Экспрессия синтетического гена CYP102A1-LG23 и функциональный анализ рекомбинантного цитохрома P450 BM3-LG23 в актинобактериях Mycolicibacterium smegmatis

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Цитохром CYP102A1 (P450 BM3) из Priestia megaterium (bas. Bacillus megaterium) имеет ряд уникальных функциональных особенностей, которые делают его идеальным объектом для направленной эволюции и других синтетических приложений. Ранее был получен мутант CYP102A1-LG23 с 14 мутациями в гем-связывающей части белка, осуществляющий 7β-гидроксилирование стероидных субстратов ряда андростанов с образованием продуктов, обладающих противовоспалительной и нейропротекторной активностью. В настоящем исследовании синтетический ген cyp102A1-LG23, кодирующий мутантный вариант P450 BM3, экспрессирован в клетках Mycolicibacterium smegmatis в составе моно- и бицистронных оперонов совместно с синтетическими генами gdh или zwf2, кодирующими глюкозодегидрогеназу (ГДГ) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г6ФД) соответственно. Показана функциональная активность рекомбинантных ферментов in vivo на примере гидроксилирования андрост-4-ен-3,17-диона (АД) до 7β-гидрокси-АД (7β-OH-AД) в растущих культурах миколицибактерий. Биокаталитическая активность увеличена вдвое за счет повышения растворимости белка CYP102A1-LG23 в клетке и организации дополнительной системы регенерации кофакторов путем введения ГДГ и Г6ФД. Максимальный выход 7β-OH-AД, составляющий 37,68% мольн., был достигнут коэкспрессией в M. smegmatis генов cyp102A1-LG23 и gdh. Результаты свидетельствуют о перспективности использования синтетических генов для получения рекомбинантных ферментов, расширяют представления о гидроксилировании стероидных соединений бактериальными цитохромами и могут быть востребованы для разработки методов микробиологического получения 7β-гидроксистероидов с помощью генетически модифицированных миколицибактерий.

Об авторах

В. Ю Пошехонцева

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Email: rikahameleon@mail.ru
142290 Пущино, Московская обл., Россия

Н. И Стрижов

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

142290 Пущино, Московская обл., Россия

М. В Карпов

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

142290 Пущино, Московская обл., Россия

В. М Николаева

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

142290 Пущино, Московская обл., Россия

А. В Казанцев

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет

119991 Москва, Россия

О. И Сазонова

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

142290 Пущино, Московская обл., Россия

А. А Шутов

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

142290 Пущино, Московская обл., Россия

М. В Донова

Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр биологических исследований РАН», Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

142290 Пущино, Московская обл., Россия

Список литературы

  1. Donova, M. V. (2017) Steroid Bioconversions, Methods Mol. Biol., 1645, 1-13, doi: 10.1007/978-1-4939-7183-1_1.
  2. Wojtal, K., Trojnar, M. K., and Czuczwar, S. J. (2006) Endogenous neuroprotective factors: neurosteroids, Pharmacol. Rep., 58, 335-340.
  3. Fegan, K. S., Rae, M. T., Critchley, H. O. D., and Hillier, S. G. (2008) Anti-inflammatory steroid signalling in the human peritoneum, J. Endocrinol., 196, 369-376, doi: 10.1677/joe-07-0419.
  4. Ali Shah, S. A., Sultan, S., and Adnan, H. S. (2013) A whole-cell biocatalysis application of steroidal drugs, Orient. J. Chem., 29, 389-403, doi: 10.13005/ojc/290201.
  5. Szaleniec, M., Wojtkiewicz, A. M., Borowski, T., Bernhardt, R., and Donova, M. (2018) Bacterial steroid hydroxylases: enzyme classes, their functions and comparison of their catalytic mechanisms, Appl. Microbiol. Biotechnol., 102, 8153-8171, doi: 10.1007/s00253-018-9239-3.
  6. Julsing, M. K., Cornelissen, S., Bühler, B., and Schmid, A. (2008) Heme-iron oxygenases: powerful industrial biocatalysts? Curr. Opin. Chem. Biol., 12, 177-186, doi: 10.1016/j.cbpa.2008.01.029.
  7. Bureik, M., and Bernhardt, R. (2007) in Modern Biooxidation. Enzymes, Reactions and Applications (Schmid, R. D., and Urlacher, V. B., eds) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp. 155-176.
  8. Fernández-Cabezón, L., Galán, B., and García, J. L. (2018) New insights on steroid biotechnology, Front. Microbiol., 9, 958, doi: 10.3389/fmicb.2018.00958.
  9. Munro, A. W., Leys, D. G., McLean, K. J., Marshall, K. R., Ost, T. W. B., Daff, S., Miles, C. S., Chapman, S. K., Lysek, D. A., Moser, C. C., Page, C. C., and Dutton, P. L. (2002) P450 BM3: the very model of a modern flavocytochrome, Trends Biochem. Sci., 27, 250-257, doi: 10.1016/s0968-0004(02)02086-8.
  10. Guengerich, F. P. (1991) Reactions and significance of cytochrome P-450 enzymes, J. Biol. Chem., 266, 10019-10022, doi: 10.1016/S0021-9258(18)99177-5.
  11. Munro, A. W., Daff, S., Coggins, J. R., Lindsay, J. G., and Chapman, S. K. (1996) Probing electron transfer in flavocytochrome P-450 BM3 and its component domains, Eur. J. Biochem., 239, 403-409, doi: 10.1111/j.1432-1033.1996.0403u.x.
  12. Finnigan, J. D., Young, C., Cook, D. J., Charnock, S. J., and Black, G. W. (2020) Cytochromes P450 (P450s): A review of the class system with a focus on prokaryotic P450s, Adv. Protein Chem. Struct. Biol., 122, 289-320, doi: 10.1016/bs.apcsb.2020.06.005.
  13. Li, A., Acevedo-Rocha, C. G., D'Amore, L., Chen, J., Peng, Y., Garcia-Borràs, M., Gao, C., Zhu, J., Rickerby, H., Osuna, S., Zhou, J., and Reetz, M. T. (2020) Regio- and stereoselective steroid hydroxylation at C7 by cytochrome P450 monooxygenase mutants, Angew. Chem. Int. Ed., 59, 12499-12505, doi: 10.1002/ange.202003139.
  14. Tang, R., Ren, X., Xia, M., Shen, Y., Tu, L., Luo, J., Zhang, Q., Wang, Y., Ji, P., and Wang, M. (2021) Efficient one-step biocatalytic multienzyme cascade strategy for direct conversion of phytosterol to C-17-hydroxylated steroids, Appl. Environ. Microbiol., 87, e0032121, doi: 10.1128/AEM.00321-21.
  15. Karpov, M. V., Nikolaeva, V. M., Fokina, V. V., Shutov, A. A., Kazantsev, A. V., Strizhov, N. I., and Donova, M. V. (2022) Creation and functional analysis of Mycolicibacterium smegmatis recombinant strains carrying the bacillary cytochromes CYP106A1 and CYP106A2 genes, Appl. Biochem. Microbiol., 58, 947-957, doi: 10.1134/S0003683822090058.
  16. Snapper, S. B., Melton, R. E., Mustafa, S., Kieser, T., and Jacobs, W. R. Jr. (1990) Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis, Mol. Microbiol., 4, 1911-1919, doi: 10.1111/j.1365-2958.1990.tb02040.x.
  17. Poulsen, C., Holton, S., Geerlof, A., Wilmanns, M., and Song, Y.-H. (2010) Stoichiometric protein complex formation and over expression using the prokaryotic native operon structure, FEBS Lett., 584, 669-674, doi: 10.1016/j.febslet.2009.12.057.
  18. Strizhov, N., Karpov, M., Sukhodolskaya, G., Nikolayeva, V., Fokina, V., Shutov, A. A., and Donova, M. V. (2016) Development of mycobacterial strains producing testosterone, Proc. Nat. Acad. Sci. Belarus, Chem. Series, 3, 57-58.
  19. Bertani, G. (1951) Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli, J. Bacteriol., 62, 293-300, doi: 10.1128/jb.62.3.293-300.1951.
  20. Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.
  21. Daugelat, S., Kowall, J., Mattow, J., Bumann, D., Winter, R., Hurwitz, R., and Kaufmann, S. H. E. (2003) The RD1 proteins of Mycobacterium tuberculosis: expression in Mycobacterium smegmatis and biochemical characterization, Microbes Infect., 5, 1082-1095, doi: 10.1016/s1286-4579(03)00205-3.
  22. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, doi: 10.1038/227680a0.
  23. Zhao, Y.-Q., Liu, Y.-J., Ji, W.-T., Liu, K., Gao, B., Tao, X.-Y., Zhao, M., Wang, F.-Q., and Wei, D.-Z. (2022) One-pot biosynthesis of 7β-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione from phytosterols by cofactor regeneration system in engineered Mycolicibacterium neoaurum, Microb. Cell Fact., 21, 59, doi: 10.1186/s12934-022-01786-5.
  24. Booth, W. T., Schlachter, C. R., Pote, S., Ussin, N., Mank, N. J., Klapper, V., Offermann, L. R., Tang, C., Hurlburt, B. K., and Chruszcz, M. (2018) Impact of an N-terminal polyhistidine tag on protein thermal stability, ACS Omega, 3, 760-768, doi: 10.1021/acsomega.7b01598.
  25. Lee, W.-H., Park, J.-B., Park, K., Kim, M.-D., and Seo, J.-H. (2007) Enhanced production of ɛ-caprolactone by overexpression of NADPH-regenerating glucose 6-phosphate dehydrogenase in recombinant Escherichia coli harboring cyclohexanone onooxygenase gene, Appl. Microbiol. Biotechnol., 76, 329-338, doi: 10.1007/s00253-007-1016-7.
  26. Wu, Y., Li, H., Zhang, X. M., Gong, J. S., Li, H., Rao, Z. M., Shi, J. S., and Xu, Z. H. (2015) Improvement of NADPH-dependent P450-mediated biotransformation of 7α, 15α-diOH-DHEA from DHEA by a dual cosubstrate-coupled system, Steroids, 101, 15-20, doi: 10.1016/j.steroids.2015.05.005.
  27. Dodson, R. M., Kraychy, S., Nicholson, R. T., and Mizuba, S. (1962) Microbiological transformations. IX. The 1β-hydroxylation of androstenedione, J. Org. Chem., 27, 3159-3164, doi: 10.1021/jo01056a043.

© Российская академия наук, 2023

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах