Биосинтез метионина в микроорганизмах: о-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза – основной фермент пути прямого сульфгидрилирования (обзор)

Полный текст

Метионин является незаменимой протеиногенной аминокислотой, уникальные функции которой заключаются в биосинтезе серосодержащих соединений, инициации трансляции [1]. Большинство микроорганизмов могут синтезировать метионин, в то время как животные, включая людей, зависят от внешних источников метионина [2]. Как основная серосодержащая аминокислота, метионин является предшественником всех других серосодержащих аминокислот и их производных, таких как гомоцистеин и глутатион [3]. Метионин является ключевым компонентом одноуглеродного метаболизма, а в форме своего производного S-аденозилметионина является метильным донором в эпигенетической регуляции и процессах детоксикации [4].

В современном обществе метионин стал массовым товаром в мировой экономике – ежегодно производится более 1 млн тонн метионина из нефти для обогащения кормов для скота, что является третьим показателем в мире после глутаминовой кислоты и лизина. Синтетическое производство способствует производству дешевого животного белка и оказывает прямое влияние на здоровье человека и экосистемы [5]. Однако 95% такого синтетически получаемого метионина образуется в виде D, L-смеси изомеров. Для решения проблемы рацемического синтеза перспективно изучение ферментов, участвующих в метаболизме метионина, для разработки биотехнологических методов синтеза метионина путём рационального редизайна ферментов и потенциального получения суперпродуцента [6].

Метаболический путь биосинтеза метионина в бактериях наиболее подробно охарактеризован у Escherichia coli [7, 8]. В клетках E. coli предшественник метионина гомоцистеин синтезируется по пути транссульфурилирования из О-сукцинил-L-гомосерина в две стадии (рис. 1), катализируемые цистатионин γ-синтазой (CGS, КФ 2.5.1.48) и цистатионин β-лиазой (CBL, в настоящее время включена в КФ 4.4.1.13, цистеин-S-конъюгат β-лиаза). В большинстве классов бактерий, в отличие от E. coli, преобладающим является путь прямого сульфгидрилирования (рис. 1), либо используются оба пути [9], что обеспечивает метаболическую гибкость и адаптивность микроорганизмов. Функциональность обоих путей подробно исследована у таких бактерий как Pseudomonas aeruginosa [10], P. putida [11], Corynebacterium glutamicum [12–14], Leptospira meyeri [15, 16], Thermus thermophilus [17, 18], Streptococcus anginosus [19]. Анализ геномов выявил, что транссульфурилирование, как единственный путь биосинтеза метионина, присутствует в основном в протеобактериях [9].

 

Рис. 1. Биосинтез метионина в микроорганизмах.

 

О-ацетилгомосерин-аминокарбоксипропилтрансфераза катализирует прямое сульфгидрилирование О-ацетил-L-гомосерина (OAH). Предшествующее название – О-ацетилгомосерин(тиол)-лиаза – было основано на ее первоначальной классификации (КФ 4.2.99.10). Позднее Комиссия по ферментам определила его в класс трансфераз (КФ 2.5.1.49) [20]. В настоящее время общепринятыми названиями являются О-ацетилгомосерин-аминокарбоксипропилтрансфераза и О-ацетилгомосерин-сульфгидрилаза [21]. Микроорганизмы используют О-ацетилгомосерин-сульфгидрилазу (OAHS) для катализа образования предшественника L-метионина – L-гомоцистеина из О-ацетил-L-гомосерина и бисульфида или для прямого синтеза L-метионина с использованием метантиола (рис. 2). В некоторых микроорганизмах, например у Bacillus subtilis и E. coli, CGS может действовать как сульфгидрилаза с использованием в качестве субстрата как О-ацетилL-гомосерина, так и О-сукцинил-L-гомосерина [22, 23]. Данные о разнообразии бактериальных путей биосинтеза метионина важны для понимания жизнедеятельности и эволюции бактерий, а также могут быть использованы в микробной биотехнологии. За последние годы возросла активность исследований в области ферментативного получения аминокислот [6]. На сегодняшний день является актуальным получение L-метионина в промышленных масштабах методом ферментативного синтеза с применением ферментов, участвующих в метаболизме серы [24].

В настоящем обзоре собраны данные о каталитических свойствах OAHS из различных микробных источников, обсуждается механизм ферментативной реакции и роль отдельных аминокислотных остатков активного центра с учетом анализа имеющихся в международных базах кристаллографических структур фермента и данных мутагенеза.

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

OAHS является пиридоксаль-5'-фосфат (ПЛФ)-зависимым ферментом, который катализирует реакцию γ-замещения О-ацетилL-гомосерина с использованием сульфидиона с образованием L-гомоцистеина и ацетата (рис. 2). Один из ферментов альтернативного пути транссульфурилирования, CGS, катализирует сходную реакцию γ-замещения, используя в качестве субстрата О-сукцинил-L-гомосерин или, в условиях отсутствия О-сукцинил-Lгомосерина, О-ацетил-L-гомосерин, и L-цистеин в качестве источника серы [25]. OAHS из большинства микробных источников являются строго специфичными к О-ацетил-L-гомосерину и не катализируют реакцию γ-замещения О-сукцинилL-гомосерина [26, 27], либо катализируют со скоростями, на несколько порядков ниже, чем скорость основной реакции [10, 18, 28]. Также фермент не может использовать в качестве источника серы L-цистеин [29]. Источник серы, используемый OAHS в процессе биосинтеза метионина, может отличаться у разных организмов. Например, у OAHS из Wolinella succinogenes источником серы является тиокарбоксилат белка, так что атом серы метионина включается OHSS с использованием белка-переносчика серы, а не сульфида, как это имеет место у других OAHS [30]. В качестве источника серы фермент может использовать так же меркаптоэтанол, метилмеркаптан, этилмеркаптан [26, 31, 32]. Кроме того, в реакции γ-замещения О-ацетил-L-гомосерина, катализируемой OAHS, в качестве присоединяемого нуклеофила может выступать азид, как в OAHS из C. glutamicum [33] или диселенид, как в ферменте из дрожжей [34]. В литературе имеются ограниченное количество данных о каталитических параметрах реакции γ-замещения О-ацетил-L-гомосерина, катализируемой OAHS из различных источников (табл. 1). Сродство к субстрату у разных ферментов варьируется в широком диапазоне в зависимости от микроорганизма (0.004–8.0 мМ). Кинетические параметры реакции (k_кат и k_кат/K_M) были определены только для четырех очищенных ферментов, наибольшую скорость реакции проявлял фермент из термофильной бактерии Termotoga maritima (табл. 1), при этом эффективность катализа была в 1.6 раз выше у OAHS из Сlostridium difficile за счет меньшей величины K_m. Ферменты из другой термофильной бактерии T. thermophilus также обладали высокой активностью (табл. 1). Сульфгидрилазная активность с О-ацетил-L-гомосерином и О-сукцинил-L-гомосерином была обнаружена в клеточных экстрактах P. putida и P. aeruginosa [10, 11]. Поскольку в данных бактериях присутствуют ферменты обоих путей биосинтеза метионина, активность с О-сукцинил-L-гомосерином может быть связана с наличием CGS, которая, как было отмечено выше, способна катализировать данную реакцию.

 

Рис. 2. Схема реакции γ-замещения, катализируемой OAHS.

 

Таблица 1. Кинетические параметры реакции γ-замещения О-ацетил-L-гомосерина, катализируемой OAHS из различных источников

Микроорганизм	Удельная активность*, мкмоль/мин мг	kкат, с–1	KM, мM	kкат/KM, M–1 с–1	Ссылка
T. thermophilius HB8 oah1	49.8 (рН 7.8, 70°C)	н.о.	6.8	н.о.	[18]
T. thermophilius HB8 oah2	67.7 (рН 7.8, 70°C)	н.о.	2.0	н.о.	[35]
B. stearothermophilus CN3	17.2 (рН 7.5, 45°C)	н.о.	1.9	н.о.	[26]
S. cerevisiae	10.5 (рН 7.8, 30°C)	н.о.	4.5 × 10–3	н.о.	[36]
N. crassa	4.2 (рН 8.0, 30°C)	н.о.	7.0 × 10–3	н.о.	[40]
Aspergillus nidulans	4.4 (рН 8.0, 30°C)	н.о.	н.о.	н.о.	[31]
L. meyeri	15.0 (рН 7.5, 30°C)	н.о.	н.о.	н.о.	[15]
C. glutamicum	6.0 (рН 7.5, 30°C)	28.0	6.4	4.4 × 103	[41]
T. maritima	1521.0 (рН 7.0, 70°C)	900.0	8.0	1.0 × 105	[28]
C. difficile	50.0 (рН 7.5, 25°C)	94.1	0.6	1.6 × 105	[27]
C. novyi	0.9 (рН 7.5, 25°C)	1.3	0.1	1.3 × 104	[37]

* Условия, при которых определяли активность, указаны в скобках; н. о. – не определяли.

 

Температурный оптимум OAHS из термофильных бактерий T. thermophilus и T. maritimа составил 70°C, B. stearothermophilus – 60°C [18, 26, 28, 35]. рН оптимум ферментов из различных источников находился в диапазоне 7.0–8.0 [18, 25, 28, 36–39].

МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ

ПЛФ-зависимые ферменты используют один и тот же кофактор для катализа различных реакций, поэтому промежуточные стадии катализа имеют много общего [42], при этом белковая матрица обеспечивает реакционную и субстратную специфичность этих ферментов. Механизмы, посредством которых ПЛФ-зависимые ферменты контролируют переходные состояния кофактора в процессе катализа, исследуются при помощи рентгеноструктурного анализа и сайт-направленного мутагенеза. Для ряда ПЛФ-зависимых ферментов, участвующих в биосинтезе L-метионина, были получены мутантные формы [23, 38, 43–45], исследование которых позволило сделать предположения о роли отдельных аминокислотных остатков в катализе. Анализ кинетических и спектральных свойств, а также имеющихся кристаллических структур ферментов и комплексов фермент-ингибитор позволяет сделать предположение о механизме реакций, катализируемых этими ферментами [42, 39, 46–50].

Предполагаемый механизм реакции γ-замещения, катализируемой OAHS, включает несколько стадий (рис. 4). В активном центре фермента ПЛФ, связанный с остатком лизина, образует внутренний альдимин (1). При связывании О-ацетил-L-гомосерина происходит образование внешнего альдимина (2). Последующий отрыв Сα-протона субстрата приводит к образованию хиноидного интермедиата (3), следствием протонирования С4′ˈ-атома кофактора является образование кетимина (4). Дальнейший отрыв Сβ-протона приводит к отщеплению ацетильной группы субстрата и образованию ключевого интермедиата ферментативной реакции – β,γ-ненасыщенного кетимина (6). Присоединение сульфид-иона к β,γ-ненасыщенному кетимину и последующий перенос протонов приводят к образованию второго хиноидного интермедиата (9), дальнейшее протонирование Сα-положения которого приводит к образованию внешнего альдимина (10) и высвобождению продукта реакции – гомоцистеина. Для протекания реакции необходимо участие каталитического основания фермента на стадии отрыва Cα- и Cβ-протонов субстрата и кислотный катализ на стадии элиминирования γ-заместителя. Для ряда ПЛФ-зависимых ферментов было сделано предположение, что каталитическим основанием является аминогруппа ПЛФ-связывающего остатка лизина [42]. Исследование мутантных форм OAHS из С. difficile c заменами остатков Y52 и Y107 на аланин и фенилаланин позволило сделать предположение, что Y107 может выполнять функцию общего кислотного катализатора на стадии элиминирования ацетата [45].

 

Рис. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей OAHS из Campylobacter jejuni (Cje; 4OC9), Mycobacterium marinum (Mma; B2HDS7), T. maritima (Tma; Q9WZY4), T. thermophilus (Tth1; Q5SK88 и Tth2; Q5SJ58), W. succinogenes (Wsu; Q7M9C8), Clostridium novyi (Cno; A0A5B8NEI4), Clostridium difficile (Cdi; A0A1L7H895), L. meyeri (Lme; P94890), M. tuberculosis (Mtu; L7N4M1), Saccharomyces cerevisiae (Sce; P06106). Консервативные остатки отмечены черным. Последовательности ферментов с известными 3D структурами отмечены вертикальной линией; треугольниками отмечены функциональные остатки активного центра.

 

Рис. 4. Предполагаемый механизм реакции γ-замещения, катализируемой OAHS.

 

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И РОЛЬ ОТДЕЛЬНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ

OAHS принадлежит к первому структурному классу ПЛФ-зависимых ферментов, подклассу CBL [42]. В настоящее время определены семь пространственных структур OAHS из пяти источников: T. thermophilus (pdb 2CTZ, 2CB1) [18], W. succinogenes (pdb 3RI6) [51], M. marinum (pdb 4KAM) [52], T. maritima (pdb 7KB0, 7KB1) [28] и C. jejuni (pdb 4OC9). Функциональной единицей фермента является димер (рис. 5), однако, как и многие ПЛФ-зависимые ферменты, OAHS существует в растворе в виде тетрамера или гексамера, что подтверждается как биохимическими, так и структурными данными [18, 27, 31, 36, 37, 51, 52]. Отдельный мономер представляет собой α/β белок, состоящий из 421–453 аминокислот, уложенных в 11–14 α-спиралей, несколько 3₁₀-спиралей и 11, 12 или 14 β-слоев (рис. 5). Мономер состоит из трех доменов, что характерно для всех ПЛФ-зависимых ферментов первого типа укладки, включая ферменты сульфурилирования, участвующие в биосинтезе метионина [42, 53]. Небольшой N-концевой домен состоит из двух α-спиралей, соединенных длинной петлей, способствует образованию тетрамера, а также совместно с аминокислотными остатками большого ПЛФ-связывающего домена соседней субъединицы формирует активный центр фермента. Большой ПЛФ-связывающий домен состоит из β-слоя, окруженного α-спиралями, и содержит большинство каталитических остатков активного центра (рис. 5, табл. 2), в том числе ковалентно связанный с ПЛФ остаток лизина, образующий внутренний альдимин. С-концевой домен содержит четырехслойную β-структуру, которая образует субстрат-связывающий карман в активном центре, закрытый α-спиралями. Активный центр OAHS, расположенный на границе раздела димеров, образован аминокислотными остатками обеих субъединиц, таким образом, молекула гомотетрамера содержит четыре активных центра (рис. 5).

 

Таблица 2. Роль остатков активного центра OAHS с известными 3D структурами

Функциональная роль	Микроорганизм*
	Cje	Mma	Tma	Tth1	Tth2	Wsu
	PDB код
	4OC9	4KAM	7KB1	2CTZ	2CB1	3RI6
Образует водородную связь с фосфатной группой ПЛФ. Предположительно участвует в обеспечении оптимального положения каталитического кофермент-связывающего остатка лизина на стадиях элиминирования C-α-протона и боковой группы субстрата	Y53	Y67	Y58	Y52	Y50	Y53
Образует водородную связь с фосфатной группой ПЛФ	R55	R69	R60	R54	R52	R55
Взаимодействуют с фосфатной группой ПЛФ атомами азота главной цепи	G83	G97	G88	G82	G80	G83
	M84	Q98	Q89	H83	Q81	M84
Фенольное кольцо копланарно кольцу ПЛФ. Стабилизирует пиридиновое кольцо ПЛФ через π-стэкинговое взаимодействие. Увеличивает электронно-акцепторный характер кофактора	Y108	Y122	Y113	Y107	F105	F108
Ориентирует положение Tyr108 (нумерация С. jejuni) в активном центре фермента	E151	E166	E157	E151	E147	E151
Образует солевой мостик с N1H атомом ПЛФ. Играет ключевую роль в стабилизации положительного заряда атома пиридина N1, тем самым повышая электрофильный характер кофактора	D180	D195	D186	D180	D176	D180
Ограничивает подвижность кольца ПЛФ (π-сигма взаимодействие с электронным кольцом кофактора). Азот амидной группы фиксирует положение боковой цепи Asp180 (нумерация С. jejuni), обеспечивая оптимальное расположение Asp180 для взаимодействия с N1H атомом пиридина	T182	T197	T188	T182	T178	T182
π-алкил взаимодействие с гидрофобной частью кольца ПЛФ, ограничивает подвижность кольца кофактора	V183	I198	V189	F183	F179	M183
Образуют водородные связи с фосфатной группой ПЛФ	S202	S217	S207	S203	S199	S202
	S204	T219	T209	T205	T201	T204
Образует внутренний альдимин с ПЛФ	K205	K220	K210	K206	K202	K205
Участвует в обеспечении оптимального положения каталитического кофермент-связывающего остатка лизина на стадиях элиминирования C-α-протона и боковой группы субстрата	N367	N379	N370	N366	N355	N352
Гуанидиновая группа аргинина взаимодействует с карбоксилатной группой субстрата	R402	R414	R405	R401	R390	R387

* Cje – C. jejuni, Mma – M. marinum, Tma – T. maritima, Tth – T. thermophilus, Wsu – W. succinogenes.

 

Рис. 5. Тетрамерная организация OAHS на примере структуры фермента из T. thermophilus (pdb код 2ctz).

 

Пространственные укладки известных структур OAHS схожи как между собой (рис. 6а), так и с пространственными укладками других ферментов подкласса CBL (рис. 6б), однако отличаются от последних уникальным фрагментом, состоящим из примерно 30 аминокислотных остатков [54], следующих после последнего β–листа ПЛФ-связывающего домена.

 

Рис. 6. Наложение полипептидных цепей (а) пространственных структур OASH из разных микроорганизмов: C. jejuni OAHS (pdb код 4OC9) – темно-синий, M. marinum OASH (pdb код 4KAM) – голубой, T. maritima OASH (pdb код 7KB1) – пурпурный, T. thermophilus OASH (pdb код 2CTZ) – зеленый, T. thermophilus OASH (pdb код 2CB1) – темно-зеленый, W. succinogenes OASH (pdb код 3RI6) – оранжевый; (б) пространственных структур ферментов подкласса CBL: T. maritima OASH (pdb код 7KB1) – оранжевый, Citrobacter freundii метионин γ-лиаза МГЛ (pdb код 2RFV) – темно-синий, Arabidopsis thaliana CBL (pdb код 1IBJ) – голубой, Nicotiana tabacum CGS (pdb код 1I41) – зеленый, S. cerevisiae цистатионин γ-лиаза (pdb код 1N8P) – пурпурный. Овалом выделен уникальный фрагмент, характерный для фермента OASH.

 

Вымачивание кристаллов OAHS из Thermotoga maritima в растворе О-ацетил-L-гомосерина приводило к образованию стабильного промежуточного продукта в активном центре фермента (6 на рис. 4), то есть в отсутствие сульфид-иона реакция не могла дойти до завершения и протекала до стадии образования β, γ-ненасыщенного кетимина [28]. В пространственной структуре комплекса OAHS с О-ацетил-L-гомосерином карбоксилат этого промежуточного интермедиата образует солевой мостик с боковой группой остатка R405 (рис. 7), Cβ- и Cγ-атомы располагаются в относительно просторном кармане на расстоянии около 3 Å от боковых цепей остатков K210 и Y58*. Для OAHS из Сlostridioides difficile было сделано предположение, что гомологичный остаток Y52* обеспечивает оптимальное положение ПЛФ-связывающего остатка K205 на стадиях отрыва Сα-протона и ацетата [45]. В структурно похожем ферменте CGS в отсутствие второго субстрата (L-цистеина) β, γ-ненасыщенный кетимин таутомеризуется в винилглициновый хиноидный интермедиат и далее в α-аминокротонат с последующим его гидролизом до α-кетобутирата и аммиака [25, 38, 39]. Согласно биохимическим данным, полученным для OAHS из нескольких источников, фермент не катализирует побочную реакцию γ-элиминирования О-ацетил-L-гомосерина [26, 27, 37, 40], что подтверждается и кристаллографическими данными о наличии стабильного β,γ-ненасыщенного кетимина (6 на рис. 4) в комплексе фермента с субстратом [28]. Метионин γ-лиаза является структурным гомологом OAHS и также принадлежит к структурному подклассу CBL [42]. Для метионин γ-лиазы из Citrobacter freundii было показано, что остаток S339 необходим для эффективного катализа реакции γ-элиминирования [55]. Гомологичный остаток серина является консервативным для ферментов подкласса CBL, за исключением OAHS [54]. В последовательностях OAHS из различных источников положение остатка S339 занимают остатки аспарагина или гистидина, возможно, из-за отсутствия именно этого остатка OAHS может катализировать только реакцию γ-замещения.

 

Рис. 7. Схема взаимодействий α,β–ненасыщенного кетимина с аминокислотными остатками активного центра OAHS (нумерация T. maritima). Аминокислотные остатки соседнего мономера обозначены звёздочкой. Штриховыми линиями показаны водородные связи, штрих-пунктирными – π-взаимодействия.

 

Анализ пространственной структуры OAHS из T. maritima и CGS из Xanthomonas oryzae [56] позволил идентифицировать R270 активного центра как остаток, который препятствует связыванию О-сукцинил-L-гомосерина, а также обеспечивает строгую специфичность к бисульфиду в качестве второго субстрата за счет перекрывания доступа к активному центру более крупного субстрата – L-цистеина как источника серы [28]. Однако для OAHS с доказанной функцией и определенными пространственными структурами из T. thermophilus и W. succinogenes в данной позиции находятся S258 и Q254 соответственно (рис. 3).

ИНГИБИТОРЫ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА

Транссульфурилирование и сульфгидрилирование регулируются метионином, ингибирующим ферменты обоих биосинтетических путей [57]. Ингибирование реакции γ-замещения OAH различными аминокислотами было исследовано для OAHS из С. difficile и C. novyi [27, 37]. Конечный продукт биосинтетического пути L-метионин оказался конкурентным ингибитором фермента с величиной K_i = 9 мM. Nγ-ацетил-L-2,4-диаминомасляная кислота, которая является структурным аналогом субстрата, может останавливать каталитическую реакцию на стадии образования енамина (5 на рис. 4) из-за отсутствия уходящей группы в γ-положении. Nγ-ацетил-L-2,4-диаминомасляная кислота обратимо ингибировала реакцию γ-замещения OAH с величиной K_i = 0.04 мM. Пропаргилглицин, являющийся суицидальным ингибитором пиридоксалевых ферментов, участвующих в метаболизме серосодержащих аминокислот (цистатионин γ-лиазы, CGS и CBL), приводил к полной необратимой инактивации OAHS из С. difficile [27]. Благодаря наличию ПЛФ в активном центре холофермент и его комплексы с аминокислотами обладают характерными спектрами поглощения, которые отражают состояние внутреннего альдимина и позволяют идентифицировать интермедиаты ферментативной реакции. Спектры поглощения OAHS из С. difficile и C. novyi при рН 7.5 в области 300–550 нм имеют вид, типичный для внутренних альдиминов ПЛФ-зависимых ферментов, с основной полосой в области 415 нм и минорной в области 320 нм (рис. 8). Фермент из T. thermophilus имел похожий спектр поглощения с максимумом при 425 нм [18].

 

Рис. 8. Спектры поглощения OAHS из C. difficile (а) и C. novyi (б) при рН 7.5.

 

В спектрах поглощения комплексов OAHS из C. difficile и C. novyi с L-метионином и Nγ-ацетил-L-2,4-диаминомасляной кислотой интенсивность полосы в области 420 нм уменьшалась, а поглощение в области 320–360 нм увеличивалось, что может быть связано с изменением ионного состояния внешних альдиминов и их таутомеризацией, а также с поглощением интермедиатов, имитирующих промежуточные продукты реакции (рис. 4).

Для фермента из T. thermophilus было показано, что L-метионин и D, L-пропаргилглицин также ингибировали реакцию γ-замещения с OAH [18, 35]. L-метионин являлся конкурентным ингибитором OAHS из S. cerevisiae (K_i = 0.9 мM) [36] и C. glutamicum [41]. Кроме того, O-ацетил-Lсерин (K_i = 21.8 мM), O-сукцинил-D, L-гомосерин (K_i = 19.0 мM) и L-гомосерин (K_i = 16.0 мM) ингибировали OAHS дрожжей по конкурентному типу [36].

ЭВОЛЮЦИЯ ПУТИ БИОСИНТЕЗА МЕТИОНИНА В МИКРООРГАНИЗМАХ

Поскольку в некоторых микроорганизмах присутствует бифункциональная CGS, которая может участвовать в пути прямого сульфгидрилирования, а также в присущем ей пути транссульфурилирования, возникает вопрос эволюционного обоснования выбора микроорганизмами различных путей биосинтеза метионина. Для выяснения этого были проведены тесты на комплементацию in vivo и филогенетический анализ ферментов, участвующих в биосинтезе метионина в микроорганизмах [58, 59]. Полученные данные, в комплексе с анализом субстратной специфичности, позволили сделать предположение, что общий предковый ген этих ферментов был способен действовать как сульфгидрилаза О-ацетил-L-гомосерина или О-сукцинил-L-гомосерина. У некоторых бактерий этот древний фермент, скорее всего, эволюционировал в CGS, тем самым сохранив способность использовать различные гомосеринэтерифицированные субстраты, а также различные источники серы, и, таким образом, сохранил мультисубстратную специфичность своего предка. В некоторых организмах этот предковый ген, вероятно, подвергся дупликации, в результате которой образовались отдельно CGS и сульфгидрилаза. Это привело к развитию двух параллельных путей получения метионина, транссульфурилированию и прямому сульфгидрилированию в этих организмах. Хотя оба пути существуют у нескольких организмов, большинство из них, по-видимому, используют один специфический путь биосинтеза метионина. Скорее всего, выбор микроорганизмами того или иного пути биосинтеза метионина связан с особенностями их внутреннего метаболизма и зависит от их естественной среды обитания.

ПРИМЕНЕНИЕ OAHS ДЛЯ СИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

Метионин применяется главным образом при производстве современных комплексных кормов для сельского хозяйства. Выявлено положительное влияние метионина на показатели продуктивности в животноводстве [60, 61]. Кроме того, метионин используется в фармацевтике и спортивном питании [62]. Промышленное получение L-метионина путем микробиологической ферментации является затруднительным ввиду строгой клеточной регуляции его биосинтеза, поэтому он производится преимущественно синтетическим путем, в результате чего образуется рацемическая смесь D, L-метионина [63]. Во многих живых организмах может усваиваться только L-форма, и именно она используется для синтеза гормонов, ферментов и других белков. Биологически активный L-метионин может быть получен ферментативным синтезом с использованием биоконверсии предшественников [64].

К настоящему времени многочисленные протеиногенные аминокислоты и некоторые специальные аминокислоты, важные для фармацевтики, производятся путем ферментации [24, 65]. В связи с этим является актуальным получение аминокислот и их производных при помощи изолированных ферментов. Такие бактерии как E. coli, C. glutamicum широко используются в промышленности для микробного синтеза аминокислот. Ферментативный способ с применением определенных штаммов бактерий или дрожжей достаточно прост, но с другой стороны, микроорганизмы могут быть чувствительны к изменениям условий процесса, в частности pH, температуре.

В живых организмах ПЛФ-зависимые ферменты способны катализировать широкий спектр биохимических реакций с участием субстратов – аминокислот и их аналогов [66, 67]. По этой причине ПЛФ-зависимые ферменты вызывают интерес как инструмент в биотехнологии для производства ряда специфических аминокислот и их производных [68, 69]. Кроме того, тонкое регулирование метаболических путей, опосредуемых ПЛФ-зависимыми ферментами, является многообещающим подходом к продуцированию клетками неканонических аминокислот из простых источников углерода или предшественников [70]. Методами генной инженерии был создан метионин-штамм E. coli ауксотрофный по метионину, позволяющий получить L-азидогомоаланин из O-ацетил-L-гомосерина и азида натрия и включить его в рекомбинантные белки-мишени [33]. В данной системе путь биосинтеза метионина у E. coli сначала был перенаправлен в сторону получения желаемой неканонической аминокислоты, используя широкую субстратную специфичность рекомбинантной OAHS из C. glutamicum, а затем была достигнута экспрессия целевого белка барстар, которая сопровождалась эффективным включением L-азидогомоаланина вместо L-метионина [33].

В последние годы исследуются новые пути получения L-метионина с использованием свойств OAHS. Биосинтез метионина подробно исследовался в C. glutamicum с целью использования этой бактерии как промышленного продуцента. В результате были созданы новые штаммы с повышенным производством L-метионина и S-аденозил-L-метионина [24, 32, 63, 71–74]. Замена естественного пути транссульфурилирования в E. coli более распространенным путем прямого сульфгидрилирования, используемым другими бактериями, привела к увеличению по сравнению с штаммом дикого типа выработки L-метионина у ауксотрофного штамма E. coli (MG1655) [75]. Для получения такого метионинового штамма из генома кишечной палочки были удалены гены CGS и CBL и добавлен ген OAHS. OAHS дрожжей, полученная из рекомбинантного штамма E. coli BL-21, была использована для получения L-метионина из O-ацетил-L-гомосерина и 3-метилтиопропиональдегида in vitro [76]. Известны примеры улучшения каталитических свойств OAHS по сравнению с природным ферментом в реакции О-ацетил-L-гомосерина с метилмеркаптаном [77]. С целью получения эффективного продуцента L-метионина была получена мутантная форма OAHS из Rhodobacter sphaeroides при помощи сайт-направленного мутагенеза: ген OAHS из R. sphaeroides c заменами трех аминокислотных остатков был клонирован в клетках E. coli K-12. В результате активность мутантной формы с заменами I3N, F65Y и V104A оказалась в 1.75 раз выше по сравнению с ферментом дикого типа [77].

Таким образом, представленные в настоящем обзоре данные позволяют рассматривать OAHS как перспективный объект для использования ее в ферментативном синтезе L-метионина, других аминокислот, а также их производных.

Об авторах

В. В. Куликова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vitviku@yandex.ru
Россия, Москва

Е. А. Морозова

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: vitviku@yandex.ru
Россия, Москва

А. Д. Лыфенко

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: vitviku@yandex.ru
Россия, Москва

В. С. Коваль

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: vitviku@yandex.ru
Россия, Москва

Н. В. Ануфриева

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: vitviku@yandex.ru
Россия, Москва

П. Н. Сольев

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: vitviku@yandex.ru
Россия, Москва

С. В. Ревтович

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Email: vitviku@yandex.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы