Анализ генов антифаговых систем нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae О1 биовара Эль Тор

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Актуальность. Наличие и структура антифаговых систем, способствующих устойчивости холерных вибрионов к литическим фагам, у нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae О1 биовара El Tor, выделенных на территории России и сопредельных стран, не изучена.

Цель — выявление и анализ антифаговых систем нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor.

Материалы и методы. В работе использовали 126 нетоксигенных (ctxАВ–tcpА+ и ctxАВ–tcpА–) штаммов V. cholerae О1 El Tor, изолированных с 1972 по 2018 г. Секвенирование ДНК проводили на платформе MGI DNBSEQ-G50. Для биоинформатического анализа применяли программы fastp v. 0.23, unicycler v. 0.4.7, Blast 2.16.0, MEGA X, CRISPRCastyper и CRISPRCasFinder.

Результаты. В геноме изученных штаммов не выявлены фагоиндуцируемые острова PLE, BREX и DISARM-системы. Установлено, что 80% ctxАВ–tcpА+-штаммов содержат систему рестрикции–модификации I типа, у ctxАВ–tcpА–-изолятов данная система не обнаружена. Гены CBASS-системы выявлены у единичных штаммов обеих групп. В геноме 35 (32%) изученных ctxАВ–tcpА–-штаммов, выделенных в разных регионах РФ и сопредельных странах, установлено наличие CRISPR–Cas-системы 1-го класса типов I (подтипы I-E, I-F, I-C) и III (подтип III-B). Количество спейсеров в данной системе варьировало от 0 до 80, их последовательность была гомологична протоспейсерным участкам ДНК литических и умеренных фагов, транспозонов, плазмид V. cholerae, представителей рода Vibrio и неродственных бактерий. Наличие у ряда штаммов спейсеров, гомологичных генетическому материалу фага, циркулирующему на эндемичных территориях, может указывать на завозной характер данных штаммов.

Заключение. Выявлена гетерогенность изученных нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor по наличию антифаговых систем, что расширяет сведения об их генетической организации. В их геноме выявлены системы рестрикции–модификации I типа (ctxAB–tcpA+), CBASS (ctxAB–tcpA+ и ctxAB–tcpA–) и CRISPR–Cas 1-го класса типов I (подтипы I-E, I-F, I-C) и III (ctxAB–tcpA–). Выявление нескольких типов и подтипов CRISPR–Cas-системы в геноме ряда ctxAB–tcpA–-штаммов может указывать на её неоднократное приобретение посредством горизонтального переноса.

Полный текст

Введение

Ежегодно при проведении мониторинговых исследований водных объектов России на холеру выделяются нетоксигенные штаммы Vibrio cholerae О1 серогруппы биовара El Tor, лишённые генов ctxAB (ctxAВ–), кодирующих биосинтез холерного токсина (основной фактор вирулентности возбудителя холеры). Иногда изолируются штаммы, содержащие ген tcpA (ctxAВ–tcpA+), отвечающий за продукцию основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей адгезии (фактор колонизации). Как ctxAВ–tcpA–-, так и ctxAВ–tcpA+-штаммы не вызывают холеру, но могут быть причиной острых кишечных инфекций. Установлено, что нетоксигенные штаммы V. cholerae О1 El Tor способны длительное время сохраняться в объектах окружающей среды на территории России, образуя клональные комплексы, а также завозиться из эндемичных по холере стран [1–7]. Для выявления механизмов длительного выживания нетоксигенных штаммов во внешней среде, а также способности вызывать острые кишечные инфекции активно изучаются молекулярно-генетические особенности указанных штаммов, проводятся различные виды типирования и филогенетический анализ. В результате в геноме нетоксигенных штаммов выявлено присутствие генов, кодирующих дополнительные факторы патогенности, а также персистенции, которые могут выполнять и роль токсических субстанций. В том числе выявлены локусы, обеспечивающие подвижность, ответственные за биосинтез дополнительных токсинов, термолабильного гемолизина, протеаз, нейраминидазы, белков системы секреции 6-го и 3-го типов, маннозочувствительных пилей адгезии, а также белков-регуляторов, контролирующих транскрипцию генов вирулентности и персистенции [3, 5, 8]. Однако причины длительного выживания нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor во внешней среде до конца не установлены.

Необходимо отметить, что, находясь в воде открытых водоёмов, нетоксигенные вибрионы V. cholerae О1 El Tor могут подвергаться атаке бактериофагов (фагов), также присутствующих в данной среде. Показано, что холерным фагам принадлежит важная роль в генетическом разнообразии штаммов V. cholerae [9]. Совместное существование V. cholerae и фагов и необходимость обоих выживать способствуют эволюции как V. cholerae, так и фагов [9, 10]. Бактерии приобретают различные механизмы устойчивости к фагам посредством горизонтального переноса генов, а фаги, в свою очередь, очень быстро развивают устойчивость ко многим бактериальным защитным системам. Выявлено, что гены, кодирующие устойчивость к фагам, могут составлять более 10% бактериального генома [11].

У токсигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor выявлено присутствие значительного количества антифаговых систем, расположенных на мобильных генетических элементах. В том числе на острове патогенности VPI-2 находится кластер генов, кодирующих систему рестрикции-модификации I типа (vc1764–vc1769), действие которой основано на активности двух ферментов: эндонуклеазы рестрикции (vc1765) и метилтрансферазы (vc1769) [12]. На острове пандемичности VSP-I расположена антифаговая сигнальная система CBASS (cyclic-oligonucleotide-based antiphage signaling system), включающая оперон из 4 генов: dncV, capV, сар2, сар3 [13, 14]. В составе ICE SXT-элементов обнаружены BREX (Bacteriophage exclusion) и DISARM (Defence Islands System Associated with Restriction-Modification) системы [10, 15, 16].

Важная роль в защите от самого распространённого на эндемичной территории фага ICP1 принадлежит фагоиндуцируемым островам PLE (Phage inducible chromosomal island-like elements), которых в настоящее время насчитывается 10 типов [17–19]. Однако у токсигенных вибрионов El Tor отсутствует система адаптивной защиты CRISPR–Cas, выявленная в геноме нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor, циркулирующих на эндемичной территории [20]. Данная система включает короткие палиндромные повторы (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats — CRISPR), спейсеры (последовательности чужеродного происхождения) и гены cas, кодирующие белки с различной функцией [13]. В настоящее время CRISPR–Cas-система в зависимости от механизма действия, структуры CRISPR-спейсеров и присутствия генов сas классифицируется на 2 класса, 6 типов и 33 подтипа.

В системе класса 1 (типы I, III, IV) с мишенью взаимодействует многокомпонентный комплекс, который состоит из нескольких белков Cas, связанных с crРНК. Системы класса 2 (типы II, V и VI) содержат только один белок (Cas9, Cas12 или Cas13), который выполняет все функции мультибелкового эффекторного комплекса.

Деление на типы основано на строении эффекторных комплексов, при этом системы одного типа включают, как правило, особый уникальный для систем этого типа белок. Типы, в свою очередь, делятся на подтипы, различающиеся особенностями в строении локуса CRISPR и, в некоторых случаях, наличием белков Cas. Так, во многих системах I типа присутствует ген cas3, кодирующий хеликазу-нуклеазу Cas3, которая, благодаря хеликазной активности, разъединяет двойную чужеродную спираль ДНК, а при участии нуклеазного домена фрагментирует чужеродный генетический материал. В системах III типа нуклеазной активностью обладает белок Cas10. В состав всех типов входят белки Cas1 и Cas2, формирующие комплекс и отвечающие за этап адаптации, т. е. встраивания нового спейсера в CRISPR [20, 21].

Несмотря на активное исследование антифаговых систем V. cholerae, их присутствие в геноме нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных на территории России и сопредельных стран, не изучено.

Цель работы состояла в выявлении и анализе антифаговых систем нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor.

Материалы и методы

Изучали нуклеотидные последовательности полных геномов 126 нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor, выделенных с 1972 по 2018 г. на территории России и сопредельных стран. Нуклеотидные последовательности 30 штаммов (12 ctxА–tcpА+ и 18 ctxА–tcpА–) взяты из базы данных NCBI GenBank, 96 штаммов (3 ctxА–tcpА+ и 93 ctxА–tcpА–) секвенированы в данной работе. Для проведения секвенирования штаммы получали из Государственной коллекции патогенных бактерий Российского противочумного института «Микроб» Роспотребнадзора, где они хранились в лиофилизированном состоянии.

Подготовку геномной ДНК выполняли согласно протоколу производителя из обработанной мертиолятом натрия бактериальной суспензии с использованием коммерческого набора «Axy Prep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit» («Axygen Biosciences»).

Секвенирование проводили на платформе «MGI DNBSEQ-G50» («MGI»). Библиотеки готовили по стандартному протоколу с применением наборов «DNBSEQ-G50RS (FCLPE150)» и «MGI EasyFastPCR-FREEFS Library PrepSet» («MGI»). Контроль качества полученных прочтений осуществляли с помощью программы fastp v. 0.23, контиги собирали с использованием unicycler v. 0.4.7.

Для биоинформатического анализа применяли алгоритм Blast 2.16.0 (http://blast.ncbi) и программу MEGA X (или BioEdit v. 7.0.9.0). Для выявления системы CRISPR–Cas и спейсеров использовали программы CRISPRCastyper1 и CRISPRCasFinder2.

Результаты

При изучении нуклеотидных последовательностей полных геномов нетоксигенных штаммов фагоиндуцируемые острова PLE не были обнаружены ни в геноме ctxAB–tcpA–-, ни ctxAB–tcpA+-штаммов. Не выявлены также системы BREX и DISARM, т. к. в данных штаммах отсутствуют элементы ICE SXT.

При анализе генов системы рестрикции–модификации I типа (vc1765, vc1769) среди 15 ctxAB–tcpA+-штаммов были выявлены 12 изолятов, которые по этим генам соответствовали токсигенному референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor (таблица). У ctxAB–tcpA–-штаммов гены системы рестрикции–модификации I типа не обнаружены.

 

Характеристика некоторых нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor и структура их антифаговых генов

Штамм

Место, год

Источник выделения

Структура генов

Тип CRISPR–Cas-системы

Количество спейсеров

vc1765/ vc1769

vc0179 (dncV)/ vc0178 (capV)

Нетоксигенные ctxАВ–tcpА+-штаммы

М1395LQBY01

Россия, Астрахань, 1981

Внешняя среда

–

–

–

–

56MWRD01

Украина, Мариуполь, 1995

Больной

int

int

–

–

866MWRF01

Украина, Ялта, 1996

Внешняя среда

int

–

–

–

85NEDU01

Украина, Бердянск, 1999

Больной

int

–

–

–

Р18778NIFI01

Россия, Ростов-на-Дону, 2005

Больной

–

–

–

–

М1434*, М1436*

Россия, Калмыкия, 2006

Внешняя среда

int

–

–

–

М1501LRAE01

Россия, Калмыкия, 2011

Больной

–

–

–

–

М-1504VTLN01

Россия, Калмыкия, 2011, 2012

Внешняя среда

int

–

–

–

М-1518LQZR01

Россия, Калмыкия, 2011, 2012

Внешняя среда

int

–

–

–

М-1524LQZS01, М1528*

Россия, Калмыкия, 2013

Внешняя среда

int

–

–

–

2613PYCA01, 2687PYCB01

Россия, Калмыкия, 2015

Внешняя среда

int

–

–

–

124PYCD01

Россия, Калмыкия, 2017

Внешняя среда

int

–

–

–

Нетоксигенные ctxАВ–tcpА–-штаммы

М-988LQBX01

Туркменистан, 1972

Внешняя среда

–

–

I-F mini

Не определено

М-658*

Россия, Уфа, 1976

Внешняя среда

–

–

I-F mini

1

М-659*

Россия, Салават, 1976

Внешняя среда

–

–

I-E

56

М-1114*

Россия, Саранск, 1977

Больной

–

–

I-E

I-F mini

13

0

М-1115*

Россия, Саранск, 1977

Больной

–

–

I-E

I-F mini

13

1

Штамм

Место, год

Источник выделения

Структура генов

Тип CRISPR–Cas-системы

Количество спейсеров

 

 

 

 

vc1765/ vc1769

vc0179 (dncV)/ vc0178 (capV)

 

 

М-1394*

Россия, Каспийск, 1979

Внешняя среда

–

–

I-E

44

М-1222*

Россия, Астрахань, 1985

Внешняя среда

–

–

I-F mini

10

М-1320*

Россия, Саратов, 1998

Внешняя среда

–

–

III-B

24

617NCTY01

Украина, 1999

Больной

–

–

I-F**

I-E

III-В

26

80

25

М1337NEEB01

Россия, Астрахань, 2000

Больной

–

–

I-E**

1

М-1388*

Россия, Саратов, 2001

Внешняя среда

–

–

I-E

I-F mini

13

1

М-1389*

Россия, Саратов, 2001

Внешняя среда

–

–

I-E

I-F mini

13

1

М-1411*

Россия, Калмыкия, 2002

Больной

–

–

I-F mini

1

М-1413*

Россия, Калмыкия, 2002

Внешняя среда

–

–

I-C

I-F mini

40

2

М-1426*

Россия, Пермский край, 2003

Внешняя среда

–

–

I-F mini

0

М-1428*

Россия, Астрахань, 2003

Внешняя среда

–

–

I-E

44

М-1431*

Россия, Калмыкия, 2005

Внешняя среда

–

–

I-E

60

Р-18748NIFH01

Россия, Сочи, 2004

Больной

–

A1003G (S335G) /int

–

–

102NDXO01

Украина, 2006

Больной

–

A1003G (S335G) /int

I-F**

49

М-1441*

Россия, Калмыкия, 2007

Внешняя среда

–

–

I-E

48

М-1443*

Россия, Калмыкия, 2007

Внешняя среда

–

–

I-E

58

М-1444*

Россия, Калмыкия, 2007

Внешняя среда

–

–

I-E

76

М-1447*

Россия, Калмыкия, 2009

Внешняя среда

–

–

I-F

15

М-1450*

Россия, Калмыкия, 2009

Внешняя среда

–

–

I-F mini

1

М1457VTLH01

Россия, Калмыкия, 2009

Внешняя среда

–

A1003G (S335G) /int

I-F

2

М-1460*

Россия, Татарстан, 2010

Внешняя среда

–

–

I-E

I-F mini

14

1

2403NEDV01

Украина, 2011

Больной

–

–

I-E

I-F mini

12

0

М-1486*

Россия, Татарстан, 2011

Внешняя среда

–

–

I-E

I-F mini

29

1

М-1487*

Россия, Татарстан, 2011

Внешняя среда

–

–

I-E

I-F mini

15

0

М1516VTZY01

Россия, Калмыкия, 2012

Внешняя среда

–

–

I-F

I-C

58

54

М1517VTZZ01

Россия, Калмыкия, 2012

Внешняя среда

–

–

I-E

23

М-1525*

Россия, Калмыкия, 2012

Внешняя среда

–

–

I-F mini

10

М1526VUAA01

Россия, Калмыкия, 2012

Внешняя среда

–

–

I-F

I-C

58

54

29VUAB01

Россия, Калмыкия, 2013

Внешняя среда

–

–

I-E

7

М-1543*

Россия, Калмыкия, 2017

Внешняя среда

–

–

I-E

I-F mini

29

1

136VTLK01

Россия, Калмыкия, 2018

Внешняя среда

–

–

I-E

I-F mini

8

3

Примечание. В надстрочном индексе штаммов указан код доступа в NCBI GenBank. *Штаммы, секвенированные в данной работе. «–» — ген(ы) не обнаружен(ы); int — структура гена соответствует референс-штамму V. cholerae N16961 О1 El Tor. **Присутствие CRISPR–Cas-системы установлено ранее [20].

 

Присутствие генов системы CBASS (dncV, capV) установлено у 4 штаммов. У ctxAB–tcpA+-штамма V. cholerae 56 структура данных генов не отличалась от таковых референс-штамма V. cholerae N16961 О1 El Tor. У ctxAB–tcpA–-штаммов V. cholerae Р-18748, 102 и М-1457 присутствовал интактный ген capV, а в гене dncV выявлены одинаковые точечные несинонимичные мутации, приводящие к замене аминокислот, влияние которых на функциональную роль белка DncV не установлено. В геноме других штаммов указанная система отсутствовала (таблица).

Далее было изучено присутствие CRISPR–Cas-системы. В геноме ctxAB–tcpA+-штаммов данная система не обнаружена, в то же время среди ctxAB–tcpA–-штаммов выявлены 35 изолятов, имеющих CRISPR–Cas-систему 1-го класса 2 типов — I и III. Тип I был представлен тремя подтипами: I-E, I-F, I-C, а тип III — одним (III-В). У наибольшего количества штаммов (20 изолятов) выявлена CRISPR–Cas-система подтипа I-E, среди которых 10 изолятов имели только данный подтип, в остальных присутствовали дополнительные системы. Так штамм V. cholerae 617, кроме I-E, имел еще 2 системы (таблица). Стоит отметить, что структура системы I-E у всех штаммов была канонической и состояла из 8 cas генов (cas3, cas8e, cse2, cas6, cas7, cas5, cas1, cas2) (рисунок, а).

 

Структура CRISPR–Cas-систем изученных ctxAB–tcpA–-штаммов V. cholerae О1 El Tor.

а — канонический подтип I-E, присутствующий в штамме V. cholerae 29; б — подтип I-C штамма V. cholerae М1526; в — подтип I-F штамма V. cholerae 617; г — подтип I-F mini штамма V. cholerae M1426; д — подтип III-B штамма V. cholerae М1320. Чёрными вертикальными линиями справа отмечены спейсеры (CRISPR).

 

Три штамма — V. cholerae М1413, М1516, М1526 — включали подтип I-С (таблица, рисунок, б). Пять штаммов (V. cholerae 617, 102, М1457, М1516, М1526) содержали полноценную CRISPR–Cas-систему I-F подтипа с 6 cas генами (cas1, cas3, cas8f, cas5, cas7, cas6f: таблица, рисунок, в). У ряда штаммов выявлена усечённая I-F система (cas6f, cas7f, cas8f), состоящая из 3 cas генов, обозначенная нами I-F mini (рисунок, г). Стоит отметить, что в данной системе отсутствует ген cas3. Два штамма — V. cholerae М1320 и 617 — имели тип III, подтип III-В (cmr1, cas10, cmr3, cmr4, cmr5, cmr6, csx23, cas6f; таблица, рисунок, д).

Нетоксигенные ctxА–tcpА–-штаммы с CRISPR–Cas-системой распространены в России достаточно широко. Данные штаммы выделялись в разные годы на территории республик Татарстан, Дагестан, Башкирия, Мордовия, Калмыкия, а также Астраханской, Саратовской областей и Пермского края (таблица).

Следующий этап работы был посвящён выявлению спейсеров. Они присутствовали практически во всех системах, их количество варьировало от 1 до 80, при этом наибольшее количество спейсеров обнаружено в системе I-E. Исключение составили 4 штамма, содержащие систему I-F mini, в которой спейсеры отсутствовали (таблица). У штамма М-988 из-за некачественной полногеномной нуклеотидной последовательности, представленной в GenBank, достоверно идентифицировать спейсеры не удалось. Выявленные спейсеры были гомологичны протоспейсерным последовательностям ДНК большого количества литических и умеренных фагов, а также плазмид и транспозона V. cholerae (фаги: O395, VPUSM 8, K139, K491, K571, K575, VcP032, Kappa, Rostov 7, X29, phi 2, JSF1, JSF2, JSF4, JSF5, JSF6, JSF13, JSF14, JSF17, VMJ710, Rostov M3, CP-T1, 24, vB_VchM-138, vB_VchM_VP-3213, Ch457, E8498, fs1, fs2, Vb_VaM_Valp1, ICP1, VRU, VP24-2_Ke, VMJ710, VcP032, VEJphi, VSK, VSKK, ND1-fs1, KSF-1phi, VGJphi, 1.178.O._10N.286.45.E12, 1.028.O._10N.286.45.B6, 1.159.O._10N.261.46.F12, martha 12B12, jenny 12G5, vB_Vipa26, vB_Vipa10, vB_Vipa4291, vB_Vipa71, vB_VpS_PG07, Zoerhiza.4_15, 13VV501A, 6E35-1b, D481, D483, D485, D491s, D527, VaK; плазмиды: HDW18, pSA7G1, pSA7G2; транспозон Tn7005). Кроме того, обнаружены спейсеры, гомологичные нуклеотидным последовательностям фагов и плазмид представителей рода Vibrio (V. alginolyticus, V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. fluvialis, V. furnissii, V. nigripulchritudo, V. metschnikovii), а также неродственных видов бактерий (Klebsiella sрp., Escherichia sрp., Salmonella sрp., Shigella, Shewanella algae, Xanthomonas, Stenotrophomonas). Стоит отметить наличие в некоторых штаммах (V. cholerae 102, М1428, М1431, М1443, М1444, М1457, М1460, М1486) спейсеров, идентичных участкам ДНК фага ICP1 (самый распространённый на эндемичных территориях бактериофаг), выделенного в разные годы в Демократической Республике Конго и Бангладеш.

Таким образом, в геноме изученных нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor выявлены следующие антифаговые системы: рестрикции–модификации I типа (ctxAB–tcpA+), CBASS (ctxAB–tcpA+ и ctxAB–tcpA–) и CRISPR-Cas 1-го класса (ctxAB–tcpA–).

Обсуждение

Учитывая, что нетоксигенные штаммы V. cholerae О1 El Tor циркулируют в открытых водоёмах, которые являются и местом обитания различных видов холерных фагов, ожидалось, что в их геноме будет обнаружено большое количество антифаговых систем. Однако в данных штаммах отсутствуют антифаговые острова PLE, BREX и DISARM-системы. У ctxAB–tcpA–-штаммов не выявлены системы рестрикции–модификации I типа, которые обнаружены в геноме ctxAB–tcpA+-штаммов. Гены системы CBASS присутствуют у единичных штаммов обеих групп. В то же время 35 изученных клинических и выделенных из водной среды на различных территориях России и сопредельных стран ctxAB–tcpA–-штаммов содержат CRISPR–Cas-систему 1-го класса типов I и III, которая отсутствует в ctxAB–tcpA+-изолятах. При этом подтипы I-С и III-В выявлены в единичных штаммах. В то же время 57% штаммов имеют канонический тип системы I-E. Наши данные подтверждают ранее полученные сведения при анализе штаммов, циркулирующих на эндемичной территории, о широком распространении системы I-E среди нетоксигенных штаммов V. cholerae [20]. Ряд авторов высказывают предположение о том, что стабильное сохранение структуры системы I-E обусловлено тем, что она расположена на геномном острове GI-24 и перенос её в другие штаммы происходит только в составе указанного мобильного генетического элемента [20, 22]. Некоторые штаммы включали также полноценную систему I-F, которая входит в состав недавно обнаруженного острова патогенности VPI-6 (Vibrio Pathogenicity Island), способного, как и GI-24, целиком вырезаться из хромосомы и переноситься в другие клетки [23]. В то же время бóльшая часть штаммов имела систему I-F mini, у которой рядом с локусами генов cas расположен ген tniQ, ответственный за продукцию транспозазы. Согласно данным литературы, подобные системы ассоциированы с Tn7-транспозоном [20]. Учитывая отсутствие в данной системе гена cas3, кодирующего хеликазу-нуклеазу, можно предположить, что I-F mini является нефункциональной.

Поскольку новые спейсеры внедряются преимущественно в 5’-области системы, CRISPR представляет собой хронологическую запись взаимодействия бактерии с мобильными генетическими элементами. В связи с этим наличие у ряда штаммов спейсеров, гомологичных генетическому материалу фага ICP1, циркулирующему на эндемичных территориях, может указывать на завозной характер данных штаммов. Также очевидно, что, защищая V. cholerae от хищничества холерных фагов, а также фагов других бактерий, CRISPR–Cas-система повышает выживаемость нетоксигенных штаммов во внешней среде. Возможно, её присутствие является одним из механизмов длительной циркуляции нетоксигенных штаммов в воде открытых водоёмов.

Таким образом, изученные нетоксигенные ctxAB–tcpA+- и ctxAB–tcpA–-штаммы V. cholerae О1 El Tor, выделяемые на территории России и сопредельных стран, лишены ряда мобильных генетических элементов с антифаговыми локусами (острова PLE, ICE SXT элементы c системами BREX и DISARM). В то же время в геноме ctxAB–tcpA+-штаммов выявлена система рестрикции–модификации I типа, у одного штамма — CBASS (ctxAB–tcpA+ и ctxAB–tcpA–) и CRISPR–Cas 1-го класса (ctxAB–tcpA–).

Заключение

В результате проведённых исследований установлена гетерогенность изученных нетоксигенных штаммов V. cholerae О1 El Tor, циркулирующих на территории России и сопредельных стран, по наличию антифаговых систем, расположенных на мобильных генетических элементах, что расширяет сведения об их генетической организации. Установлено, что 80% изученных ctxАВ–tcpА+-штаммов содержат систему рестрикции–модификации I типа, которая не обнаружена у ctxАВ–tcpА–-штаммов. Единичные штаммы (1 ctxАВ–tcpА+ и 3 ctxАВ–tcpА–) имеют систему CBASS, при этом у ctxАВ–tcpА+-изолята она является интактной и соответствует токсигенному референс-штаммму V. cholerae N16961 О1 El Tor. В геноме 32% исследованных ctxАВ–tcpА–-штаммов выявлена CRISPR–Cas-система 1-го класса типов I (подтипов I-E, I-F, I-F mini, I-C) и III (подтип III-В), отсутствующая у ctxАВ–tcpА+-штаммов. При этом наиболее распространённой (57%) является каноническая система подтипа I-E. Присутствие нескольких типов и подтипов CRISPR–Cas-системы в геноме ряда штаммов может указывать на её неоднократное приобретение данными изолятами посредством горизонтального переноса. Анализ спейсеров в CRISPR-кассете позволяет выявлять нетоксигенные штаммы V. cholerae О1 El Tor, завезённые с эндемичных по холере территорий.

 

1 https://github.com/Russel88/CRISPRCasTyper

2 https://github.com/dcouvin/CRISPRCasFinder

×

Об авторах

Светлана Петровна Заднова

Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: svetlanazadnova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4366-0562

д-р биол. наук, в. н. с., зав. лаб. патогенных вибрионов отдела микробиологии

Россия, Саратов

Никита Александрович Плеханов

Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: muscari.sp@icloud.com
ORCID iD: 0000-0002-2355-7018

канд. биол. наук, с. н. с. лаб. патогенных вибрионов отдела микробиологии

Россия, Саратов

Данил Александрович Сергутин

Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Автор, ответственный за переписку.
Email: sergutin322@mail.ru
ORCID iD: 0009-0003-7525-9682

лаборант-исследователь лаб. патогенных вибрионов отдела микробиологии

Россия, Саратов

Надежда Борисовна Челдышова

Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0001-5759-3765

канд. мед. наук, с. н. с. лаб. патогенных вибрионов отдела микробиологии

Россия, Саратов

Андрей Витальевич Федоров

Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0001-7190-4427

м. н. с. лаб. геномного и протеомного анализа отдела микробиологии

Россия, Саратов

Ярослав Михайлович Краснов

Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: rusrapi@microbe.ru
ORCID iD: 0000-0002-4909-2394

канд. хим. наук, зав. лаб. геномного и протеомного анализа отдела микробиологии

Россия, Саратов

Список литературы

  1. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Баранихина Е.Ю. и др. Структура генома и происхождение нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор с различной эпидемиологической значимостью. Генетика. 2016;52(9):1029–41. DOI: https://doi.org/10.7868/S0016675816060126 EDN: https://elibrary.ru/wlnekj Smirnova N.I., Kul’shan’ T.A., Baranikhina E.Y., et al. Genome structure and origin of nontoxigenic strains of Vibrio cholerae of El Tor biovar with different epidemiological significance. Genetics. 2016; 52(9): 1029–41. DOI: https://doi.org/10.1134/S1022795416060120 EDN: https://elibrary.ru/xfheir
  2. Кругликов В.Д., Левченко Д.А., Титова С.В. и др. Холерные вибрионы в водоёмах Российской Федерации. Гигиена и санитария. 2019;98(4):393–9. Kruglikov V.D., Levchenko D.A., Titova S.V., et al. Vibrio cholerae in the waters of the Russian Federation. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian journal). 2019;98(4):393–9. EDN: https://elibrary.ru/dfqoan
  3. Левченко Д.А., Кругликов В.Д., Гаевская Н.Е. и др. Фено- и генотипические особенности нетоксигенных штаммов холерных вибрионов различного происхождения, изолированных на территории России. Проблемы особо опасных инфекций. 2020;(3):89–96. Levchenkо D.А., Kruglikov V.D., Gaevskaya N.E., et al. Pheno- and genotypical features of non-toxigenic strains of cholera vibrios of different origins, isolated in the territory of Russia. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2020;(3):89–96. DOI: https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-3-89-96 EDN: https://elibrary.ru/rvjkhr
  4. Миронова Л.В., Бочалгин Н.О., Гладких А.С. и др. Филогенетическое положение и особенности структуры геномов ctxAB–tcpA+ Vibrio cholerae из поверхностных водоемов на неэндемичной по холере территории. Проблемы особо опасных инфекций. 2020;(1):115–23. Mironova L.V., Bochalgin N.O., Gladkikh A.S., et al. Phylogenetic affinity and genome structure features of ctxAB–tcpA+ Vibrio cholerae from the surface water bodies in the territory that is non-endemic as regards cholera. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2020;(1):115–23. DOI: https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-1-115-123 EDN: https://elibrary.ru/uubigv
  5. Монахова Е.В., Носков А.К., Кругликов В.Д. и др. Генотипическая характеристика клональных комплексов CTX–VPI+ Vibrio cholerae О1, обнаруживаемых в водоемах Ростовской области. Проблемы особо опасных инфекций. 2023;(3):99–107. Monakhova E.V., Noskov A.K., Kruglikov V.D., et al. Genotypic characteristics of CTX–VPI+ clonal complexes of Vibrio cholerae O1 found in water bodies of the Rostov region. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2023;(3):99–107. DOI: https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-3-99-107
  6. Носков А.К., Кругликов В.Д., Москвитина Э.А. и др. Холера: анализ и оценка эпидемиологической обстановки в мире и России. Прогноз на 2023 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2023;(1):56–66. Noskov A.K., Kruglikov V.D., Moskvitina E.A., et al. Cholera: analysis and assessment of epidemiological situation around the world and in Russia (2013–2022). Forecast for 2023. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2023;(1):56–66. DOI: https://doi.org/10.21055/0370-1069-2023-1-56-66 EDN: https://elibrary.ru/hzasbo
  7. Попова А.Ю., Носков А.К., Ежлова Е.Б. и др. Эпидемиологическая ситуация по холере в Российской Федерации в 2023 г. и прогноз на 2024 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2024;(1):76–88. Popova A.Yu., Noskov A.K., Ezhlova E.B., et al. Epidemiological situation on cholera in the Russian Federation in 2023 and forecast for 2024. Problems of Particularly Dangerous Infections. 2024;(1):76–88. DOI: https://doi.org/10.21055/0370-1069-2024-1-76-88 EDN: https://elibrary.ru/ipvmuo
  8. Агафонова Е.Ю., Смирнова Н.И., Альхова Ж.В. и др. Нетоксигенные штаммы Vibrio cholerae биовара Эль Тор, выделенные на территории России: молекулярно-генетические особенности и патогенные свойства. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019;96(2):13–24. Agafonova E.Yu., Smirnova N.I., Alkhova Zh.V., et al. On-toxigenic strains of Vibrio cholerae biovar El Tor, isolated in the territory of Russia: molecular-genetic peculiarities and pathogenic properties. Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2019;96(2):13–24. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-2-13-24 EDN: https://elibrary.ru/yijsem
  9. Faruque S.M., Mekalanos J.J. Phage-bacterial interactions in the evolution of toxigenic Vibrio cholerae. Virulence. 2012;3(7):556–65. DOI: https://doi.org/10.4161/viru.22351
  10. Angermeyer A., Hays S.G., Nguyen M.H.T., et al. Evolutionary sweeps of subviral parasites and their phage host bring unique parasite variants and disappearance of a phage CRISPR-Cas system. mBio. 2022;13(1):e03088-21. DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.03088-21
  11. Tumban E., ed. Bacteriophages. Methods and Protocols. New York: Humana Press; 2024.
  12. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of a novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates. Microbiology. 2002;148(Pt. 11):3681–93. DOI: https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3681
  13. Labrie S.J., Samson J.E., Moineau S. Bacteriophage resistance mechanisms. Nat. Rev. Microbiol. 2010;8(5):317–27. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2315
  14. Brenzinger S., Airoldi M., Ogunleye A.J., et al. The Vibrio cholerae CBASS phage defence system modulates resistance and killing by antifolate antibiotics. Nat. Microbiol. 2024;9(1):251–62. DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01556-y
  15. LeGault K.N., Hays S.G., Angermeyer A., et al. Temporal shifts in antibiotic resistance elements govern phage-pathogen conflicts. Science. 2021;373(6554):eabg2166. DOI: https://doi.org/10.1126/science.abg2166
  16. Заднова С.П., Плеханов Н.А., Спирина А.Ю., Челдышова Н.Б. Анализ антифаговых систем в штаммах Vibrio cholerae O1 биовара Эль Тор. Здоровье населения и среда обитания – ЗНиСО. 2023;31(11):94–100. Zadnova S.P., Plekhanov N.A., Spirina A.Yu., Cheldyshova N.B. Analysis of Antiphage Systems in Vibrio cholerae O1 El Tor Biotype Strains. Public Health and Life Environment – PH&LE. 2023;31(11):94–100. DOI: https://doi.org/10.35627/2219-5238/2023-31-11-94-100 EDN: https://elibrary.ru/miocic
  17. O’Hara B.J., Barth Z.K., McKitterick A.C., Seed K.D. A highly specific phage defense system is a conserved feature of the Vibrio cholerae mobilome. PLoS Genet. 2017;13(6):e1006838. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006838
  18. McKitterick A.C., Seed K.D. Anti-phage islands force their target phage to directly mediate island excision and spread. Nat. Commun. 2018;9(1):2348. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-018-04786-5
  19. Barth Z.K., Silvas T.V., Angermeyer A., Seed K.D. Genome replication dynamics of a bacteriophage and its satellite reveal strategies for parasitism and viral restriction. Nucleic Acids Res. 2020;48(1): 249–63. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkz1005
  20. McDonald N.D., Regmi A., Morreale D.P., et al. CRISPR-Cas systems are present predominantly on mobile genetic elements in Vibrio species. BMC Genomics. 2019;20(1):105. DOI: https://doi.org/10.1186/s12864-019-5439-1
  21. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat. Rev. Microbiol. 2020;18(2):67–83. DOI: https://doi.org/10.1038/s41579-019-0299-x
  22. Chakraborty S., Waise T.M., Hassan F., et al. Assessment of the evolutionary origin and possibility of CRISPR-Cas (CASS) mediated RNA interference pathway in Vibrio cholerae O395. In Silico Biol. 2009;9(4):245–54.
  23. Carpenter M.R., Kalburge S.S., Borowski J.D., et al. CRISPR-Cas and contact-dependent secretion systems present on excisable pathogenicity islands with conserved recombination modules. J. Bacteriol. 2017;199(10):e00842-16. DOI: https://doi.org/10.1128/jb.00842-16

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Структура CRISPR–Cas-систем изученных ctxAB–tcpA–-штаммов V. cholerae О1 El Tor. а — канонический подтип I-E, присутствующий в штамме V. cholerae 29; б — подтип I-C штамма V. cholerae М1526; в — подтип I-F штамма V. cholerae 617; г — подтип I-F mini штамма V. cholerae M1426; д — подтип III-B штамма V. cholerae М1320. Чёрными вертикальными линиями справа отмечены спейсеры (CRISPR).

Скачать (503KB)
Метаданные

© Заднова С.П., Плеханов Н.А., Сергутин Д.А., Челдышова Н.Б., Федоров А.В., Краснов Я.М., 2025

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».