Ассоциированный с фосфатазой CD45 лимфоцитарный фосфопротеин LPAP регулирует её стабильность

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Ассоциированный с фосфатазой лимфоцитарный фосфопротеин (LPAP) является белком-партнёром фосфатазы CD45, однако его функция до сих пор мало изучена. Образование прочного комплекса между LPAP и CD45 позволяет предположить, что LPAP способен регулировать CD45, однако прямых биохимических подтверждений этому до сих пор не получено. Мы обнаружили, что на лимфоидных клетках Jurkat уровни белков LPAP и CD45 взаимосвязаны и коррелируют между собой. Нокаут LPAP приводит к снижению, а повышение его уровня, напротив, вызывает увеличение количества поверхностного CD45. На нелимфоидных клетках K562 такой корреляции не обнаруживалось. Мы предполагаем, что LPAP регулирует стабильность фосфатазы CD45, что, в свою очередь, способно влиять на процессы активации лимфоцитов.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Н. А. Круглова

ФГБУН Институт биологии гена РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, 119334, Москва

Д. В. Мазуров

ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Россия, 115522, Москва

А. В. Филатов

ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: avfilat@yandex.ru

биологический факультет, кафедра иммунологии

Россия, 115522, Москва; 119234, Москва

Список литературы

  1. Schraven, B., Schoenhaut, D., Bruyns, E., Koretzky, G., Eckerskorn, C., et al. (1994) LPAP, a novel 32-kDa phosphoprotein that interacts with CD45 in human lymphocytes, J. Biol. Chem., 269, 29102-29111.
  2. Rheinländer, A., Schraven, B., and Bommhardt, U. (2018) CD45 in human physiology and clinical medicine, Immunol. Lett., 196, 22-32, https://doi.org/10.1016/j.imlet.2018.01.009.
  3. Kleiman, E., Salyakina, D., De Heusch, M., Hoek, K. L., Llanes, J. M., et al. (2015) Distinct transcriptomic features are associated with transitional and mature B-cell populations in the mouse spleen, Front. Immunol., 6, 30, https:// doi.org/10.3389/fimmu.2015.00030.
  4. Kruglova, N. A., Meshkova, T. D., Kopylov, A. T., Mazurov, D. V., and Filatov, A. V. (2017) Constitutive and activation-dependent phosphorylation of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein (LPAP), PLoS One, 12, e0182468, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182468.
  5. Kruglova, N., Filatov, A. (2019) T cell receptor signaling results in ERK-dependent Ser163 phosphorylation of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein, Biochem. Biophys. Res. Commun., 519, 559-565, https://doi.org/ 10.1016/j.bbrc.2019.09.041.
  6. Takeda, A., Matsuda, A., Paul, R. M. J., and Yaseen, N. R. (2004) CD45-associated protein inhibits CD45 dimerization and up-regulates its protein tyrosine phosphatase activity, Blood, 103, 3440-3447, https://doi.org/10.1182/blood-2003-06-2083.
  7. Schraven, B., Kirchgessner, H., Gaber, B., Samstag, Y., and Meuer, S. (1991) A functional complex is formed in human T lymphocytes between the protein tyrosine phosphatase CD45, the protein tyrosine kinase p56lck and pp32, a possible common substrate, Eur. J. Immunol., 21, 2469-2477, https://doi.org/10.1002/eji.1830211025.
  8. Filatov, A., Kruglova, N., Meshkova, T., and Mazurov, D. (2015) Lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein proteoforms analyzed using monoclonal antibodies, Clin. Transl. Immunol., 4, e44, https://doi.org/10.1038/cti.2015.22.
  9. Ding, I., Bruyns, E., Li, P., Magada, D., Paskind, M., et al. (1999) Biochemical and functional analysis of mice deficient in expression of the CD45-associated phosphoprotein LPAP, Eur. J. Immunol., 29, 3956-3961, https://doi.org/ 10.1002/(SICI)1521-4141(199912)29:12<3956::AID-IMMU3956>3.0. CO;2-G.
  10. Matsuda, A., Motoya, S., Kimura, S., McInnis, R., Maizel, A. L., et al. (1998) Disruption of lymphocyte function and signaling in CD45-associated protein-null mice, J. Exp. Med., 187, 1863-1870, https://doi.org/10.1084/jem.187.11.1863.
  11. Kung, C., Okumura, M., Seavitt, J. R., Noll, M. E., White, L. S., et al. (1999) CD45-associated protein is not essential for the regulation of antigen receptor-mediated signal transduction, Eur. J. Immunol., 29, 3951-3955, https:// doi.org/10.1002/(SICI)1521-4141(199912)29:12<3951::AID-IMMU3951>3.0. CO;2-9.
  12. Bruyns, E., Kirchgessner, H., Meuer, S., Schraven, B. (1998) Biochemical analysis of the CD45-p56(Lck) complex in Jurkat T cells lacking expression of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein, Int. Immunol., 10, 185-194, https://doi.org/10.1093/intimm/10.2.185.
  13. Kitamura, K., Matsuda, A., Motoya, S., Takeda, A. (1997) CD45-associated protein is a lymphocyte-specific membrane protein expressed in two distinct forms, Eur. J. Immunol., 27, 383-388, https://doi.org/10.1002/eji.1830270207.
  14. Hsu, P. D., Scott, D. A., Weinstein, J. A., Ran, F. A., Konermann, S., Agarwala, V., et al. (2013) DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases, Nat. Biotechnol., 31, 827-832, https://doi.org/10.1038/nbt.2647.
  15. Mali, P., Yang, L., Esvelt, K. M., Aach, J., Guell, M., et al. (2013) RNA-guided human genome engineering via Cas9, Science, 339, 823-826, https://doi.org/10.1126/science.1232033.
  16. Ran, F. A., Hsu, P. D., Lin, C.-Y., Gootenberg, J. S., Konermann, S., et al. (2013) Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity, Cell, 154, 1380-1389, https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.08.021.
  17. Zotova, A., Pichugin, A., Atemasova, A., Knyazhanskaya, E., Lopatukhina, E., et al. (2019) Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags, Sci. Rep., 9, 3132, https:// doi.org/10.1038/s41598-019-40219-z.
  18. Мазуров Д. В. (2020) В кн. Методы редактирования генов и геномов (под pед. Закияна С. М., Медведева С. П., Дементьевой Е. В., Власова В. В.) Издательство СО РАН, Новосибирск, с. 413-444.
  19. Zotova, A., Lopatukhina, E., Filatov, A., Khaitov, M., and Mazurov, D. (2017) Gene editing in human lymphoid cells: role for donor DNA, type of genomic nuclease and cell selection method, Viruses, 9, 325, https://doi.org/10.3390/v9110325.
  20. Koretzky, G. A., Picus, J., Schultz, T., and Weiss, A. (1991) Tyrosine phosphatase CD45 is required for T-cell antigen receptor and CD2-mediated activation of a protein tyrosine kinase and interleukin 2 production, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2037-2041, https://doi.org/10.1073/pnas.88.6.2037.
  21. Leitenberg, D., Falahati, R., Lu, D. D., and Takeda, A. (2007) CD45-associated protein promotes the response of primary CD4 T cells to low-potency T-cell receptor (TCR) stimulation and facilitates CD45 association with CD3/TCR and lck, Immunology, 121, 545-554, https://doi.org/10.1111/j.1365-2567.2007.02602.x.
  22. Gaud, G., Lesourne, R., and Love, P. E. (2018) Regulatory mechanisms in T cell receptor signalling, Nat. Rev. Immunol., 18, 485-497, https://doi.org/10.1038/s41577-018-0020-8.
  23. Burr, M. L., Sparbier, C. E., Chan, Y.-C., Williamson, J. C., Woods, K., et al. (2017) CMTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity, Nature, 549, 101-105, https://doi.org/10.1038/nature23643.
  24. Oates, M. E., Romero, P., Ishida, T., Ghalwash, M., Mizianty, M. J., et al. (2012) D2P2: database of disordered protein predictions, Nucleic Acids Res., 41, D508-D516, https://doi.org/10.1093/nar/gks1226.
  25. Uversky, V. N. (2019) Intrinsically disordered proteins and their “mysterious” (meta)physics, Front. Phys., 7, https://doi.org/10.3389/fphy.2019.00010.
  26. Wright, P. E., Dyson, H. J. (2015) Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 16, 18-29, https://doi.org/10.1038/nrm3920.
  27. Marchetti, P., Antonov, A., Anemona, L., Vangapandou, C., Montanaro, M., et al. (2021) New immunological potential markers for triple negative breast cancer: IL18R1, CD53, TRIM, Jaw1, LTB, PTPRCAP, Discov. Oncol., 12, 6, https://doi.org/10.1007/s12672-021-00401-0.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Уровень белков LPAP и CD45 падает в отсутствии белка-партнёра. а – Репрезентативные цитограммы экспрессии LPAP на клетках Jurkat дикого типа (WT), а также на клетках CD45KO или LPAPKO; б – экспрессия LPAP по результатам тестирования 7 клонов CD45KO; в, г – экспрессия CD45 и «посторонних» белков CD59 и CD98 в культурах Jurkat LPAPmKО (в) или в LPAPpKO (г). Уровни экспрессии белков LPAP, CD45, CD59 и CD98 определяли с помощью проточной цитометрии. Нормализованный уровень экспрессии CD45 сравнивали с контрольным значением 100 с помощью одновыборочного t-критерия Стьюдента (б). Для сравнения уровня белков в клетках дикого типа и нокаутных использовали метод ANOVA с post hoc анализом с помощью теста Тьюки (в, г), **** p < 0,0001

Скачать (134KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Уровень CD45 коррелирует с уровнем белка LPAP. а, б – Корреляция между уровнями LPAP и CD45 (а) или LPAP и CD98 (б) в клонах Jurkat LPAPKO с реэкспрессией LPAPWT; в – корреляция между уровнями LPAP и CD45 в клонах Jurkat LPAPWT; г, д – уровень LPAP (г) и CD45 (д) на клетках Jurkat LPAPpKO, стабильно трансдуцированных возрастающей дозой вируса для реэкспрессии LPAPWT (#1, #2, #3) или экспрессии GFP. Экспрессия LPAP нормирована относительно клеток Jurkat LPAPWT. Для CD45 показаны значения для поверхностного (sCD45) и общего (tCD45) уровня; е – корреляция между уровнями LPAP и CD45 в клонах Jurkat LPAPKO, стабильно трансфицированных LPAPWT. Уровни экспрессии определяли по значениям MFI, которые были нормализованы относительно среднего значения для Jurkat WT после вычитания фонового уровня в клетках Jurkat CD45KO или Jurkat LPAPKO. Приведены индивидуальные значения, а также среднее ± SD. Нормализованный уровень экспрессии LPAP в трансдуцированных клетках сравнивали со значением ноль в клетках, экспрессирующих GFP, с помощью одновыборочного t-критерия Стьюдента (г). Для сравнения уровня поверхностного (s) и общего (t) CD45 в клетках Jurkat LPAPpKO и трансдуцентах использовали метод ANOVA с post hoc анализом с помощью теста Тьюки. *** p < 0,001, **** p < 0,0001. Средние значения для уровня LPAP и sCD45 из панели д использованы для расчёта корреляции (е)

Скачать (184KB)
Метаданные
4. Рис. 3. В клетках с повышенной экспрессией LPAP уровень CD45 возрастает. а, б – Уровень белка LPAP анализировали в клеточных линиях Jurkat и Jurkat LPAP-Flag после первой и второй сортировки (sort 1 и sort 2). Клетки лизировали (а, б), белок LPAP или CD45 выделяли с помощью иммунопреципитации (IP) (б), образцы разделяли методом электрофореза в 12%-ном (а) или 18%-ном (б) геле, проводили Вестерн-блоттинг с указанными антителами. Нижний блот (б) окрашивали антителами против Flag и LPAP. Формы LPAP и LPAP-Flag указаны стрелками; в, г – экспрессия LPAP и CD45 на поверхности клеток K562 дикого типа, а также стабильно трансдуцированных LPAP-Flag

Скачать (158KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Сравнение экспрессии молекул CD69 и CD3 на клетках Jurkat дикого типа и с нокаутом по LPAP. а – Экспрессия CD69 на клетках, активированных с помощью РМА; б – экспрессия CD69 на клетках, активированных с помощью антитела OKT3; в – экспрессия CD3 на клетках, активированных с помощью антитела OKT3. Уровни CD69 (б) и CD3 (в) сравнивали с помощью двухвыборочного t-критерия. * p < 0,05, ** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Скачать (220KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».