Роль белков L и 2А вируса энцефаломиокардита типа 1 в ингибировании синтеза клеточных белков и накоплении вирусных белков при инфекции

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Инфицирование клеток вирусом энцефаломиокардита типа 1 (EMCV-1, Cardiovirus A: Picornaviridae) сопровождается подавлением синтеза клеточных белков. Главную роль в ингибировании клеточной трансляции отводят «секьюрити»-белкам L и 2А. Механизм возможного влияния белка L на клеточную трансляцию неизвестен. Существуют гипотезы о механизме влияния белка 2А на эффективность кэп-зависимой трансляции, которые основаны на его взаимодействии с факторами трансляции и субъединицами рибосом. Экспериментальные данные противоречивы и не позволяют сформулировать единую модель взаимодействия белков L и 2А с трансляционным аппаратом клетки.

Цель. Изучить роль «секьюрити»-белков L и 2А в подавлении трансляции клеточных белков и эффективности трансляции и процессинга вирусных белков зараженных клеток.

Материалы и методы. Для исследования свойств вирусных белков L и 2A получены мутантные варианты EMCV-1: Zfmut, имеющий дефектный белок L; Δ2A, кодирующий частично делетированный белок 2А; Zfmut&Δ2A, содержащий мутации в обоих белках. Течение трансляционных процессов в зараженных клетках изучали c помощью вестерн-блот-гибридизации и пульс-метода включения радиоактивно меченных аминокислот (14С) в новосинтезированные белки.

Результаты. Функциональная инактивация белка 2А не влияет на ингибирование синтеза клеточных белков. Обнаружена прямая корреляция между наличием активного белка L и специфической инактивацией синтеза клеточных белков на раннем этапе вирусной инфекции. На поздних стадиях инфекции происходит неспецифическое подавление трансляционных процессов зараженной клетки, сопровождающееся фосфорилированием eIF2α. Частичное удаление белка 2А из генома EMCV-1 не влияет на течение этого процесса, в то время как инактивация белка L ускоряет наступление полного ингибирования синтеза белков. При частичной делеция белка 2А нарушается процессинг белков вирусного капсида. Подавление функций белка L приводит к снижению эффективности вирусной трансляции.

Заключение. Белок 2А не влияет на ингибирование трансляции в клетках HeLa. Белок L играет важную роль не только в специфическом ингибировании клеточной трансляции, но и в поддержании эффективного синтеза вирусных белков. Белок 2А принимает участие не только в первичном, но и во вторичном процессинге капсидных белков EMCV-1.

Об авторах

Юрий Юрьевич Ивин

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Автор, ответственный за переписку.
Email: ivin_uu@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0003-0995-7944

научный сотрудник лаборатории биохимии, начальник управления разработки и внедрения инновационных и полупромышленных технологий

Россия, 108819, Москва

Анна Александровна Бутусова

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Email: amadreaera@gmail.com
ORCID iD: 0009-0008-0361-9681

младший научный сотрудник лаборатории биохимии

Россия, 108819, Москва

Екатерина Евгеньевна Гладнева

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Email: gladneva_ee@chumakovs.su
ORCID iD: 0009-0005-8067-6768

младший научный сотрудник лаборатории биохимии

Россия, 108819, Москва

Галина Яковлевна Коломийцева

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Email: kolom@genebee.msu.ru
ORCID iD: 0009-0005-5130-2695

кандидат хим. наук, доцент, заведующая отделом изотопного анализа

Россия, 119234, Москва

Юсуф Хаджибекович Хапчаев

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита)

Email: hapchaev_uh@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0003-1613-5228

доктор биол. наук, начальник цеха по производству полиомиелитных вакцин

Россия, 108819, Москва

Айдар Айратович Ишмухаметов

ФГАНУ «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М.П. Чумакова РАН» (Институт полиомиелита); Институт трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России

Email: ishmukhametov@chumakovs.su
ORCID iD: 0000-0001-6130-4145

доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, генеральный директор, заведующий кафедрой организации и технологии производства иммунобиологических препаратов

Россия, 108819, Москва; 117418, Москва

Список литературы

  1. Drappier M., Opperdoes F.R., Michiels T. Nonstructural protein L* species specificity supports a mouse origin for Vilyuisk human encephalitis virus. J. Virol. 2017; 91(14): e00573-17. https://doi.org/10.1128/jvi.00573-17
  2. Ugai S., Iwaya A., Taneichi H., Hirokawa C., Aizawa Y., Hatakeyama S., et al. Clinical characteristics of saffold virus infection in children. Pediatr. Infect. Dis. J. 2019; 38(8): 781–5. https://doi.org/10.1097/inf.0000000000002298
  3. Tan S.Z.K., Tan M.Z.Y., Prabakaran M. Saffold virus, an emerging human cardiovirus. Rev. Med. Virol. 2017; 27(1): e1908. https://doi.org/10.1002/rmv.1908
  4. Lipton H.L. Human Vilyuisk encephalitis. Rev. Med. Virol. 2008; 18(5): 347–52. https://doi.org/10.1002/rmv.585
  5. Carocci M., Bakkali-Kassimi L. The encephalomyocarditis virus. Virulence. 2012; 3(4): 351–67. https://doi.org/10.4161/viru.20573
  6. Merrick W.C., Pavitt G.D. Protein synthesis initiation in eukaryotic cells. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018; 10(12): a033092. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a033092
  7. Jackson R.J., Hellen C.U.T., Pestova T.V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010; 11(2): 113–27. https://doi.org/10.1038/nrm2838
  8. Donnelly N., Gorman A.M., Gupta S., Samali A. The eIF2α kinases: their structures and functions. Cell. Mol. Life Sci. 2013; 70(19): 3493–511. https://doi.org/10.1007/s00018-012-1252-6
  9. Wek R.C. Role of eIF2α kinases in translational control and adaptation to cellular stress. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018; 10(7): a032870. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a032870
  10. Imai S., Suzuki H., Fujiyoshi Y., Shimada I. Dynamically regulated two-site interaction of viral RNA to capture host translation initiation factor. Nat. Commun. 2023; 14(1): 4977. https://doi.org/10.1038/s41467-023-40582-6
  11. Sorokin I.I., Vassilenko K.S., Terenin I.M., Kalinina N.O., Agol V.I., Dmitriev S.E. Non-canonical translation initiation mechanisms employed by eukaryotic viral MRNAs. Biochemistry. (Mosc.). 2021; 86(9): 1060–94. https://doi.org/10.1134/S0006297921090042
  12. Francisco-Velilla R., Embarc-Buh A., Abellan S., Martinez-Salas E. Picornavirus translation strategies. FEBS Open Bio. 2022; 12(6): 1125–41. https://doi.org/10.1002/2211-5463.13400
  13. Chamond N., Deforges J., Ulryck N., Sargueil B. 40S recruitment in the absence of EIF4G/4A by EMCV IRES refines the model for translation initiation on the archetype of type II IRESs. Nucleic Acids Res. 2014; 42(16): 10373–84. https://doi.org/10.1093/nar/gku720
  14. Welnowska E., Sanz M.A., Redondo N., Carrasco L. Translation of viral MRNA without active EIF2: The case of picornaviruses. PLoS One. 2011; 6(7): e22230. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022230
  15. Agol V.I., Gmyl A.P. Viral security proteins: counteracting host defences. Nat. Rev. Microbiol. 2010; 8(12): 867–78.https://doi.org/10.1038/nrmicro2452
  16. Yang X., Hu Z., Fan S., Zhang Q., Zhong Y., Guo D., et al. Picornavirus 2A protease regulates stress granule formation to facilitate viral translation. PLoS Pathog. 2018; 14(2): e1006901. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006901
  17. Chau D.H.W., Yuan J., Zhang H., Cheung P., Lim T., Liu Z., et al. Coxsackievirus B3 proteases 2A and 3C induce apoptotic cell death through mitochondrial injury and cleavage of eIF4GI but not DAP5/P97/NAT1. Apoptosis. 2007; 12(3): 513–24. https://doi.org/10.1007/s10495-006-0013-0
  18. Azzinaro P.A., Medina G.N., Rai D., Ramirez-Medina E., Spinard E., Rodriguez-Calzada M., et al. Mutation of FMDV Lpro H138 residue drives viral attenuation in cell culture and in vivo in swine. Front. Vet. Sci. 2022; 9: 1028077. https://doi.org/10.3389/fvets.2022.1028077
  19. Turkki P., Laajala M., Flodström-Tullberg M., Marjomäki V. Human enterovirus group B viruses rely on vimentin dynamics for efficient processing of viral nonstructural proteins. J. Virol. 2020; 94(2): e01393-19. https://doi.org/10.1128/JVI.01393-19.
  20. Jen G., Detjen B.M., Thach R.E. Shutoff of HeLa cell protein synthesis by encephalomyocarditis virus and poliovirus: a comparative study. J. Virol. 1980; 35(1): 150–6. https://doi.org/10.1128/JVI.35.1.150-156.19
  21. Aminev A.G., Amineva S.P., Palmenberg A.C. Encephalomyocarditis viral protein 2A localizes to nucleoli and inhibits cap-dependent MRNA translation. Virus Res. 2003; 95(1-2): 45–57. https://doi.org/10.1016/S0168-1702(03)00162-X
  22. Zoll J., Galama J.M., van Kuppeveld F.J., Melchers W.J. Mengovirus leader is involved in the inhibition of host cell protein synthesis. J. Virol. 1996; 70(8): 4948–52. https://doi.org/10.1128/jvi.70.8.4948-4952.1996
  23. Bacot-Davis V.R., Ciomperlik J.J., Basta H.A., Cornilescu C.C., Palmenberg A.C. Solution structures of mengovirus leader protein, its phosphorylated derivatives, and in complex with nuclear transport regulatory protein, RanGTPase. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2014; 111(44): 15792–7. https://doi.org/10.1073/pnas.1411098111
  24. Dvorak C.M., Hall D.J., Hill M., Riddle M., Pranter A., Dillman J., et al. Leader protein of encephalomyocarditis virus binds zinc, is phosphorylated during viral infection, and affects the efficiency of genome translation. Virology. 2001; 290(2): 261–71. https://doi.org/10.1006/viro.2001.1193
  25. Romanova L.I., Lidsky P.V., Kolesnikova M.S., Fominykh K.V., Gmyl A.P., Sheval E.V., et al. Antiapoptotic activity of the cardiovirus leader protein, a viral “security” protein. J. Virol. 2009; 83(14): 7273–84. https://doi.org/10.1128/JVI.00467-09
  26. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., Fominykh K.V., van Kuppeveld F.J.M., Polyakov V.Y., et al. Mengovirus-induced rearrangement of the nuclear pore complex: hijacking cellular phosphorylation machinery. J. Virol. 2009; 83(7): 3150–61. https://doi.org/10.1128/JVI.01456-08
  27. Hato S.V., Ricour C., Schulte B.M., Lanke K.H., de Bruijni M., Zoll J., et al. The mengovirus leader protein blocks interferon-alpha/beta gene transcription and inhibits activation of interferon regulatory factor 3. Cell. Microbiol. 2007; 9(12): 2921–30. https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2007.01006.x
  28. Donnelly M.L.L., Gani D., Flint M., Monaghan S., Ryan M.D. The cleavage activities of aphthovirus and cardiovirus 2A proteins. J. Gen. Virol. 1997; 78(Pt. 1): 13–21. https://doi.org/10.1099/0022-1317-78-1-13
  29. Groppo R., Brown B.A., Palmenberg A.C. Mutational analysis of the EMCV 2A protein identifies a nuclear localization signal and an eIF4E binding site. Virology. 2011; 410(1): 257–67. https://doi.org/10.1016/j.virol.2010.11.002
  30. Napthine S., Ling R., Finch L.K., Jones J.D., Bell S., Brierley I., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nat. Commun. 2017; 8: 15582. https://doi.org/10.1038/ncomms15582
  31. Hill C.H., Pekarek L., Napthine S., Kibe A., Firth A.E., Graham S.C., et al. Structural and molecular basis for cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nat. Commun. 2021; 12(1): 7166. https://doi.org/10.1038/s41467-021-27400-7
  32. Loughran G., Firth A.E., Atkins J.F. Ribosomal frameshifting into an overlapping gene in the 2B-encoding region of the cardiovirus genome. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011; 108(46): E1111–9. https://doi.org/10.1073/pnas.1102932108
  33. Caliskan N., Hill C.H. Insights from structural studies of the cardiovirus 2A protein. Biosci. Rep. 2022; 42(1): BSR20210406. https://doi.org/10.1042/BSR20210406
  34. Svitkin Y.V., Hahn H., Gingras A.C., Palmenberg A.C., Sonenberg N. Rapamycin and wortmannin enhance replication of a defective encephalomyocarditis virus. J. Virol. 1998; 72(7): 5811–9. https://doi.org/10.1128/jvi.72.7.5811-5819.1998
  35. Medvedkina O.A., Scarlat I.V., Kalinina N.O., Agol V.I. Virus-specific proteins associated with ribosomes of Krebs-II cells infected with encephalomyocarditis virus. FEBS Lett. 1974; 39(1): 4–8. https://doi.org/10.1016/0014-5793(74)80003-7
  36. Groppo R., Palmenberg A.C. Cardiovirus 2A protein associates with 40S but not 80S ribosome subunits during infection. J. Virol. 2007; 81(23): 13067–74. https://doi.org/10.1128/JVI.00185-07
  37. Duke G.M., Palmenberg A.C. Cloning and synthesis of infectious cardiovirus RNAs containing short, discrete poly(C) tracts. J. Virol. 1989; 63(4): 1822–6. https://doi.org/10.1128/jvi.63.4.1822-1826.1989
  38. Mikitas O.V., Ivin Y.Y., Golyshev S.A., Povarova N.V., Galkina S.I., Pletjushkina O.Y., et al. Suppression of injuries caused by a lytic RNA virus (mengovirus) and their uncoupling from viral reproduction by mutual cell/virus disarmament. J. Virol. 2012; 86(10): 5574–83. https://doi.org/10.1128/jvi.07214-11
  39. Parks G.D., Baker J.C., Palmenberg A.C. Proteolytic cleavage of encephalomyocarditis virus capsid region substrates by precursors to the 3C enzyme. J. Virol. 1989; 63(3): 1054–8. https://doi.org/10.1128/jvi.63.3.1054-1058.1989
  40. Joachims M., Van Breugel P.C., Lloyd R.E. Cleavage of poly(A)-binding protein by enterovirus proteases concurrent with inhibition of translation in vitro. J. Virol. 1999; 73(1): 718–27. https://doi.org/10.1128/jvi.73.1.718-727.1999
  41. Lidsky P.V., Hato S., Bardina M.V., Aminev A.G., Palmenberg A.C., Sheval E.V., et al. Nucleocytoplasmic traffic disorder induced by cardioviruses. J. Virol. 2006; 80(6): 2705–17. https://doi.org/10.1128/JVI.80.6.2705-2717.2006
  42. Hato S.V., Sorgeloos F., Ricour C., Zoll J., Melchers W.J.G., Michiels T., et al. Differential IFN-alpha/beta production suppressing capacities of the leader proteins of mengovirus and foot-and-mouth disease virus. Cell. Microbiol. 2010; 12(3): 310–7. https://doi.org/10.1111/j.1462-5822.2009.01395.x
  43. Tolskaya E.A., Romanova L.I., Kolesnikova M.S., Ivannikova T.A., Smirnova E.A., Raikhlin N.T., et al. Apoptosis-inducing and apoptosis-preventing functions of poliovirus. J. Virol. 1995; 69(2): 1181–9. https://doi.org/10.1128/jvi.69.2.1181-1189.1995
  44. Petty R.V., Basta H.A., Bacot-Davis V.R., Brown B.A., Palmenberg A.C. Binding Interactions between the Encephalomyocarditis virus leader and protein 2A. J. Virol. 2014; 88(22): 13503–9. https://doi.org/10.1128/JVI.02148-14
  45. Meurs E., Chong K., Galabru J., Thomas N.S.B., Kerr I.M., Williams B.R.G., et al. Molecular cloning and characterization of the human double-stranded RNA-activated protein kinase induced by interferon. Cell. 1990; 62(2): 379–90. https://doi.org/10.1016/0092-8674(90)90374-N
  46. Cole J. Activation of PKR: an open and shut case? Trends Biochem. Sci. 2007; 32(2): 57–62. https://doi.org/10.1016/j.tibs.2006.12.003
  47. Ng C.S., Jogi M., Yoo J.S., Onomoto K., Koike S., Iwasaki T., et al. Encephalomyocarditis virus disrupts stress granules, the critical platform for triggering antiviral innate immune responses. J. Virol. 2013; 87(17): 9511–22. https://doi.org/10.1128/jvi.03248-12
  48. Porter F.W., Brown B., Palmenberg A.C. Nucleoporin phosphorylation triggered by the encephalomyocarditis virus leader protein is mediated by mitogen-activated protein kinases. J. Virol. 2010; 84(24): 12538–48. https://doi.org/10.1128/JVI.01484-09
  49. Han A.P. Heme-regulated eIF2alpha kinase (HRI) is required for translational regulation and survival of erythroid precursors in iron deficiency. EMBO J. 2001; 20(23): 6909–18. https://doi.org/10.1093/emboj/20.23.6909
  50. Berlanga J.J., Ventoso I., Harding H.P., Deng J., Ron D., Sonenberg N., et al. Antiviral effect of the mammalian translation initiation factor 2α kinase GCN2 against RNA viruses. EMBO J. 2006; 25(8): 1730–40. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7601073
  51. Krishnamoorthy J., Mounir Z., Raven J.F., Koromilas A.E. The eIF2α kinases inhibit vesicular stomatitis virus replication independently of eIF2α phosphorylation. Cell Cycle. 2008; 7(15): 2346–51. https://doi.org/10.4161/cc.6323
  52. Harding H.P., Zhang Y., Ron D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 1999; 397(6716): 271–4. https://doi.org/10.1038/16729
  53. Shishova A., Dyugay I., Fominykh K., Baryshnikova V., Dereventsova A., Turchenko Y., et al. Enteroviruses manipulate the unfolded protein response through multifaceted deregulation of the Ire1-Xbp1 pathway. Viruses. 2022; 14(11): 2486. https://doi.org/10.3390/v14112486

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схема мутаций, внесенных в последовательность белков L и 2А вируса EMCV-1 для получения мутантных вирусов Zfmut, Δ2A и Zfmut&Δ2A (а); изменение фенотипа негативных колоний полученных мутантных вирусов Δ2A и Zfmut&Δ2A в ходе проведе- ния пассажей на культуре клеток BHK-21 (б).

Скачать (682KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Положение аминокислотного остатка в позиции № 99 белка VP2 (а); сравнение циклов репродукции EMCV-1 дикого типа (WT) и мутантного вируса с аминокислотной заменой треонина на аланин в положении 99 белка VP2 (Thr/VP2_99/Ala) (б).

Скачать (316KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Накопление инфекционных вирусных частиц (a) и копий вирусной геномной РНК (б) в ходе цикла репродукции вирусов WT, Zfmut, Δ2A и Zfmut&Δ2A в клетках HeLa. Количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) определяли методом титрования в клетках BHK-21. Количество копий вирусной РНК определяли методом ПЦР в режиме реального времени.

Скачать (318KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Радиоавтография синтезируемых белков в клетках HeLa, зараженных вирусами WT, Zfmut, Δ2A и Zfmut&Δ2A. Ингибиторы трансляции белков: Ars – арсенит натрия, концентрация 100 нМ, T-2 токсин – концентрация 50 нМ. Mock – незараженные клетки без воздействия ингибиторов. Сигналы, соответствующие вирусным белкам, отмечены стрелками.

Скачать (560KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Уровень включения аминокислот, меченных изотопом 14C, в синтезируемые белки в ходе инфекции клеток HeLa мутантными вирусами WT, Zfmut, Δ2A и Zfmut&Δ2A. Значение, равное 1, соответствует уровню включения аминокислот, меченных изотопом 14C, в белки незараженной культуры (а); уровень фосфорилирования фактора инициации трансляции eIFAα в клетках HeLa в ходе инфекции вирусами WT, Zfmut, Δ2A и Zfmut&Δ2A. Значение, равное 1, соответствует уровню фосфорилирования eIFAα в незараженных клетках (б). Значения получены при обработке результатов иммуноблоттинга. Обработка изображения проводилась с использованием программы ImageJ.

Скачать (222KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Изучение накопления белков исследуемых вирусов в ходе инфекции клеток HeLa с помощью специфической мышиной иммунной сыворотки (а) и радиоавтографии с использованием аминокислот, меченных изотопом 14С (б). Для панели а и б использовали одни и те же лизаты зараженных клеток. Образцы: 1 – WT EMCV-1, очищенный с помощью ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия; 2 – WT из рабочего пула; 3–12 – образцы из клеток HeLa спустя 4 ч после заражения исследуемыми вирусами; Mock – незараженные клетки. Количество образцов 3–12 выровнено по содержанию β-актина.

Скачать (363KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Относительный уровень сигнала вирусных белков, накопленных к 4 ч после начала инфекции клеток HeLa вирусами WT, Zfmut, Δ2A и Zfmut&Δ2A. а – уровень сигнала неструктурных белков и белков-предшественников капсидных белков; б – уровень сигнала капсидных белков. Данные получены в ходе обработки результатов иммуноблоттинга лизатов зараженных клеток с использованием специфической мышиной сыворотки против белков EMCV-1 (рис. 6 а). Уровень, равный 1, соответствует уровню сигнала каждого отдельного белка вируса WT. Величину сигнала отдельных белков нормировали на сигнал у вируса WT. Обработку изображения проводили с использованием программы ImageJ. * – p < 0,05, *** – p < 0,001.

Скачать (419KB)
Метаданные

© Ивин Ю.Ю., Бутусова А.А., Гладнева Е.Е., Коломийцева Г.Я., Хапчаев Ю.Х., Ишмухаметов А.А., 2023

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах