5%-ного NaOH и 57–58% в случае 1.5–2%-ного NaOH. В супернатантах низкомолекулярных сахаров со степенью полимеризации 1–4 методом ВЭЖХ обнаружено не было, то есть в ходе предобработки происходила солюбилизация лигнина без глубокого разрушения гемицеллюлоз. Глубина гидролиза предобработанного субстрата увеличилась в 3–8 раз относительно исходного тростника, максимальное значение этого параметра 59% соответствовало предобработке 1.5%-ным раствором NaOH (табл. 2). При ферментативном гидролизе предобработанного субстрата лучшим был ФП Агроксил Плюс (с увеличенным содержанием эндоксиланазы): концентрация ВС, ксилозы, ксилобиозы, арабинозы и глюкозы в реакционной среде составила 59, 7.2, 0.7, 1.3 и 43 г/л соответственно (табл. 3). Таким образом, предобработка тростника щелочью (1.5% NaOH) и последующий ферментативный гидролиз под действием ФП Агроксил Плюс позволяли извлечь 34% сахаров, в том числе 25% глюкозы (табл. 2).

Выход субстрата после предобработки тростника кислотой незначительно уменьшался с увеличением ее концентрации и составил 73–65%. В супернатантах были обнаружены сахара (в основном ксилоза и арабиноза), количество которых кратно увеличивалось с повышением концентрации кислоты: 5.5, 9.5, 14 и 20% от исходной массы тростника в случае использования 0.25, 0.5, 1.0 или 1.25% H2SO4. В ходе предобработки происходило разрушение гемицеллюлоз и солюбилизация лигнина. Глубина гидролиза предобработанного субстрата увеличилась в 2.5–3 раза относительно исходного тростника и наибольшее значение 20% соответствовало предобработке 1.25%-ным раствором H2SO4 (табл. 2). При ферментативном гидролизе этого субстрата небольшое преимущество имел ФП В537 с высоким содержанием целлобиогидролаз: концентрация ВС, ксилозы, ксилобиозы, арабинозы и глюкозы в реакционной среде составила 20, 1.9, 0.6, 0.2 и 15 г/л соответственно (табл. 3). Таким образом, предобработка тростника кислотой (1.25% H2SO4) и последующий ферментативный гидролиз под действием ФП В537 позволили извлечь 13% сахаров, в том числе 10% глюкозы (табл. 2).

Выход субстрата после органосольвной предобработки тростника незначительно уменьшался с увеличением концентрации этанола и составил 91–86%. В супернатантах сахаров обнаружено не было. Глубина гидролиза предобработанного субстрата увеличилась в 1.5 раза относительно исходного тростника, практически не зависела от концентрации этанола в ходе предобработки и составила 10–11% (табл. 2). При ферментативном гидролизе субстрата лучшим был ФП Агроксил Плюс (с увеличенным содержанием эндоксиланазы): концентрация ВС, ксилозы, ксилобиозы, арабинозы и глюкозы в реакционной среде составила 11, 1.6, 0.3, 0.2 и 7.7 г/л соответственно (табл. 3). Таким образом, предобработка тростника органосольвом (40% EtOH, 0.5% H2SO4) и последующий ферментативный гидролиз под действием ФП Агроксил Плюс позволили извлечь 10% сахаров, в том числе 7% глюкозы (табл. 2).

Выход субстрата после предобработки тростника ГЭР зависел от состава ГЭР и составил 57 и 96% в случае использования ХХл с МК или МЭА соответственно. При воздействии ХХл с МК на тростник, вероятно, происходило разрушение гемицеллюлоз и солюбилизация лигнина, а при воздействии ХХл с МЭА этого не наблюдалось. Глубина гидролиза предобработанного субстрата увеличилась в 6 и 9 раз относительно исходного тростника и составила 45 и 63% для ХХл с МК или МЭА соответственно (табл. 2). В обоих случаях ферментативный гидролиз субстрата наиболее полно протекал при использовании ФП Агроцелл Плюс (с увеличенным содержанием эндоглюканаз): в случае предобработки ХХл с МК концентрация ВС, ксилозы, ксилобиозы, арабинозы и глюкозы в реакционной среде составила 45, 6.5, 3.8, 0 и 35 г/л, в случае ХХл с МЭА – 63, 12, 6.3, 1.7 и 42 г/л соответственно (табл. 3). Таким образом, предобработка тростника кислотным ГЭР (ХХл с МК) и последующий ферментативный гидролиз под действием ФП Агроцелл Плюс позволили извлечь 26% сахаров, в том числе 20% глюкозы, а предобработка слабощелочным ГЭР (ХХл с МЭА) при прочих равных условиях – 63% сахаров и 40% глюкозы (табл. 2).

Процесс гидролиза тростника, предобработанного двумя типами ГЭР, был изучен более подробно. Для этого был проведен гидролиз субстратов очищенными индивидуальными ферментами целлюлазного комплекса (целлобиогидролазами 1 и 2, эндоглюканазами 1 и 2) и эндоксиланазой в присутствии дополнительной гомогенной β-глюкозидазы (10% от общей загрузки по белку). Среди индивидуальных ферментов наибольшую активность по отношению к обоим субстратам проявляла целлобиогидролаза 1 при начальной концентрации предобработанного ХХл с МК или МЭА субстрата 40 г/л было получено 16 и 20 г/л ВС соответственно (рис. 3). Глубина гидролиза при этом составила 40 и 50% только под действием целлобиогидролазы 1. Эндоглюканаза 1 проявляла высокую активность по отношению к тростнику, предобработанному ХХл с МЭА (концентрация ВС 16 г/л, глубина гидролиза 40%), и была намного менее активна к тростнику, предобработанному ХХл с МК (3.4 г/л ВС, глубина гидролиза 8.5%). Остальные ферменты (целлобиогидролаза 2, эндоглюканаза 2 и эндоксиланаза) проявляли меньшую активность по отношению к тростнику, предобработанному ХХл с МЭА (5-8 г/л ВС, 12–20% глубина гидролиза), и к тростнику, предобработанному ХХл с МК (2–3 г/л ВС, 4.5–7.5% глубина гидролиза).

 

Рис. 3. Концентрация ВС после 48 ч гидролиза тростника (40 г/л), предобработанного ГЭР ХХл с МК (1) или МЭА (2), под действием очищенных ферментов (10 мг белка/г субстрата) с добавлением β-глюкозидазы (1 мг белка/г субстрата) при 50°С, рН 5.0: ЦБГ – целлобиогидролаза, ЭГ – эндоглюканаза, ЭК – эндоксиланаза.

 

При гидролизе предобработанного ГЭР тростника смесями очищенных ферментов наблюдался ярко выраженный синергетический эффект в действии целлобиогидролаз и эндоглюканазы 1 на субстрат, полученный обработкой ХХл с МЭА, и менее выраженный синергетический эффект при действии этой же смеси на субстрат, полученый обработкой ХХл с МК (рис. 4). Максимальные значения коэффициентов синергизма (1.5 и 1.4 для предобработанного ХХл с МЭА или МК соответственно) наблюдали для соотношения целлобиогидролаза : эндоглюканаза 1 = 60 : 40. Синергетическое взаимодействие целлобиогидролаз с эндоксиланазой было значительно менее выражено для обоих субстратов. Глубина гидролиза предобработанного субстрата (тростник, обработанный ХХл с МЭА) с высоким содержанием ксилана (до 20%) мало зависела от содержания в реакционной смеси эндоксиланазы, что, вероятно, объясняется наличием у целлобиогидролазы 1 и эндоглюканазы 1 ксиланазной активности [33].

 

Рис. 4. Концентрация ВС после 48 ч гидролиза тростника (40 г/л), предобработанного ГЭР ХХл с МК (1, 2) или МЭА (3, 4), под действием смесей очищенных ферментов (4.5 мг общего белка/г субстрата) с добавлением β-глюкозидазы (0.45 мг белка/г субстрата) при 50°С, рН 5.0: 1 и 3 – смеси ЦБГ с ЭГ; 1, 2 и 4 – с ЭК. На оси абсцисс указано процентное содержание целлобиогидролаз в смесях относительно общего содержания ферментов.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сырая растительная биомасса малопригодна для ферментативной деструкции вследствие низкой реакционной способности. Целлюлоза устойчива к действию ферментов из-за своей нерастворимости и прочной структуры, обусловленной высокой кристалличностью. Лигнин является главным защитным средством для растения, препятствующим деструкции полисахаридов ферментами (он является физическим барьером и природным адсорбентом для многих ферментов). Гемицеллюлозы в составе лигноуглеводного комплекса также вносят вклад в низкую реакционную способность растительной биомассы, экранируя целлюлозу. Глубина ферментативного гидролиза пшеничной соломы, овсяной шелухи, кукурузных стеблей, хвойных и лиственных опилок невелика и составляет 5–12% от сухого вещества сырья [36]. В настоящей работе глубина гидролиза грубо дезинтегрированного тростника составила 7%. Таким образом, тростник можно отнести к сырью с низкой реакционной способностью.

Грубая фракция тростника, измельченного на ножевой мельнице, проявляла низкую реакционную способность при ферментативном гидролизе, в то время как его пылевая фракция обладала значительно лучшей гидролизуемостью – 20% сухого вещества конвертировалось в сахара. Учитывая, что стебли тростника содержат 37% целлюлозы и 21% гемицеллюлозы [2], степень конверсии целлюлозы до глюкозы составила около 38% целлюлозы, гемицеллюлоз до ксилозы и арабинозы – 29%. Важным преимуществом использования пылевой фракции оказалась возможность проведения ферментативного гидролиза субстрата высокой концентрации.

Измельчение, как способ увеличения реакционной способности субстрата, был эффективен при использовании планетарной мельницы-активатора АГО-2С [42]. Ферментативный гидролиз измельченных пшеничных отрубей привел к близкому к теоретическому выходу сахаров (62.4%) и практически полной конверсии углеводной составляющей. В работе [14] сравнивали выход сахаров в ходе ферментативного гидролиза рисовой соломы, подвергнутой мокрому дисковому помолу и шаровому помолу: выход глюкозы и ксилозы составил 78.5 и 41.5, 89.4 и 54.3% соответственно, т.е. конверсия целлюлозы в обоих случаях была выше конверсии ксилана. Измельчение пшеничной соломы в шаровой мельнице до частиц менее 100 мкм приводило к общему выходу углеводов 46%, глюкозы – 72% вследствие доказанного снижения кристалличности целлюлозы [15].

Гидротермическая предобработка была эффективной для рисовой соломы [14] и мискантуса – близкородственного тростнику злака [17]. В первом случае выход глюкозы и ксилозы после ферментативного гидролиза предобработанного при 180°С субстрата составил 70.3 и 88.6%, во втором случае обработка субстрата при 200°С обеспечивала практически полное удаление гемицеллюлозы, а последующий ферментативный гидролиз приводил к высвобождению 48% редуцирующих сахаров. В настоящей работе гидротермическая обработка тростника при 160°С приводила к частичному разрушению гемицеллюлоз (12% от общего содержания), а последующий ферментативный гидролиз обеспечивал конверсию 18% полисахаридов (из них 11% целлюлозы) в низкомолекулярные сахара.

Среди химических методов предобработки тростника наиболее эффективным оказалось использование слабощелочных растворов (по сравнению с растворами кислот). Так, обработка 1.5%-ным раствором NaOH или ГЭР ХХл с МЭА, в ходе которой не наблюдалось глубокого разрушения гемицеллюлозы, и последующий ферментативный гидролиз приводили к конверсии 34% полисахаридов (из них 25% целлюлозы) в низкомолекулярные сахара (1.5% NaOH) или к конверсии 60% полисахаридов (40% целлюлозы) до моносахаров (ГЭР). В литературе отмечена эффективность предобработки древесины тополя в растворах NaOH, Ca(OH)2 или аммиака [18], багассы (стеблей сахарного тростника) в растворе NaOH [36], кукурузной соломы в растворе NaOH и H2O2 (щелочно-окислительная обработка) [20] или в растворе Na3PO4 и Na2S [21]. Все авторы отмечают высокую степень конверсии предобработанного субстрата в глюкозу и ксилозу – от 55 до 91%. Процессы делигнификации и их влияние на выход ферментативного гидролиза предобработанных с помощью щелочных ГЭР кукурузных початков были изучены в работе [43]. При использовании ХХл/мочевина выход продуктов гидролиза составил 59% при оптимальной температуре предобработки 115°С, а при использовании ХХл/имидазол в диапазоне температур 80–150°С был еще выше (92–95%).

Во многих работах отмечается большая эффективность кислого ГЭР для предобработки растительной биомассы [31, 44–46]. В качестве донора водорода в таких смесях используются, как правило, органические кислоты. Ранее [46] сообщалось об эффективной предобработке тростника с помощью ГЭР на основе ХХл и молочной или щавелевой кислот. В оптимизированных условиях предобработки были получены субстраты, глубина ферментативного гидролиза которых составляла 80 и 86% соответственно. В настоящей работе показано, что щелочной ГЭР в отношении тростника не менее эффективен. Следует отметить, что вне зависимости от свойств ГЭР (кислый или щелочной), используемого на стадии предобработки тростника, ключевым ферментом в ходе гидролиза была целлобиогидролаза 1, а ее синергетическое взаимодействие с эндоглюканазой 1 обеспечивало высокий выход не только глюкозы, но и ксилозы.

В настоящей работе наименьшее увеличение реакционной способности тростника наблюдалось при использовании водных и водно-органических растворов серной кислоты: максимальная глубина последующего ферментативного гидролиза составляла 20 и 10% соответственно. Кислотная обработка была эффективной для пшеничной соломы, аннской травы и багассы [23], скорлупы миндаля [26], соевых оболочек [47] – суммарный выход сахаров на стадиях предобработки и ферментативного гидролиза составил более 80%. В работе [48] было исследовано влияние предобработки древесных опилок водными и водно-органическими растворами кислот на ферментативное осахаривание. Наиболее эффективной была предобработка водным раствором 4.8% азотной кислоты, которая увеличивала реакционную способность субстрата более чем в 5 раз, а использование органосольва (65% этанола или бутанола, 0.5% серной кислоты) приводило к повышению реакционной способности в 3–4 раза по сравнению с исходным сырьем.

Таким образом, для повышения реакционной способности тростника с целью его дальнейшего ферментативного гидролиза до моносахаров эффективны методы щелочной, в особенности щелочным ГЭР, гидротермической предобработки, измельчение до пылевых частиц. Наименее эффективным было использование кислотного органосольва. Для глубокого ферментативного гидролиза предобработанного тростника оптимальным является комплекс из целлобиогидролаз, эндоглюканаз и, в некоторых случаях, эндоксиланазы – ФП Агроцелл Плюс или Агроксил Плюс.

ФИНАНСИРОВАНИЕ. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования (Соглашение № 075-15-2022-1226 от 17.10.2022).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ. Настоящая работа выполнена без привлечения людей или животных в качестве объектов исследований.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

About the authors

M. V. Semenova

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

A. M. Rozhkova

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

D. O. Osipov

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

V. D. Telitsin

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

E. A. Rubtsova

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

E. G. Kondrat’eva

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

I. S. Vasil’eva

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

O. V. Morozova

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

A. I. Yaropolov

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

A. P. Sinitsyn

Federal Research Center “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: amrojkova@yahoo.com
Russian Federation, Moscow, 119071

References

  1. Гусаков А.В., Синицын А.П. // Химия биомассы: биотоплива и биопластики. М.: Научный мир, 2017. 789 с. ISBN 978-5-91522-451-2
  2. Количественный химический анализ растительного сырья. / Ред. В.И. Шарков, И.И. Куйбина, Ю.П. Соловьева, Т.А. Павлова. М.: Лесная промышленность, 1976. С. 63–64.
  3. Dibyajyoti H., Kumar P. // Process Biochem. 2020. V. 89. P. 110–133. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2019.10.001
  4. Gusakov A.V. // Biofuels. 2013. V. 4. № 6. P. 567–569. https://doi.org/10.4155/bfs.13.55
  5. Teter S.A., Brandon S.K., Emme B. Enzymatic Processes and Enzyme Development in Diorefining // Advances in Biorefineries. 2014. P. 199–233. https://doi.org/10.1533/9780857097385.1.199
  6. Sun Q., Foston M., Meng X., Sawada D., Pingali S.V., O’Neill H. M.,et al. // Biotechnol. Biofuels. 2014. V. 7. № 150. P. 1–14. https://doi.org/10.1186/s13068- 014-0150-6
  7. Yang B., Dai Z., Ding S.-Y., Wyman C.E. // Biofuels. 2011. V. 2. № 4. P. 421–449. https://doi.org/10.4155/bfs.11.116
  8. Kumar P., Barrett D.M., Delwiche M.J., Stroeve P. // Ind. Eng. Chem. Res. 2009. V. 48. P. 3713–3729. https://doi.org/10.1021/ie801542g
  9. Karimi K., Taherzadeh M.J. // Bioresour. Technol. 2016. V. 200. P. 1008–1018. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.11.022
  10. Liguori R., Ventorino V., Pepe O., Faraco V. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016. V. 100. № 2. P. 597–611. https://doi.org/10.1007/s00253-015-7125-9
  11. He Y.-C., Ma C.-L., Yang B. // Fungal Cellulolytic Enzymes. Microbial production and application. / Ed. Xu Fang, Yinbo Qu. Springer. 2018. P. 1–25. https://doi.org/10.1007/978-981-13-0749-2_1
  12. Alvira P., Tomáspejó E., Ballesteros M., Negro M.J. // Bioresour. Technol. 2010. V. 101. № 13. P. 4851–4861. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2009.11.093
  13. Paudel S.R., Banjara S.P., Choi O.K., Park K.Y., Kim Y.M., Lee J.W. // Bioresour. Technol. 2017. V. 245. P. 1194–1205. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.08.182
  14. Hideno A., Inoue H., Tsukahara K., Fujimoto S., Minowa T. Inoue S., Endo T., Sawayama S. // Bioresour. Technol. 2009. V. 100. P. 2706–2711. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2008.12.057
  15. Ghizzi G., Silva D., Couturier M., Berrin J.-G., Buléon A., Rouau, X. // Bioresour. Technol. 2012. V. 103. P. 192–210. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2011.09.073
  16. Bobleter O., Concin R. // Cellulose Chemistry and Technol. 1979. V. 13. P. 583–593.
  17. Павлов И.Н. // Ползуновский вестник. 2018. № 1. С. 148–152. https://doi.org/10.25712/ASTU.2072-8921.2018.01.028
  18. Bali G., Meng X., Deneff J.I., Sun Q., Ragauskas A.J. // ChemSusChem. 2015. V. 8. P. 275–279. https://doi.org/10.1002/cssc.201402752
  19. Prajapati B.P., Jana U.K., Suryawanshi R.K., Kango N. // Renewable Energy. 2020. V. 152. P. 653–663. https://doi.org/10.1016/j.renene.2020.01.063
  20. Liu I., Li Z. // RSC Advances. 2017. V. 7. P. 47456–47463. https://doi.org/10.1039/C7RA08101D
  21. Qing Q., Zhou L.L., Guo Q., Huang M.Z., He Y.C., Wang L.Q., Zhang Y. // Bioresour. Technol. 2016. V. 218. P. 209–216. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.06.063
  22. Rabemanolontsoa H., Saka S. // Bioresour. Technol. 2016. V. 199. P. 83–91. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.08.029
  23. Mishra A., Ghosh S. // Fuel. 2019. V. 236. P. 544–553. https://doi.org/10.1016/j.fuel.2018.09.024
  24. Woiciechowski A. L., Dalmas Neto C.J., Vandenberghe L.P.S., Carvalho Neto D.P., Sydney A.C.N., Letti L.A.J. et al. // Bioresour. Technol. 2020. V. 304. 122848. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.122848
  25. Yu Z., Du Y., Shang X., Zheng Y., Zhou J. // Industrial Crops and Products. 2018. V. 124. P. 555–562. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2018.08.029
  26. Nitsos C., Matsakas L., Triantafyllidis K., Rova U., Christakopoulos P. // Biofuels. 2018. V. 9. P. 545–558. https://doi.org/10.1080/17597269.2017.1378988
  27. Liu Q., Li W., Ma Q., An S., Li M., Jameel H., Chang H.M. // Bioresour. Technol. 2016. V. 211. P. 435–442. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.03.131
  28. Ostovareh S., Karimi K., Zamani A. // Industrial Crops and Products. 2015. V. 66. P. 170–177. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2014.12.023
  29. He Y.C., Liu F., Di J.H., Ding Y., Tao Z.C., Zhu Z.Z. et al.. // Industrial Crops and Products. 2016. V. 81. P. 129–138. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.11.079
  30. Arato C., Kendall P., Gjennstad G. // Appl. Biochem. and Biotechnol. 2005. V. 123. P. 871–882. https://doi.org/10.1007/978-1-59259-991-2_74
  31. Satlewal A., Agrawal R., Bhagia S., Sangoro J., Ragauskas A.J. // Biotechnol. Adv. 2018. V. 3. P. 2032–2050. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.08.009
  32. Zhao H., Baker G.A. // J. Chemical Technol. and Biotechnol. 2012. V. 88. P. 3–12. https://doi.org/10.1002/jctb.3935
  33. New E.K., Wu T.Y., Lee C.B., Poon Z.Y., Loow Y.-L., Foo L.Y.W. et al. // Process Safety and Environmental Protection. 2019. V. 123. P. 190–198. https://doi.org/10.1016/j.psep.2018.11.015
  34. Chen Z., Jacoby W.A., Wan C. // Bioresour. Technol. 2019. V. 279. P. 281–286. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.01.126
  35. Chong G., Di J., Ma C., Wang D., Wang C., Wang L., Zhang P., Zhu J., He Y. // Bioresour. Technol. 2018. V. 261. P. 196–205. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2018.04.015
  36. Синицын А.П., Синицына О.А. // Успехи биологической химии. 2021. Т. 61. С. 347–414.
  37. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. // Biotechnol. J. 2010. V. 5. № 8. P. 871–880. https://doi.org/10.1002/biot.201000050
  38. Dotsenko G.S., Gusakov A.V., Rozhkova A.M., Korotkova O.G., Sinitsyn A.P. // Process Biochem. 2015. V. 50. P. 1258–1263. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2015.05.008
  39. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ, Биотехнология. 1990. № 25. С. 148.
  40. Korotkova O.G., Semenova M.V., Morozova V.V., Zorov I.N., Sokolova L.M., Bubnova T.M. et al. // Biochemistry (Moscow). 2009. V. 74. № 5. P. 569–577. https://doi.org/10.1134/S0006297909050137
  41. Синицына О.А., Бухтояров Ф.Е., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Беккаревич А.О. и др. // Биохимия. 2003. Т. 68. № 11. С. 1494–1505.
  42. Осипов Д.О., Булахов А.Г., Короткова О.Г., Рожкова А.М., Дуплякин Е.О. и др. // Катализ в промышленности. 2016. Т. 16. С. 75–82. https://doi.org/10.18412/1816-0387-2016-5-75-82
  43. Procentese A., Johnson E., Orr V., Garruto Campanile A., Wood J.A., Marzocchella A. et al. // Biores. Technol. 2015. V. 192. P. 31–36. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2015.05.053
  44. Zhang C.-W., Xia S.-Q., Ma P.-S. // Biores. Technol. 2016. V. 219. P. 1–5. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2016.07.026
  45. Wahlstrom R., Hiltunen J., Pitaluga De Souza Nascente Sirkka M., Vuoti S., Kruus K. // RSC Adv. 2016. V. 6. № 72. P. 68100–68110. https://doi.org/10.1039/C6RA11719H
  46. Семенова М.В., Васильева И.С., Ярополов А.И., Синицын А.П. // Прикл. биохимия микробиология. 2023. Т. 59. №3. С. 253–259. https://doi.org/10.31857/S0555109923030169
  47. Синицын А.П., Осипов Д.О., Цурикова Н.В., Великорецкая И.А., Шашков И.А., Зверев С.В. // Биотехнология. 2016. Т. 1. С. 27–36. https://doi.org/10.21519/0234-2758-2016-1-27-36
  48. Доценко Г.С., Осипов Д.О., Зоров И.Н., Синицын А.П. // Катализ в промышленности. 2015. Т. 15. С. 67–73. https://doi.org/10.18412/1816-0387-2015-5-67-73

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
2. Fig. 1. Reed with different degrees of grinding in a knife mill: 1 – dust fraction, 2 – coarse fraction, 3 – original reed.

Download (285KB)
3. Fig. 2. Depth of hydrolysis of coarse (1) and dust fractions (2) of crushed reed after 48 hours of treatment with FP Agrocell Plus (10 mg protein/g substrate) and F10 (1 mg protein/g substrate) at 50°C, pH 5.0. The abscissa shows the substrate concentration.

Download (55KB)
4. Fig. 3. Concentration of BC after 48 h of hydrolysis of reed (40 g/l), pretreated with GER HCHL with MK (1) or MEA (2), under the action of purified enzymes (10 mg protein/g substrate) with the addition of β-glucosidase (1 mg protein/g substrate) at 50°C, pH 5.0: CBH – cellobiohydrolase, EG – endoglucanase, EC – endoxylanase.

Download (51KB)
5. Fig. 4. Concentration of BC after 48 h of hydrolysis of cane (40 g/l) pretreated with GER XXl with MK (1, 2) or MEA (3, 4), under the action of mixtures of purified enzymes (4.5 mg total protein/g substrate) with the addition of β-glucosidase (0.45 mg protein/g substrate) at 50°C, pH 5.0: 1 and 3 – mixtures of CBG with EG; 1, 2 and 4 – with EC. The abscissa axis shows the percentage content of cellobiohydrolases in the mixtures relative to the total enzyme content.

Download (84KB)

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».