Comparative analysis of the structure of regulatory genes of Vibrio cholerae serotype О1 biotype El Tor strains

Full Text

Введение

Холера — особо опасная инфекционная болезнь, вызываемая токсигенными штаммами Vibrio cholerae, остается серьёзной проблемой здравоохранения во многих странах Азии, Африки, Америки (регион Карибского бассейна). Ежегодно регистрируется около 2,9 млн случаев холеры, из которых более 95 000 заканчиваются летально. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, с середины 2021 г. отмечается рост заболеваемости и смертности от данной болезни¹. Так, средний показатель летальности в 2021 г. составил 1,9% (в странах Африки — 2,9%), что является самым высоким за последнее десятилетие, и данная тенденция сохранилась в 2022–2023 гг. Остаётся высоким риск завоза возбудителя в любую страну мира [1].

Текущая, 7-я, пандемия холеры является самой длительной (продолжается уже более 60 лет) и включает несколько линий штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor с определённой структурой генов ctxAB и tcpA-F, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя холеры — холерный токсин (ХТ) и токсин-корегулируемые пили адгезии (ТКПА) [3, 4]. Начало пандемии было вызвано типичными штаммами V. cholerae О1 биовара El Tor, содержащими аллели ctxB3 и tcpA^eltor. В 1990-х гг. появились генетически изменённые варианты V. cholerae О1 биовара El Tor (геноварианты), которые отличались от типичных штаммов повышенной продукцией ХТ в результате замены аллеля ctxB3 на ctxB1, характерного для возбудителя 6-й пандемии — V. cholerae О1 классического биовара. Дальнейшие эволюционные преобразования геновариантов способствовали появлению «гипервирулентных» штаммов, которые не только имеют новые аллели ctxB — ctxB7 и tcpA — tcpA^cirs101, но и включают около 70 генов с единичными нуклеотидными заменами, а также делеции в мобильных генетических элементах [2–6]. При этом рядом авторов показано, что повышение вирулентности геновариантов V. cholerae О1 El Tor связано с изменением структуры основных генов патогенности (ctxB и tcpA), другими — с появлением мутаций в структуре ряда регуляторных генов [6–8]. Как известно, экспрессия генов ctxAB и tcpA-F контролируется сложным регуляторным каскадом с участием различных положительных и отрицательных факторов транскрипции, а также зависит от плотности бактериальной популяции, сигналов внешней среды (температура, соли желчных кислот, рН среды, осмолярность и т.д.) и продуцируемых сигнальных молекул (в том числе 3´,5´-циклического дигуанинмонофосфата, c-di-GMP). Непосредственным транскрипционным активатором генов ctxAB и tcpA-F является белок ТохТ, продукция которого контролируется белком ToxR, играющим важную роль в вирулентности холерного вибриона. Для активации транскрипции toxТ белок ToxR взаимодействует с другими белками — ToxS и TcpPH. В свою очередь транскрипция генов tcpPH зависит от белков AphAВ. Показано, что активная экспрессия AphAB происходит при низкой плотности бактериальной популяции. В данных условиях фосфорилированный белок системы «quorum sensing» LuxO ингибирует экспрессию quorum-чувствительного регуляторного белка HapR (оказывающего негативное влияние на каскад вирулентности) — происходит продукция ХТ и ТКПА [9, 10]. Кроме AphA с промотером tcpP при нахождении патогена in vivo связывается и белок CarR, действующий совместно с CarS, что способствует увеличению колонизирующей способности штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor. Кроме того, в присутствии катионных антимикробных пептидов (HD-5, α-дефензин, β-дефензин), продуцируемых эпителиальными клетками, CarR непосредственно регулирует экспрессию генов, кодирующих систему модификации липида А липополисахарида клеточной стенки (оперон almEFG), что придаёт устойчивость бактерий к катионным пептидам и обеспечивает нормальный рост вибрионов в кишечнике. Таким образом, белок CarR регулирует вирулентность возбудителя и способствует устойчивости патогена в макроорганизме [11].

При увеличении количества бактерий фосфолирирования LuxO не происходит, и он не блокирует hapR. Продуцируемый белок HapR подавляет транскрипцию aphAB и tcpPH. В итоге прекращается биосинтез факторов вирулентности [9, 10]. Кроме LuxO, транскрипцию hapR репрессирует и недавно обнаруженный у патогена белок LuxT, который также непосредственно связывается с промоторной областью hapR [11]. Негативным регулятором транскрипции генов ctxAB и tcpA-F является и ДНК-связывающий гистоноподобный белок H-NS, который репрессирует транскрипцию toxT, а также блокирует транскрипцию генов ctxAB и tcpA, связываясь с той же областью ДНК, что и белок ТохТ [12]. Ещё одним белком, участвующим в регуляции продукции факторов вирулентности, посредством контроля содержания вторичного мессенджера c-di-GMP (cyclic diguanosine monophosphate), является VieA, кодируемый геном vieA из оперона vieSAB. Транскрипция гена vieA в клетках подавляется как белком H-NS, так и HapR. Данный белок содержит ДНК-связывающий участок, а также домен (EAL) с дигуанилат-фосфодиэстеразной активностью, гидролизующий c-di-GMP. Накапливаясь в клетках в высокой концентрации, c-di-GMP ингибирует транскрипцию генов ctxAB и toxT, и деградация этой молекулы способствует увеличению биосинтеза ХТ и ТохТ [13].

Также стоит отметить, что регуляторные гены, контролирующие не только вирулентные, но и другие свойства бактерий (в том числе формирование биоплёнки), выступают в качестве перспективных мишеней для создания антимикробных препаратов нового поколения. В настоящее время проводятся исследования по поиску и синтезу антимикробных пептидов, способных снижать вирулентность возбудителя холеры и разрушать образование биоплёнок без токсического воздействия на макроорганизм. При этом перспективной мишенью выбран белок LuxO [14].

Таким образом, структура генов ctxB и tcpA у геновариантов V. cholerae О1 El Tor, завезённых в разные годы на территорию России и сопредельных стран, достаточно подробно изучена [15–18]. В то же время распространённость мутаций в регуляторных генах в данных штаммах исследована фрагментарно. Цель работы — сравнительный анализ структуры регуляторных генов в штаммах V. cholerae О1 биовара El Tor, изолированных на территории России и сопредельных стран на протяжении 7-й пандемии холеры.

Материалы и методы

В работе использовали полногеномные последовательности 29 токсигенных штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor, завезённых с 1970 по 2023 г. на территорию России и сопредельных стран, депонированные в NCBI GenBank и в VGARus (штаммы M3208 и M3210). Характеристика использованных штаммов приведена в таблице.

 

Характеристика и результаты анализа структуры регуляторных генов штаммов V. cholerae O1 серогруппы биовара El Tor, использованных в работе

Characteristics and results of analysis of the structure of regulatory genes of V. cholerae O1 strains of the El Tor biovar serogroup used in the study

Штамм Strains	Год, место и источник выделения The year, site and source of isolation	Структура гена (замена аминокислот) | Gene structure (amino acid substitutions)
		toxT VC0838	aphA/aphB VC2647/VC1049	hns VC1130	hapR VC0583	vieA VC1652	luxO/luxT VC1021/VCA0917	carR/carS VC1320/VC1319
Типичные штаммы V. cholerae О1 El Tor с аллелем ctxB3 | Typical V. cholerae O1 El Tor strains with the ctxB3 allele
М1062 (SSAB01)	1970, РФ, Астрахань, больной RF, Astrakhan, patient	int	int/int	int	insТ219, C118G (H40D)	int	int/int	int/int
М893 (SSAA01)	1970, РФ, Астрахань, больной RF, Astrakhan, patient	int	int/int	int	insТ219	int	int/int	int/int
М818 (LAHM01)	1970, РФ, Балаково, больной RF, Balakovo, patient	int	int/int	int	insТ219	int	int/int	int/int
М1030 (NEDX01)	1972, Туркменистан, Йолотен, больной Turkmenistan, Ioloten, patient	int	int/int	int	insТ219	int	A521G (H174R)/int	int/int
С-191 (WNZT01)	1973, РФ, Ставрополь, больной RF, Stavropolʼ, patient	int	int/int	int	insТ219, C109T (R37C)	insTTC p:365	int/int	int/int
123AZ (SMZB01)	1977, Азербайджан, больной Azerbaijan, patient	int	int/int	int	Δ	int	int/int	int/int
2278 (WNZM01)	1987, РФ, Краснодар, больной RF, Krasnodar, patient	int	int/int	int	insТ219, G76A (A26T)	int	A340G (K114E)/int	int/int
Геноварианты V. cholerae О1 El Tor с аллелем ctxB1 | Genetic variants of V. cholerae O1 El Tor with the ctxB1 allele
P13762 (LQYD01)	1988, Узбекистан, Ташкент, больной Uzbekistan, Tashkent, patient	int	int/int	int	insТ219	int	int/int	int/int
М1270 (VXCC01)	1993, РФ, Татарстан, Набережные Челны, больной RF, Tatarstan, Naberezhnye Chelny, patient	int	int/int	int	insТ219	int	T98C (I33T)/int	int/int
М1275 (LRAF01)	1993, РФ, Дагестан, Каспийск, больной RF, Dagestan, Kaspiysk, patient	int	int/int	int	int	int	int/int	int/int
М1293 (JFFW01)	1994, РФ, Дагестан, больной RF, Dagestan, patient	int	int/int	int	insТ219	int	T176A (L59H)/int	int/int
20-А-11 (PYAR01)	1995, Украина, больной Ukraine, patient	int	int/int	int	insТ219	int	int/int	int/int
R17644 (JRTW01)	1997, РФ, Ачинск, больной RF, Achinsk, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	int	T62A (I21N)/int	int/int
М1327 (LRFE01)	1998, РФ, Дагестан, больной RF, Dagestan, patient	int	int/int	int	insТ219	int	int/int	int/int
М1344 (NEDY01)	2001, РФ, Татарстан, Казань, больной RF, Tatarstan, Kazan, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	int	int/int	int/int
М1429 (LAEM01)	2004, РФ, Башкортостан, Белорецк, больной RF, Bashkortostan, Beloretsk patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	int/int	int/int
RND18826 (AYOM01)	2005, РФ, Тверь, больной RF, Tver, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	G424T (V142L)/int	int/int
Р-18899 (LAKM01)	2006, РФ, Мурманск, больной RF, Murmansk, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	C527T (A176V)/int	int/int
89 (NDXR01)	2010, Украина, Ялта, вн. ср. Ukraine, Yalta, env.	int	int/int	int	insТ219	int	T287G (I96S)/Δ	int/int
2011EL-301 (AJFN01)	2011, РФ, Таганрог, вн. ср. RF, Taganrog, env.	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	G424T (V142L)//int	int/int
81 (JRQM01)	2014, РФ, Ростов-на-Дону, вн. ср. RF, Rostov-on-Don, env.	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	G424T (V142L)/int	int/int
М3210 (micr026579)	2023, РФ, Ростов-на-Дону, вн. ср. RF, Rostov-on-Don, env.	G436A (V146I)	int/int	int	insТ219	int	G331A (A111T)/int	int/int
Геноварианты V. cholerae О1 El Tor с аллелем ctxB7 | Genetic variants of V. cholerae O1 El Tor with the ctxB7 allele
L3226 (JDVX01)	2010, РФ, Москва, больной RF, Moscow, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	T287G (I96S)/int	int/int
RND19191 (JNGT01)	2010, РФ, Москва, больной RF, Moscow, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	int/int	int/int
76 (MPVL01)	2011, Украина, Мариуполь, больной Ukraine, Mariupol, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	int/int	int/int
153 (MWRE01)	2011, Украина, Мариуполь, больной Ukraine, Mariupol, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	G268T (G90C)/int	int/int
М1509 (NEDZ01)	2012, РФ, Москва, больной RF, Moscow, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	int/int	G256A (D89N)/int
3265/80 (JRQL01)	2014, РФ, Москва, больной RF, Moscow, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insТ219	C235T (L79F)	int/int	G256A (D89N)/int
М3208 (micr026578)	2023, РФ, Тамбов, больной RF, Tambov, patient	int	int/int	G319A (G107S)	insCTAAA97 (33fs)	C235T (L79F)	int/int	G256A (D89N)/int

Примечание. В столбце «Штамм» в скобках указан сокращённый код доступа в GenBank, курсивом выделен код доступа в VGARus; вн. ср. — внешняя среда; ins — вставка нуклеотида(ов); int — структура гена идентична референс-штамму V. cholerae N16961 O1 биовара El Tor; fs — сдвиг рамки считывания; Δ — делеция гена.

Note. The GenBank accession number is indicated in parentheses in the Strains column, the VGARus accession number is indicated in italics; env. — environmental; ins − nucleotide insertion; int — the structure is identical to the reference strain V. cholerae N16961 O1 El Tor; fs − frameshift mutation; Δ — gene deletion.

Окончание таблицы | End of the Table

 

Штаммы хранились в лиофильно высушенном состоянии в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского противочумного института «Микроб». Для культивирования бактерий использовали бульон и агар LB (рН 7,2). Подготовку проб осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09². Подготовку образцов ДНК исследуемых штаммов проводили в боксе биологической безопасности II класса в противочумном костюме IV типа с использованием набора «TransGen EasyPure Genomic DNA Kit» в соответствии с протоколом производителя. Секвенирование ДНК осуществляли на платформе «DNBSEQ-G50» («MGI Tech») с использованием стандартного протокола подготовки ДНК-библиотек, соответствующего платформе.

Анализ структуры регуляторных генов toxT, aphA/aphB, hns, hapR, vieA, luxO/luxT, carR/carS проводили с помощью программы «BioEdit v7.2.6.1» и алгоритма «BLAST v2.15.0 NCBI GenBank».

Результаты

На первом этапе работы была изучена структура гена toxT, кодирующего регуляторный белок ТохТ. Согласно данным литературы, указанный белок включает 276 аминокислот. Наиболее важным участком является N-терминальный домен (1–164 аминокислоты). Показано, что стабильное сохранение структуры N-терминального участка необходимо для транскрипционной активности данного регулятора [19]. В результате проведённого нами анализа установлено, что структура данного гена у большинства взятых в исследование штаммов соответствует референс-штамму V. cholerae N16961 О1 биовара El Tor. Исключение составил штамм М3210 (Ростов-на-Дону, 2023) у которого обнаружена несинонимичная однонуклеотидная замена G436A, которая привела к смене аминокислоты валина на изолейцин в позиции 146 в N-терминальном домене белка ТохТ.

Изменений в нуклеотидной последовательности генов aphA и aphB у взятых в исследование штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor не выявлено.

При изучении структуры гена luxO показано, что у большинства типичных штаммов структура данного гена соответствовала референсному штамму. Исключение составили штаммы V. cholerae М1030 и 2278, имеющие несинонимичные замены, что привело к смене аминокислот в центральном и аминотерминальном участках белка LuxO. Среди геновариантов 11 штаммов имели несинонимичные SNP (таблица). Сведения о влиянии указанных аминокислотных замен на функциональную активность белка LuxO в литературе отсутствуют. Однако практически все изученные штаммы V. cholerae О1 биовара El Tor имели интактную последовательность гена luxT. Белок LuxT, как и LuxO, ингибирует транскрипцию hapR. Исключение составил штамм V. cholerae 89 (Ялта, 2010), у которого ген luxT не обнаружен.

Далее нами была изучена структура гена hapR, кодирующего белок HapR. Согласно данным литературы, в штамме V. cholerae N16961 О1 El Tor, который используется в качестве референсного, в последовательности гена hapR имеется делеция тимина в позиции 219, что приводит к сдвигу рамки считывания и синтезу функционально неактивного белка HapR [20]. У большинства изученных нами штаммов присутствует ген hapR со вставкой тимина, что указывает на продукцию ими полноценного белка HapR. Исключение составили типичные штаммы V. cholerae 123AZ, у которого данный ген отсутствует, а также М1062, С-191 и 2278 с заменами аминокислот в начале N-концевого участка, не влияющими на формирование зрелого белка HapR и его функцию [21]. У геноварианта V. cholerae М3208 (Тамбов, 2023) в результате инсерции 5 нуклеотидов в начале гена происходит сдвиг рамки считывания. Данный штамм синтезирует белок HapR с изменённым аминокислотным составом и, вполне вероятно, с изменённой функциональной активностью.

При изучении нуклеотидной последовательности гена hns, кодирующего белок-репрессор H-NS, выявлено, что у типичных штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor, а также у геновариантов, завезённых в 1988–1995 гг., нуклеотидная последовательность данного гена соответствует последовательности аналогичного гена референс-штамма V. cholerae N16961 О1 El Tor. Изменённая структура гена hns (замена G на A в позиции 319) выявлена у геноварианта R17644 (Ачинск, 1997), имеющего аллель ctxB1. Мутация G319A привела к смене аминокислоты (G107S) в ДНК-связывающем участке белка H-NS (таблица). В последующие годы геноварианты с аллелем ctxB1 включали как интактный, так мутантный ген hns. В то же время мутация G319A в гене hns присутствует у всех геновариантов V. cholerae О1 биовара El Tor, имеющих аллель ctxB7.

Анализ гена vieA из оперона vieSAB показал наличие интактной его последовательности у 5 типичных штаммов. Исключение составил штамм V. cholerae С191, у которого обнаружена вставка 3 нуклеотидов, кодирующих лизин, в результате чего синтезируется белок VieA с изменённой аминокислотной последовательностью. Геноварианты V. cholerae О1 El Tor с ctxB1, завезённые с 1988 по 2001 гг., имеют интактный ген vieA. В то же время у V. cholerae М1429 (Белорецк, 2004) уже присутствует SNP (С235Т), приводящая к замене аминокислоты (L79F). В последующие годы белок VieA с данной аминокислотной последовательностью выявлен у большинства изученных геновариантов с аллелем ctxB1, а также у всех штаммов с аллелем ctxB7. Ранее подобные изменения в структуре белка VieA были выявлены K.J.F. Satchell c соавт. у геновариантов V. cholerae О1 биовара El Tor, выделенных в Зимбабве (2009), Бангладеш (2010), на острове Гаити (2010) [6].

Нуклеотидная последовательность гена carS является интактной у всех изученных штаммов, в то же время в гене carR выявлены изменения (таблица). В ранее проведённой работе нами обнаружены 2 геноварианта (M1509, 3265/80), в гене carR которых присутствует замена G256A, приводящая к смене аминокислот D89N [22]. В результате данной мутации синтезируется нефункциональный белок CarR и изменяется диагностически значимый признак El Tor вибрионов — устойчивость к полимиксину В, штаммы становятся чувствительными к указанному катионному антибиотику [23]. В данной работе выявлен ещё один штамм — V. cholerae М3208 (Тамбов, 2023), который также содержит мутацию G256A в гене carR (таблица).

Обсуждение

Продукция основных факторов патогенности — ХТ и ТКПА в штаммах V. cholerae О1 серогруппы биовара El Tor контролируется значительным количеством регуляторных белков, образующих регуляторную сеть. При этом некоторые из них являются полифункциональными и участвуют в других процессах бактериальной клетки. В данной работе нами был проведён анализ 10 регуляторных генов и выявлены важные изменения, характерные для современных штаммов возбудителя.

При анализе нуклеотидной последовательности гена toxT установлена её идентичность данному гену референс-штамма V. cholerae N16961 практически у всех изученных как типичных штаммов, так и геновариантов с разными аллелями ctxB. Исключение составил геновариант V. cholerae М3210 (Ростов-на-Дону, 2023), у которого присутствие несинонимичной SNP в гене toxT привело к продукции мутантного белка ТохТ с заменой валина на изолейцин в позиции 146. В ранее проведённой работе показано, что при замене валина на аргинин (V146A) мутантный штамм сохранял высокий уровень продукции ХТ и ТКПА, сопоставимый с исходным, при выращивании его в разных средах (LB, AKI) при температуре 30ºС. В то же время культивирование мутантного штамма при температуре 37ºС приводило к значительному снижению биосинтеза ХТ (9% от исходного) и полному отсутствию продукции ТКПА [19]. Можно высказать предположение, что у штамма V. cholerae М3210 биосинтез ХТ и ТКПА также будет зависеть от температуры культивирования. Однако для проверки данного предположения необходимы дополнительные исследования.

Стабильное сохранение структуры генов aphA и aphB у штаммов V. cholerae O1 биовара El Tor, завезённых и выделенных на территории России и сопредельных стран в разные периоды текущей пандемии холеры, может указывать на их важную роль в биологии возбудителя холеры. Так, белок AphA участвует не только в контроле продукции ХТ и ТКПА, но и в биосинтезе ацетоина, который противодействует закислению среды при росте холерного вибриона в присутствии глюкозы, а также контролирует процесс формирования биоплёнки [24, 25]. Достаточно стабильной является и структура гена hapR — выявлен только 1 штамм (V. cholerae М3208), завезённый из Индии в 2023 г., который содержит вставку 5 нуклеотидов в данном гене, что приводит к сдвигу рамки считывания и, возможно, биосинтезу нефункционального белка HapR. В ранее проведённой работе показано, что наличие функционального белка HapR не является существенным для проявления патогенных свойств V. cholerae. Штаммы с делетированным геном hapR были вирулентными [26].

При изучении другого негативного регулятора — белка H-NS установлено, что 46,7% изученных геновариантов с аллелем ctxB1, а также все штаммы с аллелем ctxB7 имеют несинонимичную SNP (G319A) в гене hns, что привело к замене аминокислот в позиции 107 (G107S). B.M. Carignan и соавт. показали, что в штаммах с данной мутаций белок H-NS теряет способность связываться с ДНК и репрессировать транскрипцию гена toxT, что приводит к увеличению продукции белка ТохТ, и вследствие этого возрастает биосинтез ХТ и ТКПА и повышаются вирулентные свойства штаммов [8]. Стоит отметить, что мутация в гене hns возникла уже вскоре после появления первых геновариантов V. cholerae О1 биовара El Tor, т. к. уже в 1997 г. на территорию России были завезены штаммы с мутацией G319A. Для геновариантов с аллелем ctxB7 указанная структура гена hns является уже характерным признаком (генетической меткой).

При анализе структуры гена vieA установлено, что штаммы с мутированным vieA (C235T) впервые были завезены в Россию в 2004 г. (таблица). Белок VieA играет важную роль в биологии штаммов классического биовара, т. к. регулирует транскрипцию 401 гена (10,3% генома). В то же время у El Tor вибрионов под контролем VieA находятся всего несколько генов, в том числе vps и rbm, кодирующие, соответственно, продукцию экзополисахарида и белковый матрикс биоплёнки [27]. Однако изменения в структуре гена vieA важны для El Tor вибрионов в совокупности с вариабельностью гена hns. Мутация G319A в гене hns приводит к повышению экспрессии штаммами ХТ, ТКПА, а также гемолизина HlyA и MARTX токсина, но при нахождении в кишечнике данные гипервирулентные штаммы становятся чувствительными к действию антимикробных пептидов и желчи хозяина. В то же время при изменении структуры гена vieA и продукции мутантного белка VieA данные штаммы in vivo приобретают устойчивость к действию указанных стрессоров [28]. В экспериментально полученных штаммах, содержащих нуклеотидную последовательность hapR с инсерцией тимина в позиции 219, наряду с наличием изменённой структуры hns (G319A) и/или vieA (C235T), биосинтез ХТ значительно возрастал [8]. Среди изученных нами ряд геновариантов с аллелем ctxB1, а также все штаммы с аллелем ctxB7 включают указанные гены (hns и vieA) с мутациями, что указывает на участие данных изменённых регуляторов в повышении продукции ХТ в данных штаммах.

Появление мутации G265А в гене carR у геновариантов V. cholerae О1 El Tor, выделенных в последние годы, согласно данным литературы, приводит к снижению транскрипционной активности белка CarR, что выражается в уменьшении экспрессии almEFG оперона и снижению процесса модификации липополисахарида клеточной стенки. В результате данного процесса клетки становятся чувствительными к действию катионного антимикробного препарата — антибиотику полимиксину В, что фенотипически in vitro проявляется изменением диагностически значимого признака и отсутствию роста штаммов V. cholerae О1 биовара El Tor в его присутствии [23]. Однако, возможно, при нахождении in vivo, в условиях воздействия катионных антимикробных пептидов хозяина, геноварианты, синтезирующие мутантный белок CarR, будут устойчивыми к их действию, т. к. они продуцируют мутантный белок VieA, который восстанавливает устойчивость патогена к действию данных стрессоров [28].

При анализе структуры гена luxO установлена его вариабельность как у типичных штаммов, так и у геновариантов. В изученной нами литературе отсутствуют сведения о влиянии выявленных мутаций на функциональную активность LuxO. Можно предположить, что наличие функционального LuxT практически у всех штаммов, как и LuxO, выполняющего ингибирующую функцию в отношении hapR, может компенсировать снижение или отсутствие активности LuxO. В ранее проведённой работе установлено, что у «гипервирулентного» геноварианта V. cholerae MQ1795 О1 биовара El Tor (Бангладеш, 1994), наряду с мутациями в hapR (вставка Т в позиции 219), hns (G319A), vieA (C235T), изменена и структура гена luxO (С656Т) [8]. Однако у изученных нами штаммов данная мутация не выявлена.

Заключение

Проведённое исследование показало, что нуклеотидная последовательность ряда изученных регуляторных генов (toxT, aphA, aphB, carS, luxT, hapR) у штаммов V. cholerae O1 El Tor, завезённых и выделенных на территории России и сопредельных стран, остаётся неизменной. В то же время структура других генов изменяется. Наиболее значимыми являются мутации в гене carR, что привело к изменению диагностически значимого признака и появлению чувствительных к антибиотику полимиксину В геновариантов V. cholerae O1 El Tor, а также в генах hns и vieA, кодирующих негативные регуляторы продукции факторов патогенности. Можно высказать предположение, что постепенное повышение вирулентности геновариантов V. cholerae O1 El Tor явилось результатом изменения регуляторных механизмов продукции основных факторов патогенности — ХТ и ТКПА вследствие появления мутаций как в структурных генах ctxB и tcpA, так и в регуляторных hns и vieA, кодирующих белки-репрессоры. При этом мутации, выявленные в генах hns (G319A), vieA (C235T) и carR (G256A) у всех изученных штаммов с аллелем ctxB7, могут быть использованы в качестве генетических меток современных геновариантов V. cholerae O1 El Tor.

 

¹ Cholera – Global situation. WHO Report; 2023. URL: https://who.int/emergencies/disease-outbreak-news/item/2023-DON437

² Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности: Методические указания МУ 1.3.2569-09. Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2009.

About the authors

Nikita A. Plekhanov

Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Author for correspondence.
Email: muscari.sp@icloud.com
ORCID iD: 0000-0002-2355-7018

Cand. Sci. (Biol.), senior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios

Russian Federation, Saratov

Andrey V. Fedorov

Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Email: muscari.sp@icloud.com
ORCID iD: 0000-0001-7190-4427

junior researcher, Laboratory of genomic and proteomic analysis

Russian Federation, Saratov

Nadezhda B. Cheldyshova

Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Email: muscari.sp@icloud.com
ORCID iD: 0000-0001-5759-3765

Cand. Sci. (Med.), senior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios

Russian Federation, Saratov

Alina Yu. Kuratashvili

Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Email: muscari.sp@icloud.com
ORCID iD: 0000-0001-9779-166X

junior researcher, Laboratory of pathogenic vibrios

Russian Federation, Saratov

Svetlana P. Zadnova

Research Anti-Plague Institute “Microbe”

Email: muscari.sp@icloud.com
ORCID iD: 0000-0003-4366-0562

D. Sci. (Biol.), leading researcher, Head, Laboratory of pathogenic vibrios

Russian Federation, Saratov

References