Effect of ethanol on the growth of the red microalga Galdieria sulphuraria

Full Text

Cyanidiales являются рано обособившейся в ходе эволюции [1] филой красных водорослей, большинство представителей которой обитают в геотермальных серных источниках, содержащих ионы тяжелых металлов при pH 0.5–4.0 и температурах вплоть до 56°С. Эти микроводоросли сочетают особенности строения клеток-эукариот с эколого-биохимическими особенностями, присущими экстремофильным видам архей и бактерий. Виды, приспособленные к одному, или реже к двум [2, 3] экстремальным факторам, встречаются и среди других групп водорослей, но возможность обитания сразу при воздействии нескольких неблагоприятных факторов, то есть полиэкстремофилия, известна лишь у Cyanidiales. Благодаря исключительности свойств и минимальным для эукариот размерам генома, равного 12–18 Mb [4–6], Cyanidiales как представители архепластид стали одним из важнейших объектов исследований в клеточной физиологии, биохимии, молекулярной биологии, филогеномике и эволюционной биологии. Они играют важную роль в изучении многих сторон оксигенного фотосинтеза и вопросов его происхождения. Полиэкстремофилия и многие особенности метаболизма были унаследованы Cyanidiales от архей и бактерий, что указало на возможность горизонтального переноса генов от прокариот к эукариотам и стало новым этапом в понимании эукариотной организации клетки [1, 6].

В составе Cyanidiales виды рода Galdieria (всего четыре рода, включая также Cyanidiococcus, Cyanidioschyzon и Cyanidium, и чуть более 10 видов) [1, 6] характеризуются наибольшей устойчивостью к тяжелым металлам и к высоким концентрациям соли (вплоть до 1.5 М NaCl) [7]. Важной чертой, отличающей род Galdieria, является способность наряду с фотоавтотрофией к темновому гетеротрофному (хемогетеротрофному) росту, известному для представителей ряда групп одноклеточных водорослей. Возможность светового гетеротрофного (миксотрофного) роста встречается чаще, хотя также является нетривиальным свойством [8, 9].

Высококислые серные источники с повышенной температурой крайне бедны микроорганизмами. Предполагаемым источником осмотически усваиваемых органических продуктов для видов рода Galdieria служат продукты жизнедеятельности длительно находящихся в той же среде нефотосинтезирующих прокариот или, возможно собственных клеток, находящихся в составе прибрежных водорослевых матов [6–8], что подразумевает разнообразие образующихся органических субстратов. Выявлено 27 усвояемых углеводов и полиолов и с учетом сахарофосфатов, ряда аминокислот, интермедиатов цикла Кребса, до 50 органических экзогенных субстратов, которые могут использоваться видами рода Galdieria, что является своеобразным рекордом для микроводорослей [1, 9–12].

Световая гетеротрофия (фотогетеротрофия, или миксотрофия) и темновая гетеротрофия (хемогетеротрофия) служат адаптивной стратегией, позволяющей использовать растворенные органические вещества в тех случаях, когда в среде обитания они становятся наиболее выгодным источником энергии [8]. Таким образом, возможность фото- и хемогетеротрофного питания в разных биохимических вариантах является успешной эволюционной стратегией микроводорослей, увеличивающей их физиолого-биохимическую активность [8]. Взаимоотношение дыхательного и фотосинтетического процессов при фотогетеротрофии и возможные для усвоения органические субстраты пока полностью не выяснены, что подразумевает дальнейшие исследования Galdieria и других водорослей-миксотрофов [8, 10, 13, 14].

Экстремофильные организмы вызывают все больший интерес благодаря своим уникальным метаболическим способностям и большому биотехнологическому потенциалу. Биоремедиация бытовых и промышленных сточных вод, характеризующихся повышенной температурой и содержащих органические вещества, является наиболее перспективным направлением использования микроводорослей рода Galdieria в биотехнологии. Прибрежные водорослевые маты горячих природных источников, содержащие G. sulphuraria, указывают на возможность иммобилизации культуры в очистных сооружениях [15], поэтому использование микроводорослей рода Galdieria для извлечения органических веществ из отходов пищевых производств может быть перспективным [16, 17]. Список потребляемых Galdieria субстратов, несмотря на обширность, нельзя считать полным. Требуются дальнейшие исследования, чтобы установить полный круг потребляемых продуктов с учетом их возможной токсичности. Среди десятков известных для Galdieria органических субстратов не значатся сведения об этаноле как возможном органическом источнике энергии, хотя этиловый спирт – энергетически выгодное соединение, конечными продуктами превращений которого в клетке являются СО₂ и Н₂О. Цель настоящей работы – выяснение влияния этанола на рост микроводоросли G. sulphuraria.

МЕТОДИКА

Штамм и условия культивирования. В опытах использовали аксеничную культуру термоацидофильной красной микроводоросли G. sulphuraria (Galdieri) Merola, штамм IPPAS P513 из Коллекции микроводорослей и цианобактерий IPPAS ИФР РАН. Водоросли выращивали при 38°С на культуральной среде Аллен, доводя рН до 2.5 за счет микродобавки H₂SO₄ [6, 10]. Контрольную фотоавтотрофную культуру и фотогетеротрофные культуры, с 0.1% этанола или 0.1% глюкозы, выращивали при круглосуточном освещении на постоянном дневном 3500К свету 40 мкМ фотонов·м^–2·с^–1 (лампы SL 20/32735, Китай). Наряду с этим, в варианте опыта с автотрофной культурой и культурой с добавкой этанола эксперимент проводили в полной темноте. Для выращивания использовали конические колбы объемом 100 мл, внося в каждую по 50 мл среды для культивирования (высота жидкости в колбе – 4 см). Клеточные суспензии ежедневно перемешивали механически в течение 5 мин, не используя барботирование или качание для уменьшения испарения этанола [18]. Отбор аликвот для определения ростовых характеристик в культурах клеток проводили 5 раз: на 1 (нулевая точка), 2, 4, 8 и 11 сут в трех биологических повторностях. Дальнейший рост прекращали из-за повышенного испарения спирта при температуре выше комнатной или израсходования добавляемой глюкозы. Подсчет клеток проводили в камере Горяева на бинокулярном микроскопе Биомед 6, (ООО “Биомед”, Китай–Россия). Начальная плотность составляла 1.2 × 10⁶ кл./мл.

Спектры поглощения. Для регистрации спектров поглощения использовали аликвоты клеток объемом 1.5 мл. Спектры образцов измеряли в прямоугольных стандартных оптических кюветах на 1.0 см на спектрофотометре Beckman DU-650 (“Beckman Coulter Inc.”, США) в спектральном диапазоне 400–750 нм.

Значение минимального уровня светорассеяния клеточных образцов при 750 нм, не искажаемого поглощением хлорофилла, служило для сопоставления с результатами подсчета числа клеток и для определения их фотосинтетической и дыхательной активности [19–21].

Для получения спектров, корректно отражающих абсорбционные свойства фотосинтетического аппарата, спектр каждого образца регистрировали трижды, усредняли, после чего вычитали вклад рассеянного света во всей видимой спектральной области регистрации, используя математическое обеспечение “Origin 6.1”.

Расходование этанола и глюкозы. Для отделения клеток культуральную жидкость в объеме 1.5 мл центрифугировали в течение 10 мин при 7000 g на центрифуге Eppendorf (“MiniSpin”, Германия). Содержание этанола в надосадочной жидкости определяли хроматографически по мере роста культуры одновременно с отбором проб для подсчета числа клеток. Использовали газовый хроматограф Кристалл 5000.2 (“Хроматэк”, Россия), оснащенный капиллярной колонкой ZB-WAXplus размером 30 м × × 0.25 мм × 0.35 µм (“Phenomenex”, США) и ПИД-детектором. Разделение проводили в градиенте температуры. Газом-носителем служил азот марки ОСЧ. Для учета повышенного испарения спирта из культуральной среды [18] при 38°С в течение всего 11-дневного эксперимента использовали не содержащие клеток контрольные колбы с внесенным этанолом (спирт этиловый ректифицированный, “Люкс”, 96.3%, ГОСТ 5962-2013, ООО “Донской”, РФ). Расходование D-глюкозы (“Renewal”, РФ) в культуральной среде определяли спектрофотомерически при 504 нм глюкозооксидазным методом, используя набор “Агат-Мед” (Россия). Как и для подсчета числа клеток, уровень этанола и глюкозы измеряли в трех сериях экспериментов.

Определение клеточного дыхания и фотосинтеза. Поглощение кислорода в темноте и выделение кислорода на свету регистрировали непосредственно в суспензии клеток G. sulphuraria на потенциометре, снабженном электродом Кларка Oxygraph, (“Hansatech”, Германия), как описано в работах [20, 21] в термостатируемой кювете объемом 1 мл при 38°С. Фотосинтетическую активность определяли с естественным донором (Н₂О) и акцептором (СО₂) электронов. Клетки предварительно концентрировали для достижения равных значений оптической плотности суспензии (ОD₇₅₀) мягкой фильтрацией (фильтры “Nalgene”,USA, размер пор 0.45 μм). Изменение концентрации кислорода в среде выражали в нмоль О₂/(ОD₇₅₀) мл ^‧мин. Источником белого света служил осветитель ОИ-24 (“ЛОМО”, Россия), интенсивность освещения – 800 мкМ фотонов м^–2 с^–1. Непосредственно перед измерениями собранные клетки для адаптации к темновым условиям выдерживали 20 мин в темноте и для преадаптации к свету освещали в течение 20 мин белым светом лампы SL 20/32735, используемой для выращивания культуры.

Статистическая обработка. Для статистического анализа различий при построении гистограмм использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) в программе “Origin 7”. Значимыми считались различия с доверительной вероятностью 95% (Р < 0.05). Столбцы гистограмм, соответствующие сравниваемым средним величинам, обозначались латинскими буквами, которые при выявлении статистической достоверности различий снабжались знаком*.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристики роста и дыхания клеток G. sulphuraria в темноте с этанолом. Микроорганизмы в своем большинстве не способны к росту и нейтрализации этанола, если его содержание превышает 4% [22, 23]. Концентрация спирта, которая вызывает окислительный стресс и клеточный токсикоз, тем не менее, индивидуальна. Концентрации этанола, используемые для гетеротрофного роста микроводорослей, обычно не превышают 0.5–1.0% [23, 24]. При большем содержании токсическое действие спирта усиливается настолько, что рост микроорганизмов сначала замедляется, а затем останавливается. Оптимальные концентрации этанола также видоспецифичны. Например, при наличии в среде 0.5% этанола биомасса зеленой водоросли Dunaliella viridis была меньше биомассы, нараставшей в среде с 0.3% этанола [24]. Лишь у E. gracilis этанол остается активным стимулятором гетеротрофного роста в концентрации, достигающей 1.5% [25]. В настоящей работе рассмотрена возможность роста G. sulphuraria в присутствии этанола на свету и в темноте. В световых условиях, то есть в режиме фотогетеротрофии, добавление в среду этанола в концентрации 0.5 или 1.0% не давало прибавки в росте (данные не показаны), по сравнению с концентрацией, равной 0.1%. В дальнейшем, во всех проведенных экспериментах использовалась концентрация, равная 0.1% (21.7 мМ, вес/об.), чтобы сделать менее вероятным токсическое действие спирта. Эта же концентрация этанола была использована и для темновых условий. На рис. 1 представлены две гистограммы, отражающие количество клеток в культуре G. sulphuraria, находящиейся в темноте без добавки и с добавкой этанола. Статистическая обработка результатов показала отсутствие достоверных изменений роста у исходно фотоавтотрофной культуры, не содержащей этанол, что в этом случае естественно из-за блокировки фотосинтеза и отсутствия иных источников энергии (рис. 1а). В присутствии этанола статистически значимых изменений роста также не наблюдалось (рис. 1б). Количество клеток в обоих вариантах культуры оставалось на постоянном и одинаковом уровне (состояние переживания клеток).

 

Рис. 1. Рост культуры G. sulphuraria в темноте без этанола (а) и при добавлении 0.1% этанола (б). Приведены средние значения ± стандартная ошибка среднего (n = 3). Совпадение буквенных обозначений над столбцами указывает на отсутствие статистически значимых изменений в сериях измерений. Доверительный интервал P ≤ 0.05.

 

Исследование дыхания у клеток G. sulphuraria, помещенных в темноту, показало низкую скорость поглощения О₂ контрольными клетками при истощении субстратов дыхания в отсутствие фотосинтеза, тогда как в присутствии этанола дыхание возрастало на второй день примерно в 2.5 раза, и в последующие дни падало до значений, сравнимых с таковыми у контрольных растений (рис. 2).

 

Рис. 2. Изменение скорости поглощения кислорода при темновом дыхании клеток G. sulphuraria, находящихся в темноте без добавления (А) и с добавлением 0.1% этанола (В). * Обозначены статистически значимые различия (см. Методы).

 

Так как культура практически не росла в присутствии этанола, а дыхание при этом значительно возрастало, можно видеть, что стимуляция роста этанолом в темновых условиях не реализовывалась. В таком случае можно предположить проявление токсического действия этанола (мягкого стресса), что существенно отличает его от известных для G. sulphuraria иных органических субстратов, поскольку в присутствии глюкозы или других гексоз и глицерина наблюдается темновой гетеротрофный рост G. sulphuraria, который значительно превосходит возможности фотоавтотрофии [10, 11, 26]. Последующее снижение скорости поглощения кислорода клетками G. sulphuraria в темноте в присутствии этанола даже в условиях стресса также можно объяснить исчерпанием дыхательного субстрата в отсутствие фотосинтеза (рис. 2).

Характеристики роста клеток G. sulphuraria на свету в фотоавтотрофных или фотогетеротрофных (в присутствии этанола или глюкозы) условиях. В эксперименте на свету (рис. 3) у контрольной фотоавтотрофной культуры (столбцы А) в первые несколько дней сохранялось состояние лаг-фазы. Тенденция к росту числа клеток намечалась после 4 сут и становилась достоверной к 8 и 11 сут (А* ≥ А). Наблюдаемый здесь и в других работах [10, 27] медленный рост фотоавтотрофной культуры объясняется особенностями экологии G. sulphuraria [6]. В высококислых серных источниках с повышенной температурой, в которых обитает эта микроводоросль, буферное равновесие СО₂ ↔ НСО₃- ↔ СО₃^2- уже при pH < 4 полностью смещено в сторону СО₂, а повышенная температура заметно снижает растворимость углекислого газа, что приводит к низкой фотосинтетической активности и замедленному фотоавтотрофному росту Galdieria [10, 13, 28]. Гетеротрофия с использованием возможно большего числа органических соединений становится жизненно важным свойством. Возможность метаболизма этанола, несмотря на его побочное отрицательное действие, по-видимому, в числе таких свойств.

 

Рис. 3. Динамика роста культуры G. sulphuraria на свету в течение 11 сут без добавок (А, фотоавтотрофная культура), в присутствии 0.1% этанола (В) и в присутствии 0.1% глюкозы (С). Приведены средние значения и доверительные интервалы (n = 3). Совпадение буквенных обозначений в каждой серии означает отсутствие статистически значимых различий; * Обозначены статистически значимые различия.

 

В присутствии этанола лаг-фаза (столбцы В) занимала столько же времени, сколько при фотоавтотрофии. Достоверное опережение в росте по сравнению с фотоавтотрофной культурой (В* > А*) прослеживалось в последние дни опыта. К окончанию эксперимента, на 11 сут, численность “этанольных” клеток превышала накапливаемую при фотоавтотрофии в 1.7 раза, что могло указывать на усвоение этанола на свету. Необходимо отметить, что при использовании также 0.1%-ного этанола в среде для зеленой микроводоросли Haematococcus pluvialis было получено почти такое же увеличение биомассы: в среднем в два раза [29].

Длительность лаг-фазы в зависимости от органического субстрата у G. sulphuraria могла заметно различаться, например, составляя до 30 сут при использовании лимонной кислоты [28] и даже 40 сут при добавлении дульцитола [10]. Для сопоставления с этанолом была использована фотогетеротрофная культура, содержащая 0.1% глюкозы, изменения роста которой начинались практически без лаг-фазы (рис. 3). На 2–4 сут эксперимента, к началу усиления роста на этаноле, численность клеток в культуре, содержащей глюкозу, уже удваивалась в экспоненциальной фазе роста и продолжала далее увеличиваться более быстрыми темпами. В итоге, на 11 сут количество клеток в присутствии глюкозы примерно в 4 раза превосходило их количество при выращивании на этаноле и почти в 7 раз – при фотоавтотрофном росте.

Для оценки роста микроводорослей наряду с подсчетом клеток использовалось измерение светорассеяния, величина которого пропорциональна сухой биомассе в широком диапазоне концентраций [19, 20, 29]. Измерение светорассеяния связано с регистрацией спектров поглощения фотосинтетических пигментов непосредственно в клетке и позволяло сочетать данные о росте культуры с изменениями дыхания и фотосинтеза в пробах.

Спектры поглощения суспензии клеток G. sulphuraria. Показателем уровня светорассеяния на разных сроках выращивания исследуемой культуры микроводоросли G. sulphuraria служили данные об ординатах спектров поглощения при 750 нм. На рис. 4а ординаты измеренных спектральных кривых при 750 нм отражают уровень светорассеяния клеточных суспезий на 11 сут эксперимента (ординаты спектра 3 при 750 нм уменьшены вдвое). На рис. 4б представлены те же спектры, что и на рис. 4а, но после вычитания вклада, вносимого светорассеянием, и нормирования в максимуме поглощения хлорофилла.

 

Рис. 4. Спектры поглощения культуры клеток G. sulphuraria на 11 сут роста на свету (а), и те же спектры после вычитания вклада, даваемого светорассеянием, и нормирования в максимуме поглощения хлорофилла (б): 1 – фотоавтотрофная культура; 2 – фотогетеротрофная культура, содержащая 0.1% этанола; 3 – фотогетеротрофная культура, содержащая 0.1% глюкозы (ординаты спектра 3 при 750 нм уменьшены вдвое) .

 

Из рис. 4 видно, что к 11 сут светорассеяние вносило существенный вклад в амплитуду спектральных кривых (рис. 4а), но после вычитания вклада светорассеяния форма спектров (shape) во всей спектральной области измерений от 400 до 750 нм оставалась практически неизменной (рис. 4б).

Изменения в соотношении полос поглощения при 625 нм (фикобилисомы) и 678 нм (хлорофилл) были незначительными. Очевидно, что и спирт, и глюкоза в малых концентрациях, в отличие от 1% глюкозы [27], практически не влияли на относительное содержание пигментов, что указывало на отсутствие нарушений фотосинтетического аппарата.

Дыхание и фотосинтез клеток G. sulphuraria на свету в фотоавтотрофных или фотогетеротрофных условиях. Данные о росте G. sulphuraria были сопоставлены с результатами измерения дыхания и фотосинтеза (рис. 5).

 

Рис. 5. Поглощение кислорода при темновом дыхании (а) и выделение кислорода при фотосинтезе с поправкой на затраты О₂ при дыхании (б) в культуре клеток G. sulphuraria при фотоавтотрофном росте (А), фотогетеротрофном в присутствии 0.1% этанола (В) или 0.1% глюкозы (С). * Отмечены статистически значимые различия.

 

Клеточное дыхание в фотоавтотрофном режиме оставалось низким, его некоторое увеличение в ходе эксперимента оставалось в пределах точности измерений (рис. 5а, столбцы A). В присутствии этанола потребление кислорода достоверно увеличивалось уже на 2 день (В* > В), так же как и у клеток, помещенных в темноту (рис. 2). Наибольшее усиление дыхания наблюдалось при потреблении глюкозы (С* > В* > А). На 4 cут уровень дыхания культуры, содержащей этанол, сравнялся с уровнем, наблюдаемым в присутствии глюкозы. На 8 сут потребление кислорода сохранялось примерно одинаковым в обеих фотогетеротрофных культурах (В* ≈ С*) и к окончанию эксперимента, на 11 сут, в обоих случаях начинало снижаться (рис. 5а), что можно объяснить исчерпанием глюкозы и значительным уменьшением концентрации спирта в культуральной жидкости (см. рис. 6). Таким образом, в течение эксперимента, начиная со 2 сут, уровень дыхания при добавлении этанола и глюкозы достоверно превышал уровень фотоавтотрофной культуры (В* и С* > А). Следует отметить, что на фоне резко увеличившейся скорости дыхания в присутствии этанола на 2 сут эксперимента в темноте и на свету (рис. 2 и 5а) рост культуры микроводорослей не обнаруживался (рис. 1 и 3). В дальнейшем, в темноте в присутствии этанола не происходило увеличения количества клеток (рис. 1), а на свету рост активизировался по сравнению с фотоавтотрофной культурой лишь в последние дни эксперимента на 8 и 11 сут (рис. 3). Совокупность этих данных указывает на то, что этанол вызывает стресс, который клетки микроводоросли преодолевают на свету, по-видимому, благодаря процессу фотосинтеза.

 

Рис. 6. Динамика расходования (%) этанола и глюкозы в среде клетками G. sulphuraria: 1 – контроль, среда с 0.1% этанола без клеток; 2 – среда с 0.1% этанола после выращивания G. sulphuraria в темноте; 3 – среда с 0.1% этанола после выращивания G. sulphuraria на свету; 4 – среда с 0.1% глюкозы при световом выращивании клеток. Приведены средние значения ± стандартное отклонение (n = 3).

 

Определение скорости фотосинтетического выделения кислорода в фотоавтотрофной культуре показало, что, судя по средним значениям, происходило ее увеличение, но согласно доверительным интервалам, это увеличение нельзя считать достоверным. В сравнении с фотоавтотрофией усиление фотосинтеза при добавлении этанола и глюкозы (рис. 5б) было достоверным и весьма заметным (В* и С* > А). По всей вероятности, резкое возрастание скорости дыхания в начале лаг-фазы в присутствии этанола сопровождалось ускоренным образованием углекислого газа, который используется в качестве конечного акцептора фотосинтеза и ускоряет этот процесс.

Фотосинтетическая активность в присутствии глюкозы в среде уже на 2 сут увеличивалась вдвое. К этому дню в культуре с этанолом уровень фотосинтеза еще оставался прежним, что коррелировало в этом случае с наличием лаг-фазы. Однако на 4 сут фотосинтез в присутствии этанола обгонял фотосинтез при наличии глюкозы, достигая максимума на 8 сут, оставаясь выше и в последние 11 сут. На первый взгляд, данное увеличение фотосинтетической активности в сравнении не только с фотоавтотрофной, но и с фотогетеротрофной культурой с глюкозой выглядит парадоксально, так как увеличение числа клеток G. sulphuraria в присутствии глюкозы значительно опережает их прибавку в присутствии спирта. Однако, как отмечалось выше, ускорению фотосинтеза в культуре с этанолом способствовало усиление дыхания, в результате чего в клетках возрастала концентрация углекислого газа, который становился дополнительным субстратом-стимулятором фотосинтетического процесса. В то же время, именно благодаря продуцированию субстратов дыхания (глюкозы и восстановителей) в процессе фотосинтеза культура клеток в присутствии этанола (рис. 5б) на свету сохраняла высокую скорость дыхания, в отличие от темноты, когда субстраты дыхания исчерпывались (рис. 2). Следует добавить, что глюкоза является у фотосинтетиков конечным продуктом фотосинтетических реакций. При поступлении извне она может поэтому сразу же использоваться клеткой как строительный материал, что и приводит к более быстрому росту клеточной массы без значительной параллельной этому интенсификации фотосинтеза. Кроме того, известно, что одной из регуляторных функций глюкозы у различных фотосинтезирующих организмов является ингибирование фотосинтетической активности [6, 8, 10, 14].

Изменение концентрации этанола в культуре клеток в темноте или на свету. Изменение концентрации этанола на свету и отсутствие его потребления клетками G. sulphuraria в темноте подтверждаются хроматографическим определением спирта в культуральной среде (рис. 6). Этанол – легко испаряющаяся жидкость, потери которой при комнатной температуре и стационарном культивировании составляют не менее 20% [16]. При 38^оС испарение протекает еще интенсивнее, составляя в условиях эксперимента 65% на 11 сут инкубации (рис. 6, кривая 1, контроль в отсутствие клеток). Кривая 2, полученная для культуры клеток, росших в темноте с этанолом, почти полностью совпадала с кривой 1 в пределах точности эксперимента за все время измерений (рис. 6), что подтвердило отсутствие потребления этанола клетками G. sulphuraria в темновых условиях (рис. 2). Хотя кривая, отражающая снижение концентрации этанола, измеренной для культуры клеток, росших с этанолом на свету (кривая 3), начиная с 4–5 сут расходится с кривой, отражающей испарение спирта (кривая 1), определенное достоверное потребление этанола клетками можно наблюдать только в конце периода культивирования согласно кривой 3 (рис. 6), полученной для клеток, находившихся на свету. Для сравнения приведено полное потребление за время эксперимента глюкозы и значительное сокращение периода лаг-фазы (рис. 6, кривая 4).

Необходимо отметить, что снижение концентрации этанола в ростовой среде по мере культивирования G. sulphuraria может быть связано не только с испарением, как показано на рис. 6 (кривая 1), а также с адаптацией клеток к присутствию этанола на свету к концу периода культивирования. Известно, что многие микроводоросли метаболизируют этанол при помощи последовательно функционирующих ферментов алкогольдегидрогеназы (АДГ), окисляющей этанол до ацетальдегида, и ацетальдегиддегидрогеназы, преобразующей получаемый ацетальдегид в ацетат [30, 31]. В процессе адаптации к этанолу G. sulphuraria может индуцировать синтез этих ферментов, что в таком случае объясняет более быстрое исчерпание этанола в среде с клетками на свету (рис. 6, кривая 3), по сравнению с изменением его концентрации в среде с клетками в темноте ( рис. 6, кривая 2). Тем более, что согласно геномным данным, G. sulphuraria способна к синтезу глицериндегидрогеназы/железосодержащей алкогольдегидрогеназы (FeADH, Gasu_57960), относящейся к типу III АДГ [32]. Кроме того, обнаружено также присутствие гена второго ключевого фермента превращений этанола, ацетальдегиддегидрогеназы [33]. Роль обоих ферментов не сводится лишь к окислению этанола, так как они рассматриваются как активные участники защиты клеток от оксигенного стресса [34].

Таким образом, влияние этанола на рост культуры G. sulphuraria является комплексным, способствует увеличению плотности культуры благодаря, в конечном итоге, ускорению дыхания с выделением СО₂, который усиливает фотосинтез как конечный акцептор. С одной стороны, дыхание ускоряется при стрессе, вызываемом этанолом, с другой стороны, после периода адаптации при возможном метаболизме этанола также может ускоряться выделение СО₂. Баланс между дыханием, фотосинтезом и возможным усвоением этанола представлен на рис. 7. Образуемый в митохондриях в цикле Кребса СО₂ поступает в хлоропласты, интенсифицируя фотосинтез. Экзогенная глюкоза обладает бόльшими метаболическими и энергетическими возможностями, образуя запасные углеводы и регулируя активность фотосинтетических ферментов. Сравнение с добавляемой глюкозой (рис. 7) позволяет интерпретировать ряд особенностей роста G. sulphuraria, несмотря на то, что два органических субстрата, этанол и глюкоза, различаются по многим параметрам. Глюкоза не обладает токсичностью, активно транспортируется внутрь клетки [35] и, в отличие от этанола, усваивается клетками G. sulphuraria в концентрации вплоть до 17% [12]. Возможности усвоения глюкозы при фотогетеротрофии, как показано в настоящей работе, в несколько раз превышают возможности потребления этанола (рис. 3). Быстрое расходование глюкозы как субстрата при концентрации 0.1% происходит еще до окончания срока эксперимента (рис. 6), так как одновременно с обеспечением роста клеток часть глюкозы запасается впрок в форме багрянкового крахмала [27].

 

Рис. 7. Схема, отражающая баланс между дыханием и фотосинтезом (см. в текст).

 

Сопоставление данных по фотоавтотрофному, фотогетеротрофному и темновому гетеротрофному росту G. sulphuraria [36–38] показало, что ингибирование фотосинтетического аппарата глюкозой при выращивании G. sulphuraria в темноте в значительной мере снимается при фотогетеротрофии [37–39]. Образующийся при окислении глюкозы углекислый газ транспортируется из митохондрий в хлоропласты, где используется в фотосинтезе. В присутствии этанола интенсификация фотосинтеза, происходящая вслед за возрастанием клеточного дыхания, также может объясняться дополнительным использованием клеткой в фотосинтетическом процессе углекислого газа, образующегося при дыхании.

Наиболее вероятной причиной возможного потребления этанола на свету после периода адаптации к вызванному им стрессу является световая активация АДГ и ацетальдегиддегидрогеназы как ферментов, отвечающих за усвоение этанола при поступлении в клетку. Потребление этанола, выгодное энергетически, одновременно приводит к снижению внутриклеточной концентрации и стрессового воздействия этанола.

***

ВКЛАД АВТОРОВ. Авторы принимали равное участие в экспериментах, написании и редактировании рукописи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ. Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 122042700044-6).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ НОРМ. Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных с использованием людей или животных в качестве объектов.

About the authors

Yu. V. Bolychevtseva

Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: bolychev1@yandex.ru

Bach Institute of Biochemistry

Russian Federation, Moscow, 119071

I. N. Stadnichuk

Timiryasev Institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences

Email: bolychev1@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 127726

References

Supplementary files