Optimization of biosynthesis of butyric acid from glucose through the inverted fatty acid β-oxidation pathway by recombinant Escherichia coli strains

Full Text

Масляная кислота это четырехуглеродная монокарбоновая кислота, имеющая широкое применение в различных отраслях промышленности, в том числе лакокрасочной, химической, фармацевтической и пищевой [1]. Эфиры масляной кислоты, в первую очередь этиловый и бутиловый, помимо традиционного использования в косметических композициях, могут служить компонентами биотоплив [2], а продукт восстановления масляной кислоты – бутанол – в качестве прямой замены бензина [3]. В настоящее время масляную кислоту получают нефтехимическим синтезом при окислении производного от пропилена масляного альдегида [4]. Однако масляная кислота также может быть получена из возобновляемого растительного сырья посредством микробиологического синтеза. Природными продуцентами масляной кислоты являются строгие анаэробы, принадлежащие к родам Clostridium, Butyrvibrio, Butyribacterium, Eubacterium, Fusobacterium Megasphera и Sarcina [5]. Наибольшей продуктивностью среди них отличаются штаммы С. butyricum, С. beijerinckii, С. acetobutylicum, С. tyobutyricum [4]. Тем не менее, биосинтетические характеристики как природных продуцентов, так и их оптимизированных производных не позволяют в настоящее время реализовать экономически оправданное биотехнологическое производство масляной кислоты [6]. Это обусловило интерес к созданию неприродных продуцентов масляной кислоты с использованием традиционных для промышленной биотехнологии и удобных для направленной инженерии микроорганизмов, в первую очередь Escherichia coli [7]. В норме, E. coli не обладает способностью к синтезу масляной кислоты при утилизации стандартных источников углерода. В данной связи, для обеспечения биосинтеза целевого соединения в клетках этой бактерии экспрессировали те или иные наборы чужеродных генов, включающие гены 3-гидроксибутирил-КoA дегидрогеназы (КФ 1.1.1.157), hbd, 3-гидроксибутирил-КoA дегидратазы (КФ 4.2.1.55), crt, клостридий, транс-еноил-КоА редуктазы (КФ 1.3.1.44) Treponema denticola, ацетил-КоА ацетилтрансферазы (КФ 2.3.1.9), phaA, и ацетоацетил-КоА редуктазы (КФ 1.1.1.36), phaB, Cupriavidus necator [8–10]. Однако, было показано, что в результате изменения регуляции экспрессии отдельных генов ato-оперона и fad-регулона, E. coli способна продуцировать масляную кислоту в результате функционального обращения природного пути β-окисления жирных кислот (БОЖК) [11]. Тем не менее, уровни синтеза масляной кислоты соответствующими мутантными и направленно сконструированными штаммами были крайне невысоки [11, 12].

Цель работы – оптимизация биосинтеза масляной кислоты из глюкозы по обращенному пути β-окисления жирных кислот рекомбинатными штаммами Escherichia coli.

Методика

Реактивы. В работе использовали рестриктазы, ДНК полимеразу Taq, Т4 ДНК лигазу (“Thermo Scientific”, Литва), высокоточную ДНК полимеразу Q5 (“New England Biolabs”, США) и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (“Agillent Technologies”, США). ПЦР-продукты очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (“Qiagen”, США). Компоненты питательных сред, соли и другие реактивы были производства “Panreac” (Испания) и “Sigma” (США).

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды. Штамм E. coli K-12 MG1655 (ВКПМ B-6195), ранее сконструированный штамм E. coli MG Δ4 P_L-tesB ΔyciA [13], лишенный путей смешанно-кислотного брожения и активности неспецифичной тиоэстеразы YciA, с усиленной экспрессией гена тиоэстеразы II, а также штамм BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI [12], с дополнительно измененной регуляцией экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты аэробного b-окисления жирных кислот и еноил-АПБ-редуктазу, были использованы в качестве исходных для конструирования всех полученных в работе рекомбинантов. Использованные в работе бактериальные штаммы и плазмиды представлены в табл. 1. Для культивирования бактерий применяли богатую среду LB и минимальную среду М9 [14], c добавлением, при необходимости, ампициллина (100 мкг/мл) или хлорамфеникола (30 мкг/мл).

 

Таблица 1. Штаммы и плазмиды, сконструированные и использованные в работе.

Объект	Генотип	Ссылка
Штамм:
MG1655	Штамм E. coli дикого типа (ВКПМ B-6195)	ВКПМ
MG∆4 PL-tesB ΔyciA	E. coli MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA	[13]
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI	E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI	[12]
MG∆4 PL-tesB ΔyciA PL-ppsA	E. coli MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, PL-SDj10-ppsA	Данная работа
MG∆4 PL-tesB ΔyciA ΔatpFH	E. coli MG1655 ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, ∆atpFH	Данная работа
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI PL-ppsA	E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, PL-SDj10-ppsA	Данная работа
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI ΔatpFH	E. coli MG1655 lacIQ, ∆ackA-pta, ∆poxB, ∆ldhA, ∆adhE, PL-SDj10-atoB, Ptrc-ideal-4-SDj10-fadB, ∆fadE, PL-SDj10-tesB, ∆yciA, Ptrc-ideal-4-SDj10-fabI, ∆atpFH	Данная работа
Плазмида:
pMW118m-atoB-fadB	pMW118, Ptrc-ideal-2-SDlacZ-atoB-fadB-TrrnB	[13]
pBOX1	pMW118, Ptrc-ideal-2-SDlacZ-atoB-fadB-fadE-TrrnB	Данная работа
pBOX2	pMW118, Ptrc-ideal-2-SDlacZ-atoB-fadB-fabI-TrrnB	Данная работа

 

Конструирование штаммов и плазмид. Целевые штаммы, производные штаммов MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA и BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI, с инактивированными генами atpFH и природной регуляторной областью гена ppsA замененной искусственным генетическим элементом P_L-SD_j10, были получены с помощью P1-зависимых трансдукций [14] с использованием ранее полученных препаратов трансдуцирющих фагов, содержащих соответствующие маркированные модификации [15, 16].

Плазмиды pMW118m-atoB-fadB-fadE и pMW118m-atoB-fadB-fabI, содержащие под контролем промотора P_trc-ideal-2 гены ферментов, способных катализировать полный каскад реакций обращенного БОЖК, и обозначенные как pBOX1 и pBOX2, были сконструированы на основе плазмиды pMW118m-atoB-fadB по ранее описанной схеме [13]. Гены fadE и fabI, кодирующие ацил-КоА дегидрогеназу и еноил-ACP редуктазу, способные катализировать финальные реакции целевого биохимического пути, первоначально были клонированы в составе вектора pUC18. С этой целью кодирующие области соответствующих генов были амплифицированы с помощью ПЦР с использованием пар специфических праймеров и хромосомной ДНК штамма E. coli MG1655 в качестве матрицы. Дизайн праймеров предполагал, что в результате подобной амплификации кодирующие области генов будут дополнительно содержать на флангах сайты узнавания BglII и BamHI, расположенные, соответственно, непосредственно после старт- и непосредственно перед стоп- кодоном, а также сайты узнавания SalI, расположенные на 5'-концах и сайты узнавания XhoI и KpnI, расположенные на 3'-концах ампликонов. Полученные фрагменты ДНК были, впоследствии, клонированы в составе вектора pUC18 по сайтам SalI и KpnI и секвенированы. Природные сайты узнавания BamHI и AatII, расположенные в кодирующей области гена fadE были далее элиминированы в результате трехстадийного сайт-направленного мутагенеза с использованием QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (“Agillent Technologies”, США). С использованием соответствующих pUC-производных плазмид, содержащих корректные последовательности генов fadE и fabI, и рестрикционных сайтов AatII, SalI и XhoI были получены целевые плазмиды pBOX1 и pBOX2, производные pMW118m-atoB-fadB, в которых исходная бицистронная конструкция atoB-fadB была трансляционно сопряжена с генами fadE или fabI соответственно. Трансформацию рекомбинантных штаммов плазмидами pBOX1 и pBOX2 осуществляли по стандартной методике.

Культивирование штаммов. Рекомбинантные штаммы выращивали в течение ночи в среде М9, содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°C. Для микроаэробного культивирования по 5 мл полученных ночных культур разбавляли в 10 раз, добавляя 45 мл среды М9, содержащей 15 г/л глюкозы и 10 г/л дрожжевого экстракта. Полученные культуры инкубировали в колбах объемом 750 мл, закрытых ватными пробками на роторной качалке при 250 об./мин в течение 12 ч при 37°C. Насыщение среды кислородом оценивали в контрольных колбах с соответствующими культурами при инкубации в присутствии резазурина. Экспрессию генов, находящихся под контролем LacI-зависимых промоторов P_trc-ideal-4 и P_trc-ideal-2, индуцировали спустя 3 ч от начала инкубации, добавляя в среды культивирования изопропил-β-D-тиогалактозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1.0 мМ.

Клеточные суспензии центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин и в полученных супернатантах определяли концентрации секретированных метаболитов и остаточной глюкозы. Все эксперименты повторялись не менее трех раз.

Аналитические методы. Концентрации органических кислот в культуральных жидкостях, освобожденных от биомассы центрифугированием, определяли методом ВЭЖХ с использованием системы “Waters” HPLC system (США). Применяли ион-эксклюзионную колонку Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) (“Phenomenex”, США) с детекцией при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы использовали 2.5 мМ водный раствор серной кислоты со скоростью потока 0.5 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы, система была укомплектована рефрактивным детектором “Waters” 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (“Waters”, США). Подвижной фазой служила смесь ацетонитрил-вода в соотношении 75/25 об./об. при скорости потока 1.0 мл/мин.

Количественный анализ содержания масляной кислоты в культуральных жидкостях осуществляли методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием. Использовали газовый хроматограф GC-2010 Plus (“Shimadzu”, Япония), укомплектованный капиллярной колонкой Stabilwax-DA (“Restek”, США) длинной 30 м с внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки 0.25 мкм. Газом-носителем служил гелий при постоянной объемной скорости 1.2 мл/мин. Пробы, объемом 0.5 мкл, вводили в испаритель в режиме деления потока 1 : 20. Температура испарителя и пламенно-ионизационного детектора составляла 150°C и 250°C соответственно. Термостат колонки был запрограммирован следующим образом: начальная изотерма – 2 мин при 90°C с последующим линейным градиентом до 200°C со скоростью 10°C/мин и конечной изотермой – 2 мин при 200°C.

Результаты и их обсуждение

Первичные реакции обращенного БОЖК включают в себя инициирующую конденсацию двух молекул ацетил-КоА, с формированием ацетоацетил-КоА, последующее восстановление кето-интермедиата в 3-гидроксибутирил-КоА, его дегидрирование до кротонил-КоА и последующее восстановление ненасыщенной связи, ведущее к бутирил-КоА. Таким образом, при гидролизе тиоэфирной связи бутирил-КоА под действием тиоэстеразы, конечным продуктом однократного обращения БОЖК будет являться масляная кислота. В норме, в клетках E. coli реакции БОЖК катализируются ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазой (КФ 2.3.1.9/16), бифункциональной (S)-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназой/еноил-КоА-редуктазой (КФ 1.1.1.35/КФ 4.2.1.17) и ацил-КоА дегидрогеназой (КФ 1.3.8.-) [17]. Однако, было показано, что в определенных условиях еноил-АЦП редуктаза FabI (КФ 1.3.1.9), принимающая участия в биосинтезе липидов, может также проявлять ацил-КоА дегидрогеназную активность, обеспечивая эффективное функциональное обращение БОЖК [18]. Так, ранее сконструированные штаммы BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI с измененной регуляцией экспрессии гена тиоэстеразы II и генов, кодирующих ферменты способные к катализу реакций обращенного БОЖК, синтезировали масляную кислоту из глюкозы при формировании бутирил-КоА под действием как ацил-КоА дегидрогеназы FadE, так и еноил-АЦП редуктазы FabI [12]. Вместе с тем, количества целевого продукта, анаэробно синтезированные рекомбинантами, были невысоки и составляли лишь ~511 мкМ и ~471 мкМ соответственно. В первую очередь это было связано, по-видимому, с низкой активностью ацил-КоА дегидрогеназ при хромосомной экспрессии в клетках единичных копий соответствующих генов. При этом, поскольку штаммы BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI были лишены путей смешанно-кислотного брожения, невозможность эффективного реокисления гликолитически сформированного НАДН в реакциях обращенного БОЖК ограничивала, в свою очередь, потребление рекомбинантами глюкозы в отсутствие аэрации. В настоящем исследовании, для обеспечения возможности эффективного протекания в клетках реакций обращенного БОЖК, гены ключевых ферментов пути и еноил-АЦП редуктазы были экспрессированы в базовых штаммах в составе плазмид. В качестве базового использовался штамм MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA, также как и штаммы BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI лишенный путей смешанно-кислотного брожения, активности неспецифичной тиоэстрезы YciA и экспрессирующий ген тиоэстеразы II под контролем сильного конститутивного промотора.

При экспрессии в штамме MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA целевых генов в составе плазмид, соответствующие рекомбинанты, MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX1) и MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX2), синтезировали при микроаэробной утилизации глюкозы ~4.0 мМ и ~12.9 мМ масляной кислоты соответственно, с молярными выходами, составляющими 9.3% и 30.7% (табл. 2). Таким образом, продукция целевого вещества штаммом, формирующим бутирил-КоА под действием еноил-АЦП редуктазы FabI, в три раза превосходила соответствующие показатели, демонстрируемые штаммом, образующим данный тиоэфир под действием ацил-КоА дегидрогеназы FadE. Это, по-видимому, могло являться следствием разной кофакторной специфичности указанных ферментов. В то время как еноил-АЦП редуктаза FabI является НАДН-зависимой, ацил-КоА дегидрогеназа FadE использует в качестве кофактора FADH₂ и др. Соответственно, при утилизации глюкозы еноил-АЦП редуктаза может использовать в качестве восстановленных эквивалентов гликолитически сформированный НАДН непосредственно, тогда как формирование FADH₂ требует вспомогательного действия флавин редуктазы (КФ 1.5.1.37). Таким образом, как в анаэробных, так и в микроаэробных условиях внутриклеточная активность ацил-КоА дегидрогеназы могла зависеть не только от количества соответствующих белковых молекул и доступности восстановленных эквивалентов, но и лимитироваться неоптимальным действием флавин редуктазы. Тем не менее, уровни синтеза масляной кислоты штаммами MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX1) и MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX2) значительно превосходили таковые, продемонстрированные ранее их аналогами, штаммами BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fadE и BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI, экспрессирующими гены atoB, fadB и fadE/fabI в составе хромосомы. Это подтверждало предположение о необходимости обеспечения высоких уровней экспрессии целевых генов для эффективного функционирования обращенного БОЖК в клетках рекомбинантных штаммов. Интересно отметить, что штамм MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pMW118m-atoB-fadB), экспрессирующий в составе плазмиды лишь гены ацетил-КоА-С-ацетилтрансферазы и 3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы/еноил-КоА-редуктазы, синтезировал в результате частичного однократного обращения БОЖК 3-гидроксимасляную кислоту из глюкозы с молярным выходом 38% [13]. 3-гидроксибутирил-КоА, из которого формировалась 3-гидроксимасляная кислота является не только субстратом для тиоэстеразы, но и интермедиатом БОЖК – предшественником бутирил-КоА. Таким образом, дополнительная экспрессия в составе плазмиды гена еноил-АЦП редуктазы FabI, приводящая к синтезу штаммом MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX2) масляной кислоты с выходом ~31%, обеспечивала в рекомбинанте эффективную конкуренцию между гидролизом 3-гидроксибутирил-КоА и его восстановлением в последующих реакциях БОЖК, способствуя практически количественному туннелированию соответствующего интермедиата пути в сторону формирования бутирил-КоА. Соответственно, если в штамме MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX1) продукция масляной кислоты лимитировалось, по-видимому, недостаточной активностью ацил-КоА дегидрогеназы или флавин редуктазы, то в случае штамма MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX2) данная лимитация была обусловлена другими причинами.

 

Таблица 2. Концентрации потребленного субстрата и метаболитов, секретированных исследованными штаммами при микроаэробной утилизации глюкозы*

Штамм	Глюкоза, мМ	Пировиноградная кислота		Уксусная кислота		Янтарная кислота		Масляная кислота
		мМ	моль/моль, %	мМ	моль/моль, %	мМ	моль/моль, %	мМ	моль/моль, %
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pBOX1)	42.5 ± 2.3	21.1 ± 1.0	49.7	12.1 ± 0.8	28.4	2.8 ± 0.2	6.6	4.0 ± 0.3	9.3
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA (pBOX2)	42.2 ± 2.0	20.6 ± 1.2	48.8	4.6 ± 0.6	11.0	0.5 ± 0.1	1.2	12.9 ± 1.0	30.7
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA PL-pps (pBOX1)	55.8 ± 2.9	27.0 ± 1.6	48.4	16.1 ± 1.2	28.8	2.5 ± 0.1	4.5	6.0 ± 0.4	10.8
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA PL-pps (pBOX2)	56.4 ± 3.2	23.8 ± 1.4	42.2	0.2 ± 0.1	0.3	–	–	22.2 ± 1.6	39.5
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX1)	63.2 ± 3.5	31.6 ± 1.8	50.0	18.0 ± 1.1	28.5	2.4 ± 0.1	3.8	7.1 ± 0.5	11.2
MGΔ4 PL-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX2)	64.1 ± 3.3	19.5 ± 1.1	30.5	–	–	–	–	29.6 ± 1.9	46.2
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI	42.0 ± 2.2	20.4 ± 1.2	48.6	12.6 ± 1.0	30.0	5.0 ± 0.3	11.9	0.5 ± 0.1	1.1
BOX3.3 Δ4 Ptrc-id-4-fabI ΔatpFH	62.8 ± 3.0	29.9 ± 1.6	47.6	18.5 ± 1.4	29.5	7.4 ± 0.4	11.8	1.2 ± 0.1	1.8

* Приведены стандартные отклонения для трех независимых экспериментов.

 

При микроаэробной утилизации глюкозы, штаммы MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX1) и MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX2) потребляли не весь доступный субстрат, секретируя в качестве основного продукта пировиноградную кислоту с выходами, составляющими практически 50% (табл. 2). Можно было предположить, что секреция пировиноградной кислоты, как и основное потребление глюкозы штаммами, имели место на начальных этапах культивирования при достаточно высоком уровне кислорода в среде, тогда как синтез масляной кислоты по обращенному БОЖК активировался при снижении аэрации и интенсивности реокисления НАДН посредством дыхания. Реакции обращенного БОЖК, приводящие к формированию 3-гидроксибутирил-КоА и бутирил-КоА, являются НАДН-потребляющими. При этом, гликолиз подавляется избыточными внутриклеточными уровнями как НАДН, так и АТФ [19, 20]. Снижение уровня аэрации повышает доступность НАДН эквивалентов для реакций обращенного БОЖК, но уменьшает потребность культуры в АТФ. Поэтому, при выраженной кислородной лимитации, способствующей синтезу масляной кислоты с точки зрения окислительно-восстановительного баланса, избыточные уровни АТФ могли приводить к замедлению гликолиза и падению потребления штаммами глюкозы, снижая интенсивность формирования как необходимых для синтеза целевого вещества метаболитов-предшественников, так и восстановленных эквивалентов.

Основные подходы, направленные на снижение внутриклеточного уровня АТФ и интенсификацию гликолитического потока углерода в рекомбинантных штаммах E. coli, включают манипуляцию компонентами (F₁F₀) H⁺-АТФ синтазного комплекса и активацию футильных циклов [21]. Так, в частности, разобщение мембранно-связанной F₀ и цитоплазматической F₁ субъединиц (F₁F₀) H⁺-АТФ синтазного комплекса приводит не только к активации цитоплазматической АТФазы, но и к прекращению генерации АТФ за счет окислительного фосфорилирования. В качестве примера футильного цикла, снижающего общеклеточный уровень АТФ за счет разницы в формировании и потреблении этого кофактора в разнонаправленных реакциях, может быть рассмотрен цикл пировиноградная кислота – фосфоенолпируват – пировиноградная кислота. При утилизации клетками гликолитических субстратов, пируваткиназа (КФ 2.7.1.40), катализирующая прямую реакцию цикла, ответственна за АДФ-зависимое дефосфорилирование фосфоенолпирувата в пировиноградную кислоту с образованием молекулы АТФ, а фосфоенолпируватсинтаза (КФ 2.7.9.2), фосфорилирующая пировиноградную кислоту в фосфоенолпируват, использует АТФ как кофактор, расщепляя его до АМФ. Регенерация АМФ в АТФ, с участием аденилаткиназы (КФ 2.7.4.3), расходует, при этом, два АТФ, обуславливая общую потерю одного АТФ в результате действия соответствующего футильного цикла. Данные подходы ранее успешно применялись для улучшения потребления субстрата и продукции целевых веществ рекомбинантными штаммами E. coli как в условиях аэрации, так и при анаэробиозе [22, 23]. В настоящем исследовании каждый из них был использован для улучшения продукции штаммами MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX1) и MGΔ4 P_L-tesB ΔyciA (pBOX2) масляной кислоты из глюкозы в микроаэробных условиях.

Активность футильного цикла пировиноградная кислота – фосфоенолпируват – пировиноградная кислота была обеспечена в штаммах при усилении экспрессии гена фосфоенолпируватсинтазы, ppsA. Потребление глюкозы соответствующими производными, MG∆4 P_L-tesB ΔyciA P_L-ppsA (pBOX1) и MG∆4 P_L-tesB ΔyciA P_L-ppsA (pBOX2), возросло, по сравнению с родительскими штаммами, в 1.3 раза (табл. 2). При этом, в случае штамма MG∆4 P_L-tesB ΔyciA P_L-ppsA (pBOX1), формирующего бутирил-КоА под действием ацил-КоА дегидрогеназы FadE, выход масляной кислоты повышался лишь незначительно, с 9.3% до 10.8%, тогда как штамм MG∆4 P_L-tesB ΔyciA P_L-ppsA (pBOX2) синтезировал целевой продукт с выходом, выросшим практически на треть – до 39.5%. Соответствующе повышение выхода масляной кислоты, пропорциональное увеличению потребления штаммом MG∆4 P_L-tesB ΔyciA P_L-ppsA (pBOX2) глюкозы, указывало на то, что продукция целевого вещества штаммом возросла, в первую очередь, в результате большей доступности для обращенного БОЖК восстановленных эквивалентов и метаболитов предшественников. Действительно, титр синтезированной штаммом масляной кислоты возрастал за счет прекращения секреции янтарной кислоты, выраженного снижения формирования уксусной кислоты и некоторого падения накопления пировиноградной кислоты (табл. 2). Это свидетельствовало об интенсификации потока углерода от пировиноградной кислоты к ацетил-КоА, через реакцию катализируемую НАДН-генерирующей пируватдегидрогеназой, с последующим туннелированием соответствующего КоА-производного в реакции обращенного БОЖК, эффективно потребляющие этот тиоэфир за счет возросшей доступности гликолитического НАДН. Ограниченный рост синтеза масляной кислоты штаммом MG∆4 P_L-tesB ΔyciA P_L-ppsA (pBOX1) свидетельствовал, таким образом, о правомочности предположения относительно неоптимальной активности в штамме ацил-КоА дегидрогеназы и/или флавин редуктазы.

При разобщении компонентов H⁺-АТФ синтазного комплекса, за счет делеции генов atpFH, потребление глюкозы штаммами MG∆4 P_L-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX1) и MG∆4 P_L-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX2) возрастало в 1.5 раза по отношению к исходным рекомбинантам с интактным комплексом (табл. 2). Продукция масляной кислоты штаммом MG∆4 P_L-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX1) продолжала оставаться ограниченной, и выход целевого продукта возрастал лишь до 11.2%. Штамм MG∆4 P_L-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX2) секретировал практически 30 мМ масляной кислоты с выходом из глюкозы, возросшим до ~46%. При этом, соответствующее вещество становилось основным продуктом утилизации углеродного субстрата, в то время как единственным детектированным побочным продуктом оставалась пировиноградная кислота, выход которой из глюкозы падал до 30%. Соответственно, выраженное снижение внутриклеточного уровня АТФ вследствие прекращения его формирования при окислительном фосфорилировании и принудительном гидролизе цитоплазматической АТФазой, в большей степени способствовало интенсификации потока углерода через гликолиз и реакции обращенного БОЖК, нежели опосредованное интерконверсией пировиноградная кислота – фосфоенолпируват. Вместе с тем, остаточная секреция штаммом пировиноградной кислоты, предполагающая возможность дальнейшего увеличения степени конверсии субстрата в целевой продукт, указывала на то, что при исключении АТФ-опосредованного торможения гликолиза, часть гликолитически сформированных НАДН-эквивалентов реокислялась посредством дыхания, оставаясь недоступными для реакций обращенного БОЖК. Это свидетельствовало о том, что для оптимизации микроаэробного биосинтеза масляной кислоты из глюкозы сконструированными штаммами необходимо соблюдение определенного баланса между окислительно-восстановительным и энергетическим статусами клетки. Очевидно, что оба параметра, зависящие от степени аэрации, могут быть подвержены тонкой регуляции при культивировании рекомбинантов в контролируемых условиях в биореакторах. Это предполагает проведение дальнейших экспериментов по масштабированию процесса микробиологического синтеза целевого вещества с использованием штаммов, сконструированных в данном исследовании.

Следует отметить, что позитивный эффект форсированного гидролиза АТФ на микроаэробный биосинтез масляной кислоты из глюкозы, в ходе вышеописанных экспериментов, был наиболее четко продемонстрирован в штамме MG∆4 P_L-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX2). Однако повышенная экспрессия даже нативных генов в составе плазмид, в общем случае, приводит к повышенной нагрузке на клетки рекомбинантного штамма-продуцента. Поэтому, соответствующий эффект оценивали также в штамме BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI, экспрессирующим гены ферментов ответственных за катализ реакции обращенного БОЖК в составе хромосомы.

При инактивации генов atpFH, потребление глюкозы штаммом BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI ΔatpFH возрастало аналогично таковому, продемонстрированному штаммами MG∆4 P_L-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX1) и MG∆4 P_L-tesB ΔyciA ΔatpFH (pBOX2). Вместе с тем, степень конверсии рекомбинантом глюкозы в секретированные метаболиты практически не отличалась от показателей контрольного штамма BOX3.3 Δ4 P_trc-id-4-fabI, а синтез масляной кислоты сохранялся на крайне низком уровне (табл. 2). В совокупности это указывало на необходимость совместного обеспечения благоприятного метаболического статуса клетки и повышенного уровня экспрессии ключевых генов для достижения возросших уровней синтеза масляной кислоты из глюкозы направленно сконструированными штаммами E. coli.

В итоге, в результате проведенного исследования, сконструированы штаммы E. coli способные к эффективному биосинтезу масляной кислоты из глюкозы по обращенному БОЖК. Повышенные уровни конверсии субстрата в целевой продукт достигнуты при экспресии в базовых штаммах генов ферментов, ответственных за катализ реакций обращенного БОЖК, в составе плазмид. Показано позитивное влияние на биосинтез штаммами целевого соединения форсированного гидролиза АТФ. Стратегия дальнейшего улучшения параметров микробиологического синтеза масляной кислоты с использованием сконструированных бутират-продуцирующих штаммов предполагает необходимость оптимизации процесса в контролируемых условиях аэрации.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда (проект № 22-14-00040).

About the authors

A. Yu. Gulevich

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: andrey.gulevich@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 117312

A. Yu. Skorokhodova

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: andrey.gulevich@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 117312

V. G. Debabov

Federal Research Centre “Fundamentals of Biotechnology” of the Russian Academy of Sciences

Email: andrey.gulevich@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 117312

References

Supplementary files