Mechanisms of antioxidant protection of low-density lipoprotein particles against free radical oxidation

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Циркулирующие в кровяном русле наночастицы липид-транспортирующей системы – липопротеиды низкой плотности (ЛНП), в отличие от различных клеток и субклеточных структур (включая клетки крови), не содержат антиоксидантных ферментов (супероксид- и гидропероксид-оксидоредуктаз), защищающих липид-белковые надмолекулярные комплексы от повреждающего действия свободнорадикального окисления (СРО) [1]. Тем не менее ЛНП нуждаются в эффективной защите от СРО вследствие наличия большого количества субстрата окисления – ацилов полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в фосфолипидах частиц [2]. Наружный фосфолипидный монослой ЛНП, так же как бислойные фосфолипидные мембраны, легко окисляется в аэробных условиях in vitro [3] и in vivo [4] как спонтанно, так и при катализе инициаторами разнообразной природы [5]. Наличие в плазме крови высокого парциального давления кислорода (pО₂), а также индукторов СРО (таких как ионы металлов переменной валентности, гемопротеиды, Cu-содержащие белки, липогидропероксиды (LOOH)), различных генераторов Н₂О₂, супероксидного анион-радикала (О₂^•−) и других активных форм кислорода (АФК) [5] создаёт повышенную опасность повреждения частиц ЛНП вследствие их СРО в процессе циркуляции в кровяном русле. Полное отсутствие в этих структурных образованиях каких-либо антиоксидантных ферментов многократно повышает их подверженность СРО. Очевидно, что, исходя из прагматизма эволюции, наличие антиоксидантных белков в составе частиц ЛНП, конкретной функцией которых является транспорт липидов, синтезируемых в печени, в периферические ткани, является нецелесообразным. При этом все без исключения клетки должны были бы иметь ферментные системы утилизации этих белков после завершения липидного транспорта, что было бы сопряжено с дополнительным бесполезным расходом энергии. Природой был найден остроумный выход из создавшейся ситуации, заключающийся в создании эффективной системы неферментативного контроля СРО в ЛНП, представленной, прежде всего, жирорастворимыми фенольными антиоксидантами – восстановленной формой коэнзима Q₁₀ (убихинол Q₁₀, CoQ₁₀H₂) [6] и витамином Е (α-токоферолом, α-ТОН) [7]. Важно, что в отличие от истинного витамина α-ТОН (в организме не синтезируется) значительная часть CoQ₁₀H₂ (около 60%) поступает в ткани не из пищевых источников, а образуется в результате биосинтеза de novo [8]. Жирорастворимые витамины (включая α-ТОН) транспортируются частицами ЛНП и локализованы в гидрофобном ядре наночастиц [9]. В литературе высказано мнение, что CoQ₁₀H₂ является основным (наиболее эффективным) антиоксидантом, защищающим частицы ЛНП от окисления [10–12]. Тем не менее на 1 частицу ЛНП по расчётам приходится не более 1 молекулы CoQ₁₀H₂ [13], что делает невозможным осуществление этим антиоксидантом эффективной защитной функции без существования механизма его биорегенерации (восстановления) в ЛНП.

Считается, что α-ТОН и CoQ₁₀Н₂ могут взаимодействовать с пероксильными радикалами (LOO^•) липидов в следующих реакциях [14–16]:

$\mathrm{\alpha }-\mathrm{ТОН} + {\mathrm{LOO}}^{•} \underset{}{\to } \mathrm{\alpha }-{\mathrm{ТО}}^{•}+ \mathrm{LOOH}$, (1)

${\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}_2 + {\mathrm{LOO}}^{•} \stackrel{}{\to } {\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}^{•} + \mathrm{LOOH}$, (2)

${\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}^{•} + {\mathrm{LOO}}^{•} \stackrel{}{\to } {\mathrm{СoQ}}_{10} + \mathrm{LOOH}$. (3)

Токофероксильный радикал (α-ТО^•), продуцируемый в процессе реакции (1), может вновь реагировать с LOO^• или другой молекулой α-ТО^• с образованием нерадикальных продуктов [14]. В то же время СoQ₁₀H₂ последовательно окисляется LOO^• до убисемихинона (СoQ₁₀H^•) и далее – до полностью окисленной формы СoQ₁₀ (реакции (2) и (3)) [15]. Вместе с тем СoQ₁₀H₂ восстанавливает не только свободные радикалы липидов, но и α-ТО^• в реакции (4) [16]:

${\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}_2 + \mathrm{\alpha }-{\mathrm{ТО}}^{•} \stackrel{}{\to } {\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}^{•} + \mathrm{\alpha }-\mathrm{ТОH}$. (4)

Эта реакция может лежать в основе синергизма антиоксидантного действия СoQ₁₀H₂ и α-ТОН, участвуя тем самым в биорегенерации α-ТОH, причём не исключено, что именно этот механизм может играть важную роль в предотвращении СРО частиц ЛНП. Так, при отсутствии СoQ₁₀H₂ накопление токофероксильных радикалов (α-ТО^•) может вызывать прооксидантное действие в ЛНП [17, 18], поскольку α-ТО^• в этих условиях может выступать в качестве инициатора цепных реакций:

$\mathrm{\alpha }-{\mathrm{ТО}}^{•} + \mathrm{LH} \to \mathrm{\alpha }-\mathrm{ТОH} + {\mathrm{L}}^{•}$, (5)

${\mathrm{L}}^{•} + {\mathrm{O}}_2 \to {\mathrm{LOO}}^{•}$, (6)

где LH − ацилы ПНЖК; L^• − алкильные радикалы липидов.

Тем не менее эффекты, наблюдаемые при взаимодействии СoQ₁₀H₂ и α-ТОН в модельных системах, не могут полностью объяснить биорегенерацию этих липофильных антиоксидантов в условиях in vivo, поскольку предполагаемая локализация СoQ₁₀H₂ и α-ТОН в частицах ЛНП [19] и описанные выше реакции взаимодействия этих жирорастворимых антиоксидантов в условиях in vivo не очевидны. В настоящей работе мы предприняли попытку экспериментально обосновать возможные механизмы биорегенерации СoQ₁₀H₂ и α-ТОН, обеспечивающие защиту этими антиоксидантами частиц ЛНП от СРО в процессе их циркуляции в кровяном русле.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы. Для клинических исследований в работе использовали препарат убихинон Q₁₀ («Bioquinone»; «Phrama Nord», Дания) в капсулах с соевым маслом. SkQ1 (10-(6′-пластохинонил)децилтрифенилфосфония) был любезно предоставлен академиком В.П. Скулачевым (НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова). Остальные реактивы были получены от фирмы «Sigma-Aldrich» (США).

Клиническое исследование влияния длительного введения per os препарата убихинона Q₁₀ (СoQ₁₀) больным ИБС на содержание липогидропероксидов в ЛНП плазмы крови. В клиническое исследование было включено 10 мужчин (49 ± 2,5 года) с хронической ишемической болезнью сердца (ИБС) и гиперлипидемией, которые проходили лечение в НМИЦ кардиологии Минздрава России. Пациенты не получали липотропных препаратов и в течение 6 мес. принимали per os препарат убихинон Q₁₀ в суточной дозе 60 мг. Для контроля уровня LOOH в ЛНП у больных венозную кровь брали натощак в присутствии 1 мг/мл ЭДТА в качестве антикоагулянта и антиоксиданта, после чего изолировали ЛНП с помощью препаративного ультрацентрифугирования, как описано ниже. Данные по изменениям содержания LOOH в ЛНП больных ИБС при введении убихинона Q₁₀ представляли в % от исходного уровня (100%) LOOH в ЛНП.

Выделение ЛНП при помощи препаративного ультрацентрифугирования. Получение ЛНП из плазмы крови практически здоровых доноров проводили при помощи центрифугирования в градиенте плотности NaBr на ультрацентрифуге Beckman Optima XPN-80 («Beckman», США) [20]. Липопротеиды изолировали из трёх образцов плазмы крови, полученных от трёх разных здоровых доноров. В центрифужную пробирку вносили донорскую плазму, содержащую 1 мМ ЭДТА, осторожно наслаивали раствор NaBr с плотностью 1,006 г/мл и центрифугировали (105 000 g в течение 18 ч при 4 оС) в роторе Ti-60. После удаления верхнего слоя, содержащего липопротеиды очень низкой плотности, к содержимому пробирки добавляли при перемешивании расчётное количество NaBr и растворяли соль для создания плотности 1,065 г/мл, после чего пробирку дополняли раствором NaBr этой же плотности. После центрифугирования (105 000 g в течение 18 ч при 4 оС) отбирали верхний слой, содержащий флотировавшие ЛНП. Полученную фракцию ЛНП подвергали диализу в течение 18 ч при температуре 4 оС против 2000 объёмов 145 мМ NaCl в 50 мМ K,Na-фосфатном буфере (рН 7,4).

Определение содержания липогидропероксидов в ЛНП с использованием реактива Fe²⁺-ксиленолоранж. Содержание гидропероксидов липидов (LOOH) в ЛНП определяли, используя окисление ионов Fe2+ при реакции с LOOH:

$\mathrm{LOOH} + {\mathrm{Fe}}^{2+} \stackrel{}{\to } {\mathrm{LO}}^{•} + {\mathrm{OH}}^{-} + {\mathrm{Fe}}^{3+}$, (7)

где LO^• – алкоксильный радикал липидов.

Ионы Fe³⁺ (эквимолярные концентрации LOOH) образуют с ксиленоловым оранжевым (о-крезолсульфофталеин-3,3′-бисметилиминодиуксусной кислоты тетранатриевая соль) окрашенный комплекс, концентрацию которого измеряли на спектрофотометре UV-2600 Shimadzu («Shimadzu», Япония) (ε₅₆₀ = 1,5 × 104 М⁻¹·см⁻¹) [21]. Для проведения анализов предварительно готовили реагент FOX, содержащий 1 мМ ксиленолового оранжевого и 2,5 мМ соли Мора Fe(NH₄)₂(SO₄)₂ в 25 мМ H₂SO₄ с добавлением 9 объёмов 4,4 мМ бутилгидрокситолуола (BHT) в 90%-ном метаноле (степень чистоты для ВЭЖХ). В контрольных пробах LOOH количественно восстанавливали трифенилфосфином до гидроокисей, и поглощение этих образцов вычитали из показаний опытных проб [21]. В качестве стандарта использовали гидропероксид трет-бутила.

Исследование кинетики свободнорадикального Cu²⁺-инициированного окисления ЛНП. После диализа содержание белка в образцах ЛНП определяли по методу Лоури, а затем пробы разбавляли до 50 мкг белка/мл раствором, содержащим 154 мМ NaCl в 50 мМ K,Na-фосфатном буфере (рН 7,4), и окисление частиц ЛНП при 37 оС индуцировали введением в среду инкубации 30 мкМ CuSO₄, после чего через фиксированные интервалы времени измеряли накопление конъюгированных диенов на спектрофотометре UV-2600 Shimadzu [22–24]. В ходе образования гидропероксидов ПНЖК (LOOH) происходит формирование конъюгированных двойных связей, поглощающих при 233 нм. Содержание LOOH (∆D₂₃₃) в частицах ЛНП может быть рассчитано, исходя из коэффициента молярной экстинкции 22 000 М⁻¹·см⁻¹. Продолжительность периода индукции (τ) на кинетических кривых СРО липидов в ЛНП определяли, как описано ранее [25]. Исследование кинетики Cu²⁺-зависимого СРО частиц ЛНП in vitro проводили, используя ЛНП, изолированные из плазмы крови трёх доноров (ЛНП, выделенные из плазмы крови каждого донора использовали в независимых экспериментах). С использованием кинетической модели Cu2+-инициированного СРО частиц ЛНП исследовали ингибирующее действие природных фенольных липофильных антиоксидантов (α-токоферол, убихинол Q₁₀) и синтетического пластохинона (skQ1), структурные формулы которых приведены на рис. 1.

 

Рис. 1. Структурные формулы исследуемых липофильных фенольных антиоксидантов: убихинола Q₁₀ (CoQ₁₀H₂), α-токоферола, 10-(6′-пластохинонил)децилтрифенилфосфония (skQ1). Исследуемые антиоксиданты вводили в инкубационную смесь, содержащую ЛНП, в этанольных растворах (конечная концентрация спирта не более 2%), после чего встряхивали 1 мин в шейкере и инкубировали 4 мин при 37 °С

 

Получение убихинола Q₁₀ и свободных радикалов α-токоферола и пробукола. СoQ₁₀H₂ получали, восстанавливая СoQ₁₀ боргидридом натрия (NaBH₄), для чего смешивали эквимолярные растворы этих соединений в этаноле [15]. Раствор NaBH₄ готовили непосредственно перед его использованием. Токофероксильный радикал (α-ТО^•) получали окислением 400 мМ раствора α-ТОН в изопропаноле порошком диоксида марганца (MnO₂). Для этого 1 мл раствора α-токоферола смешивали с 100 мг диоксида марганца и 20 мин встряхивали на шейкере, после чего смесь центрифугировали и фильтровали надосадочную жидкость для полного удаления частиц MnO₂. Феноксильный радикал пробукола (4,4′-[(1-метилэтилиден)бис(тио)]бис[2,6-бис(1,1-диметилэтил)фенола]) получали аналогично, окисляя 0,2 М раствор пробукола диоксидом марганца.

Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Спектры ЭПР измеряли на автоматизированном спектрометре ESR 70-03 XD/2 УП «КБСТ» БГУ (Беларусь). Растворы свободных радикалов α-токоферола и пробукола в изопропаноле смешивали с этанолом и 160 мМ Na-фосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 8/1/1. Эту реакционную смесь (40 мкл) вводили в газопроницаемую капиллярную трубку PTFE Sub-Lite-Wall (внутренний диаметр – 0,635 мм; толщина стенки – 0,051 мм; «Zeus Industrial Products, Inc.», США). Капилляр дважды складывали и вставляли в кварцевую трубку диаметром ~4 мм, которая помещалась в резонатор спектрометра ЭПР. Регистрацию спектров α-ТО• проводили при 25 °C и следующих условиях: ослабление СВЧ-мощности – 1 дБ; амплитуда ВЧ-модуляции – 0,05 мТл; СВ-частота – ~9,32 ГГц; коэффициент усиления – 1000; диапазон развёртки – 5 мТл. Запись спектров начинали через 2 мин после смешивания компонентов реакционной смеси.

Статистический анализ. В клиническом исследовании для статистического анализа использовали программы SPSS 14 Windows Version 7.0. С помощью критерия Колмогорова–Смирнова проводили оценку нормальности распределения переменных. Для оценки значимости различий экспериментальных данных по отношению к контролю использовали t-критерий Стьюдента. Результаты, полученные в экспериментах in vitro, анализировали с помощью программы Origin Pro 8 («Origin Lab Corp.», США). Для сравнения средних значений использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением t-критерия Стьюдента, а также критерия Даннета для оценки достоверности различий между группами. Данные всех проведённых исследований представлены как средние значения (М) ± стандартное отклонение (σ). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние убихинона Q₁₀ на содержание липогидропероксидов в ЛНП плазмы крови больных ИБС. В течение первого месяца терапии CoQ₁₀ содержание LOOH в ЛНП больных ИБС резко падает (на 61% от исходного уровня), а ко второму месяцу наблюдения – снижается до 19% и остаётся на близком к этому уровне в течение последующих 4 мес. терапии (рис. 2).

 

Рис. 2. Влияние перорального введения препарата убихинона Q₁₀ больным ИБС на содержание LOOH в ЛНП плазмы крови. Различия с исходным уровнем LOOH в ЛНП были статистически значимы; * р < 0,05

 

Следует отметить, что наблюдаемое выраженное антиоксидантное действие (по уменьшению содержания LOOH в ЛНП), отмеченное уже через 1 мес. после введения больным СoQ₁₀, может свидетельствовать о существовании его эффективной биорегенерации (восстановления) с образованием СoQ₁₀H₂ в условиях in vivo, исследование механизма которой явилось предметом дальнейшего исследования.

Влияние экзогенных убихинола Q₁₀ и α-токоферола на свободнорадикальное окисление частиц ЛНП in vitro. В экспериментах in vitro исследовали влияние экзогенных гидрофобных антиоксидантов СoQ₁₀H₂, α-ТОН и синтетического антиоксиданта skQ1 (аналог пластохинона) на кинетику СРО частиц ЛНП в диапазоне концентраций 5–80 мкМ. Кинетические кривые накопления LOOH, образующихся в ЛНП при Cu²⁺-инициированном СРО в присутствии исследованных фенольных антиоксидантов в концентрации 80 мкМ, представлены на рис. 3. Как видно из этих данных, исследованные антиоксиданты влияют на начальную скорость накопления LOOH и продолжительность периода индукции (τ) на кинетических кривых СРО частиц ЛНП (рис. 3).

 

Рис. 3. Влияние различных липофильных антиоксидантов на кинетику накопления LOOH (диеновых конъюгатов) в процессе Cu²⁺-инициированного СРО частиц ЛНП. 1 – Окисление нативных ЛНП без добавления антиоксидантов (контроль); 2 – ЛНП + 80 мкМ убихинола Q₁₀; 3 – ЛНП + 80 мкМ α-токоферола; 4 – ЛНП + 80 мкМ убихинола Q₁₀ + 80 мкМ α-токоферола; 5 – ЛНП + 80 мкМ skQ1. Статистически значимыми являются различия групп 2–5 по отношению к группе 1 (контроль); * p < 0,05

 

Очевидно, что исследованные кинетические параметры могут быть корректно использованы для оценки эффективности действия антиоксидантов в модельной системе. Известно, что продолжительность периода индукции СРО (τ) прямо пропорциональна концентрации ингибитора СРО в системе – [InH] и обратно пропорциональна скорости инициирования СРО – ω, т.е. τ = [InH]/ω [26]. В использованной нами системе окисления при изучении частиц ЛНП с неизменным составом липидов ω является величиной постоянной (constanta), исходя из чего продолжительность периода индукции СРО (τ) должна быть пропорциональна содержанию антиоксиданта (или его антиоксидантной активности). Из рис. 3 (кривая 2) видно, что СoQ₁₀H₂ в концентрации 80 мкМ вызывает существенное увеличение продолжительности τ при СРО частиц ЛНП, а также уменьшение начальной скорости их окисления. При использовании такой же концентрации α-ТОН (рис. 3, кривая 3) или совместном действии СoQ₁₀H₂ и α-ТОН в концентрациях 80 мкМ (рис. 3, кривая 4) наблюдали практически полное подавление окисления ЛНП. Пластохинон skQ1 в концентрации 80 мкМ оказывал более выраженное антиоксидантное действие (рис. 3, кривая 5) по сравнению с действием СoQ₁₀H₂ (рис. 3, кривая 2).

Данные по действию различных концентраций исследованных антиоксидантов на продолжительность τ при СРО частиц ЛНП представлены на рис. 4. Из этих результатов видно (рис. 4, кривая 1), что при введении 5 мкМ СoQ₁₀H₂ в среду окисления происходит увеличение продолжительности τ более чем в 2 раза (с 8 мин в контроле до 20 мин), однако значительно большее увеличение концентрации СoQ₁₀H₂ не приводит к заметному увеличению антиоксидантного действия (τ = 14 мин при 80 мкМ СoQ₁₀H₂). Вместе с тем повышение концентрации α-ТОН при СРО частиц ЛНП от 5 до 80 мкМ вызывает весьма резкое увеличение продолжительности τ с 36 до 160 мин соответственно (рис. 4, кривая 2). Следует отметить, что добавление к частицам ЛНП СoQ₁₀H₂ в концентрациях 40 и 80 мкМ вместе с 10 мкМ α-ТОН приводит к заметному росту продолжительности τ до 65 и 80 мин соответственно. Тем не менее при сочетании 10 мкМ α-ТОН с СoQ₁₀H₂ в низких концентрациях (5 и 10 мкМ) продолжительность τ была практически такой же, что и в присутствии одного CoQ₁₀H₂ (рис. 4, кривая 3). Пластохинон skQ1, который, как и СoQ₁₀H₂, является восстановленным хиноном, влиял на продолжительность τ в меньшей степени, чем другие антиоксиданты, включая CoQ₁₀H₂ (рис. 4, кривая 4).

 

Рис. 4. Зависимость продолжительности периода индукции (τ) СРО частиц ЛНП (по накоплению диеновых конъюгатов) от концентрации добавленных фенольных липофильных антиоксидантов: убихинола Q₁₀ (1), α-токоферола (2), сочетания 10 мкМ α-токоферола с различными концентрациями (5–80 мкМ) убихинола Q₁₀ (3) и skQ1 (4). * р < 0,05 – статистически значимые различия групп 1, 3 и 4 по отношению к группе 2; # р < 0,05 – статистически значимые различия групп 1 и 4 по отношению к группе 3 при концентрациях убихинола Q₁₀ и skQ1, равных 40 и 80 мкМ

 

В концентрации 5 мкМ CoQ₁₀H₂ заметно не влиял на величину начальной скорости накопления LOOH при СРО частиц ЛНП, тогда как при увеличении концентрации СoQ₁₀H₂ до 10–80 мкМ начальная скорость окисления ЛНП снижалась в 2–2,5 раза (рис. 5).

 

Рис. 5. Влияние различных концентраций экзогенных α-токоферола, убихинола Q₁₀ и skQ1 на начальную скорость Cu²⁺-инициированного СРО липидов в частицах ЛНП; 1 – нативные ЛНП без добавления антиоксидантов (контроль); 2 – ЛНП + убихинол Q₁₀; 3 – ЛНП + α-ТОН; 4 – ЛНП + α-ТОН + убихинол Q₁₀ (антиоксиданты добавлялись в эквимолярных концентрациях); 5 – ЛНП + skQ1. * р < 0,05 – статистически значимые различия экспериментальных групп по отношению к контролю (начальная скорость накопления LOOH при отсутствии антиоксидантов)

 

При введении в инкубационную среду 5 мкМ α-ТОН, напротив, начальная скорость окисления ЛНП резко снижалась (более чем в 2 раза), а при концентрации α-ТОН, равной 10 мкМ, начальная скорость накопления LOOH падала почти в 6 раз и прогрессивно уменьшалась при увеличении содержания антиоксиданта в среде СРО (рис. 5). При высоких концентрациях (40–80 мкМ) α-ТОН намного более эффективно ингибировал начальную скорость СРО частиц ЛНП, чем CoQ₁₀H₂ и skQ1 (рис. 5). В то же время при одновременном добавлении в инкубационную среду равных концентраций CoQ₁₀H₂ и α-ТОН не наблюдалось их аддитивного действия во всём диапазоне использованных концентраций антиоксидантов (рис. 5). Начальная скорость накопления LOOH при введении этих антиоксидантов в среду окисления частиц ЛНП в концентрации 10 мкМ была лишь немного ниже, чем в присутствии только CoQ₁₀H₂ (рис. 5). При использовании других концентраций сочетанное действие этих антиоксидантов практически совпадало с действием одного α-токоферола (рис. 5).

Тем не менее внесение в среду окисления ЛНП CoQ₁₀H₂ в концентрациях 40 или 80 мкМ вместе с 10 мкМ α-ТОН усиливало антиоксидантное действие последнего почти в 2 и 9 раз соответственно (рис. 6, столбики 4 и 5). Этот факт согласуется с данными по увеличению в аналогичных условиях продолжительности τ на кинетических кривых СРО в ЛНП (рис. 4, кривая 3).

 

Рис. 6. Изменение начальной скорости Cu²⁺-инициированного СРО в частицах ЛНП при добавлении 10 мкМ α-токоферола и различных концентраций (10–80 мкМ) убихинола Q₁₀; 1 – окисление ЛНП без добавления антиоксидантов (контроль); 2 – ЛНП + 10 мкМ α-TOH; 3 – ЛНП + 10 мкМ убихинола Q₁₀ + 10 мкМ α-TOH; 4 – ЛНП + 40 мкМ убихинола Q₁₀ + 10 мкМ α-TOH; 5 – ЛНП + 80 мкМ убихинола Q₁₀ + 10 мкМ α-TOH. * р < 0,05 – статистически значимые различия групп 2–5 по отношению к группе 1 (контроль); # р < 0,05 – статистически значимые различия групп 3–5 по отношению к группе 2 (ЛНП + 10 мкМ α-TOH)

 

Как уже отмечалось выше, совместное введение СoQ₁₀H₂ и α-ТОН в концентрации 10 мкМ, напротив, оказывает прооксидантное действие (рис. 5 и 6). Таким образом, анализ кинетических характеристик СРО частиц ЛНП показал, что введение в среду окисления высоких концентраций CoQ₁₀H₂, по-видимому, приводит к восстановлению радикалов α-ТОН, в результате чего низкие концентрации последнего более эффективно ингибируют процессы СРО в липид-белковых комплексах.

Восстановление токофероксильного радикала под действием убихинола Q₁₀ и аскорбата. Взаимодействие CoQ₁₀H₂ с α-TO^• исследовали с помощью спектроскопии ЭПР (рис. 7). Как видно из данных, представленных на рис. 7, CoQ₁₀H₂ в водно-спиртовой среде количественно восстанавливает α-TO^• (рис. 7, а; спектры 1–4). Токофероксильный радикал достаточно стабилен, что позволило оценить его концентрацию (рис. 7, б). Следует также отметить, что α-TO^• восстанавливается аскорбатом натрия (рис. 7, а; спектры 5–7). При высоких концентрациях этого антиоксиданта регистрируется небольшой дублетный сигнал ЭПР, характерный для свободного радикала аскорбиновой кислоты (семидегидроаскорбата) (рис. 7, а; спектр 7). Вместе с тем установлено, что CoQ₁₀H₂ восстанавливает феноксильный радикал синтетического гидрофобного антиоксиданта пробукола (рис. 7; спектры 8 и 9). Действие этого фенольного антиоксиданта часто сравнивают c α-TOН, в том числе при ингибировании процессов СРО в ЛНП [22, 27, 28].

 

Рис. 7. Восстановление свободных радикалов α-токоферола (α-TO^•) и пробукола. Спектры ЭПР свободных радикалов регистрировали в реакционной смеси, содержавшей 320 мМ α-ТОН или 160 мМ пробукола, которые были предварительно окислены MnO₂. а – Среда с α-TO^• без добавок (1); среда с α-TO^• после внесения CoQ₁₀H₂ в концентрациях 0,25 (2), 0,5 (3) и 1 (4) мМ; среда с α-TO^• после внесения 1 (5), 2 (6) и 5 (7) мМ аскорбата Na; среда, содержавшая феноксильный радикал пробукола (8); среда, содержавшая феноксильный радикал пробукола после внесения 0,5 мМ CoQ₁₀H₂ (9). б – Концентрационная зависимость восстановления α-TO^• убихинолом Q₁₀. в – Образование СoQ₁₀H^• в реакционной смеси при неполном восстановлении СoQ₁₀ боргидридом натрия. Реакционная среда содержала 100 мкМ СoQ₁₀ и 50 мкМ NaBH₄. Спектры ЭПР записаны через 2 мин (1), 10 мин (2) и 30 мин (3) инкубации смеси

 

Восстановление токофероксильного радикала под действием CoQ₁₀H₂ должно происходить в соответствии с реакцией (4), продуктами которой, наряду с α-ТОН, является СoQ₁₀H^•, причём нельзя исключить, что эта реакция является обратимой. Вместе с тем СoQ₁₀H^• может участвовать в регенерации α-ТОН по реакции:

${\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}^{•} + \mathrm{\alpha }-{\mathrm{TO}}^{•} \stackrel{}{\to } {\mathrm{СoQ}}_{10} + \mathrm{\alpha }-\mathrm{TOH}$. (8)

Тем не менее нам не удалось зарегистрировать СoQ₁₀H^• в ходе восстановления α-TO^•. С другой стороны, мы показали образование СoQ₁₀H^• при неполном восстановлении СoQ₁₀ боргидридом натрия. В этом случае СoQ₁₀H^•, по-видимому, является продуктом реакции конпропорционирования между СoQ₁₀ и CoQ₁₀H₂ (рис. 7, в):

${\mathrm{СoQ}}_{10} + {\mathrm{CoQ}}_{10}{\mathrm{H}}_2 \stackrel{}{\to }2 {\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}^{•}$. (9)

Снижение уровня СoQ₁₀H^• в реакционной среде (рис. 7, в) может быть связано с его одноэлектронным окислением молекулярным кислородом в процессе реакции:

${\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}^{•} + {\mathrm{О}}_2 \stackrel{}{\to } {\mathrm{СoQ}}_{10} + {\mathrm{О}}_2^{•-} + {\mathrm{H}}^{+}$, (10)

в результате чего образуется супероксидный анион-радикал (О₂^•−) [19, 29, 30].

Таким образом, отсутствие СoQ₁₀H^• в концентрации, достаточной для регистрации этого радикала в модельной системе, содержащей α-TO^• и CoQ₁₀H₂, вероятно, обусловлено протеканием реакций (8) и (10).

Тем не менее следует иметь в виду, что использованная нами система является гомогенной, в отличие от ЛНП – структурных образований, состоящих из фосфолипидного монослоя и гидрофобного ядра, содержащего эфиры холестерина и триглицериды.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В начале 90-х годов прошлого века были сформулированы представления о том, что окисленные ЛНП играют важную роль в этиологии и патогенезе атеросклероза [31–35]. На основании этих работ были предприняты многочисленные клинические исследования, в которых были сделаны попытки сдержать прогрессирование атеросклероза путём снижения окисляемости ЛНП у больных ИБС с помощью терапии высокими дозами витамина Е (α-ТОН) [36–39]. Положительного эффекта в этих клинических трайлах достигнуто не было. Это вызвало большое разочарование исследователей и привело к тому, что некоторые авторы стали полностью отрицать возможность влияния окисленных ЛНП на атерогенез [36–39]. Тем не менее нами было установлено, что ключевым фактором атерогенеза являются не окисленные (содержащие LOOH) ЛНП, а частицы ЛНП, химически модифицированные вторичными продуктами СРО – низкомолекулярными дикарбонилами (малоновым диальдегидом и др.) [39–41]. Кроме того, было высказано предположение, что защиту частиц ЛНП от повреждения при их СРО осуществляет не α-ТОН, а CoQ₁₀H₂ [42]. Это мнение противоречит представлению о том, что α-ТОН является более эффективным антиоксидантом, чем CoQ₁₀H₂ [19]. Имеются данные, что в низких концентрациях CoQ₁₀H₂ тормозит Cu²⁺-инициированное СРО частиц ЛНП in vitro [43]. Введённый перорально CoQ₁₀ после всасывания восстанавливается до CoQ₁₀H₂ и транспортируется в печень, где он включается в частицы ЛНП, которые доставляют липиды в периферические ткани [44]. После перорального приёма CoQ₁₀ максимальная концентрация CoQ₁₀H₂ в плазме крови наблюдается уже через 6–8 ч, причём период полувыведения составляет более 30 ч [44]. Установлено, что введение CoQ₁₀ per os способствует увеличению устойчивости частиц ЛНП к СРО [10–12, 45], причём при длительной дотации его содержание в частицах ЛНП может возрастать почти в 3 раза [45]. Приведённые выше данные хорошо согласуются с полученными нами результатами, которые представлены на рис. 2, где видно, что уже через 30 дней после начала пероральной терапии с включением CoQ₁₀ исходное содержание LOOH в ЛНП снижается в 4 раза и достигает минимального уровня (в 8 раз ниже исходного) через 2 мес. после начала фармакотерапии, после чего в течение последующих 4 мес. концентрация LOOH в ЛНП больных ИБС практически не изменяется (достигает «насыщения») (рис. 2). Таким образом, наши результаты убедительно свидетельствуют о возможности эффективного восстановления СoQ₁₀ до СoQ₁₀H₂ in vivo, хотя это восстановление может и не быть следствием биорегенерации СoQ₁₀ непосредственно в составе частиц ЛНП, а отражает возможность биотрансформации этого антиоксиданта в процессе всасывания и/или при сборке частиц ЛНП в печени [44]. Биосинтез СoQ₁₀H₂ обеспечивает основную потребность организма в этом нутриенте, поскольку лишь около 40% СoQ₁₀H₂ поступает с пищей [8]. В соответствии с этим использование холестерин-снижающей фармакотерапии с включением ингибиторов HMG-CoA-редуктазы (статины), которые одновременно с ингибированием синтеза холестерина подавляют и биосинтез СoQ₁₀H₂, приводит к развитию дефицита СoQ₁₀H₂ [46–48]. Таким образом, терапия статинами способствует увеличению окисленности ЛНП больных [49]. Это тем более нежелательно, поскольку при заболеваниях сердечно-сосудистой системы отмечен дефицит СoQ₁₀ [50, 51], причём при атеросклерозе преимущественно снижается уровень его восстановленной формы [51]. Следует отметить, что дотация больным ИБС высоких пероральных доз витамина Е (α-токоферилсукцината) практически не влияет на окисляемость ЛНП [22]. Этот факт может свидетельствовать о том, что эфиры α-токоферола не полностью гидролизуются в организме больных ИБС с образованием активной антиоксидантной формы (свободного α-ТОН), хотя соответствующая арилгидролаза имеется в клетках стенки кишечника. С другой стороны, можно предположить, что in vivo влияние α-ТОН на окисляемость ЛНП зависит от его локализации в этих частицах [22].

Для исследования эффективности ингибирующего действия различных липофильных фенольных антиоксидантов мы использовали стандартную модель Cu²⁺-инициированного СРО частиц ЛНП [22–24]. Эта модель основана на образовании пероксильного (LOO^•) и алкоксильного (LO^•) радикалов липидов в следующих реакциях:

$\mathrm{LOOH} + {\mathrm{Cu}}^{2+} \to {\mathrm{LOO}}^{•} + {\mathrm{H}}^{+} + {\mathrm{Cu}}^{+}$, (11)

$\mathrm{LOOH} + {\mathrm{Cu}}^{+} \to {\mathrm{LO}}^{•} + {\mathrm{OH}}^{-} + {\mathrm{Cu}}^{2+}$, (12)

а также супероксидного анион-радикала (O₂^•−), пероксида водорода (Н₂O₂) и гидроксильного радикала (НO^•). Эти АФК продуцируются в катализируемых ионами меди реакциях:

${\mathrm{O}}_2 + {\mathrm{Cu}}^{+} \to {\mathrm{O}}_2^{•-} + {\mathrm{Cu}}^{2+}$, (13)

${\mathrm{O}}_2^{•-} + {\mathrm{O}}_2^{•-} + 4 {\mathrm{Н}}^{+} \to 2 {\mathrm{Н}}_2{\mathrm{O}}_2$, (14)

${\mathrm{Н}}_2{\mathrm{O}}_2 + {\mathrm{Cu}}^{+} \to {\mathrm{НO}}^{•} + {\mathrm{OH}}^{-} + {\mathrm{Cu}}^{2+}$. (15)

В свою очередь, НO^•, LOО^• и LO^• взаимодействуют с ацилами ПНЖК (LH) фосфолипидов частиц ЛНП и тем самым участвуют в других цепных реакциях СРО.

Следовательно, использованная нами система окисления фактически моделирует процесс СРО частиц ЛНП, происходящий при окислительном стрессе под действием АФК in vivo и широко используется в работах по исследованию механизмов окислительных процессов в ЛНП in vitro [25, 52–54]. Результаты, полученные с использованием модели Cu²⁺-инициированного СРО частиц ЛНП, приведены на рис. 3–6. Анализ кинетических кривых СРО частиц ЛНП свидетельствует о том, что наиболее эффективным из исследуемых липофильных антиоксидантов является α-токоферол. Смесь эквимолярных концентраций СoQ₁₀H₂ и α-ТОН ингибирует СРО в основном так же, как один α-ТОН, хотя в присутствии 10 мкМ этих антиоксидантов наблюдается некоторый прооксидантный эффект в сравнении с той же концентрацией α-ТОН (рис. 5 и 6). Этот эффект СoQ₁₀H₂ можно объяснить участием СoQ₁₀H^• в продукции ${\mathrm{O}}_2^{•-}$ (реакция (10)) и, как следствие, других АФК (реакции (14) и (15)). В высоких концентрациях (40 и 80 мкм) α-ТОН и его сочетание с СoQ₁₀H₂ вызывает практически полное ингибирование реакций перекисного окисления в ЛНП (рис. 3 и 5). Нужно отметить, что, в отличие от α-ТОН, увеличение уровня СoQ₁₀H₂ почти не влияет на продолжительность периода индукции (τ) на кинетических кривых СРО (рис. 4). Такое действие СoQ₁₀H₂ согласуется с данными работы Nohl et al. [29], где было показано, что τ индуцированного азоинициатором СРО липосом растёт при повышении концентрации СoQ₁₀H₂ заметно меньше, чем в присутствии α-ТОН.

В то же время добавление к частицам ЛНП СoQ₁₀H₂ в концентрации 80 мкМ вместе с 10 мкМ α-ТОН существенно усиливает антиоксидантное действие последнего (рис. 4 и 6). Эти результаты указывают на существование синергизма в механизме совместного антиоксидантного действия СoQ₁₀H₂ и α-ТОН. Объяснением такого синергизма может быть восстановление в присутствии СoQ₁₀H₂ (реакция (4)) токофероксильных радикалов, способных инициировать дальнейшие цепные реакции СРО в частицах ЛНП (реакция (5)) [19]. Действительно, в гомогенной модельной системе (водно-спиртовая смесь) нами было показано, что при молярном соотношении α-ТО^• и СoQ₁₀H₂, равном 1/31, происходит восстановление приблизительно 45% α-ТО^• (рис. 7, б). Важно отметить, что данный механизм биорегенерации α-ТОН может объяснить эффективное антиоксидантное действие препарата СoQ₁₀ при его введении больным атеросклерозом (рис. 2). Поскольку in vivo содержание α-ТОН в частицах ЛНП значительно выше, чем СoQ₁₀H₂, не исключено, что реакция (4) является обратимой. Таким образом, можно предположить участие α-ТОН в биорегенерации (восстановлении) убисемихинона Q₁₀ в частицах ЛНП в ходе реакции:

${\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}^{•} + \mathrm{\alpha }-\mathrm{ТОН} \to {\mathrm{СoQ}}_{10}{\mathrm{H}}_2 + \mathrm{\alpha }-{\mathrm{ТО}}^{•}$. (16)

Действительно, ранее было показано, что добавление СoQ₁₀H₂ стимулирует образование феноксильного радикала пробукола в частицах ЛНП при их интенсивном окислении [28]. Полагают, что пробукол, как, возможно, и α-ТОН, окисляется образующимся в этих условиях СoQ₁₀H^•. Однако в используемой нами гомогенной модельной системе феноксильный радикал пробукола, так же как α-ТО^•, восстанавливался СoQ₁₀H₂ (рис. 7, а).

Вместе с тем известно, что свободные радикалы пробукола и α-токоферола, но не СoQ₁₀H^•, восстанавливаются аскорбиновой кислотой (Asc-OH) [27, 28, 55–57]. Этот механизм регенерации α-ТОН согласуется с полученными нами результатами (рис 7, а; спектры 5–7) и предполагает протекание следующих реакций:

$\mathrm{Asc}-\mathrm{OH} + \mathrm{\alpha }-{\mathrm{ТО}}^{•} \to \mathrm{Asc}-{\mathrm{O}}^{•-} + \mathrm{\alpha }-\mathrm{ТОH}$, (17)

$\mathrm{Asc}-{\mathrm{O}}^{•-} + \mathrm{\alpha }-{\mathrm{ТО}}^{•} \to \mathrm{Asc}=\mathrm{O} + \mathrm{\alpha }-\mathrm{ТОH}$, (18)

где Asc-O^•− – семидегидроаскорбат (свободный радикал аскорбата); Asc=O – дегидроаскорбиновая кислота.

Тем не менее роль аскорбиновой кислоты в процессе защиты частиц ЛНП от СРО не до конца выяснена. Очевидно, что высокая концентрация аскорбата в плазме крови и наличие редуктазы семидегидроаскорбата (Asc-O^•−) в мембране эритроцитов [55] нужны, прежде всего, для подавления взаимодействия образующихся при окислительном стрессе АФК (таких как O₂^•− и НO^•) с частицами ЛНП. Как уже отмечалось, Asc–OH не регенерирует СoQ₁₀H₂ из СoQ₁₀H^•, однако, по имеющимся в литературе данным, аналоги СoQ₁₀ с короткой цепью восстанавливаются до соответствующих убисемихинонов в реакциях с аскорбатом и семигидроаскорбатом [30, 58]. Исходя из вышесказанного, можно полагать, что аскорбат восстанавливает α-ТО^• до α-ТОН и СoQ₁₀ до СoQ₁₀H^•. Возможное участие различных природных антиоксидантов в сопряжённых процессах защиты частиц ЛНП от цепных процессов СРО показано на нижеследующей схеме (рис. 8).

 

Рис. 8. Гипотетическая схема, иллюстрирующая возможные механизмы биорегенерации СoQ₁₀H₂ и α-ТОН в процессе СРО частиц ЛНП. Принятые обозначения: СoQ₁₀H₂, СoQ₁₀H^• и СoQ₁₀ – убихинол Q₁₀ (восстановленная форма коэнзима Q₁₀), убисемихинол Q₁₀ и убихинон Q₁₀ (окисленная форма коэнзима Q₁₀) соответственно; α-ТОН и α-ТО^• – α-токоферол и токофероксильный радикал; Asc-OH, Asc-O^• и Asc=O – аскорбиновая кислота, семидегидроаскорбат и дегидроаскорбат соответственно; LOO^• и LO^• – пероксильный и алкоксильный радикалы ПНЖК; LOOН и LOН – гидропероксид и гидроксид липидов

 

По всей видимости, система сопряжёных реакций липофильных и гидрофильных антиоксидантов функционирует как своеобразный редокс-буфер, обеспечивающий наиболее эффективную антиоксидантную защиту частиц ЛНП в условиях окислительного стресса.

Важно отметить, что характер действия СoQ₁₀H₂ и синтетического антиоксиданта skQ1 на Cu²⁺-индуцированное СРО в частицах ЛНП имеет сходный характер (рис. 3–5), несмотря на существенное различие небензохиноновой части их молекул (рис. 1). Предложенные нами механизмы биорегенерации коэнзима Q₁₀ и α-токоферола обсуждаются и другими авторами [16, 19]. На возможность протекания таких реакций указывают существующие представления о близости расположения СoQ₁₀H₂ и α-ТОН в частицах ЛНП, при котором бензохиноновая или хромановая части молекул этих антиоксидантов примыкают к гидрофильным фосфатным группировкам фосфолипидов, а гидрофобные «хвосты» находятся вблизи ацилов ПНЖК фосфолипидов [19].

Необходимо учитывать, что в каждой частице ЛНП на 1 молекулу СoQ₁₀H₂ приходится до 12 молекул α-ТОН [13, 17], причём количество субстрата СРО – ацилов ПНЖК, в фосфолипидах ЛНП в молярном отношении составляет около 20–30 на 1 моль α-ТОН [59]. Если исходить из округлённых молярных соотношений между СoQ₁₀H₂/α-ТОН/ПНЖК = 1/10/300, становится понятно, что с учётом предполагаемых механизмов биорегенерации липофильных антиоксидантов ингибирование СРО в частицах ЛНП должно быть весьма эффективным. В действительности эта эффективность может быть ещё выше, поскольку одна молекула восстановленного коэнзима Q₁₀ способна утилизировать два свободных радикала, действуя сначала как СoQ₁₀H₂, а затем – как СoQ₁₀H^• (реакции (2) и (3)). Тем не менее конкретные механизмы антиоксидантной защиты частиц ЛНП и участия различных природных антиоксидантов в регуляции процессов СРО в частицах ЛНП нуждаются в дополнительном экспериментальном обосновании.

Вклад авторов. Ланкин В.З. – концепция исследования, написание варианта статьи и обсуждения результатов; Шумаев К.Б. – проведение ЭПР-спектрометрических исследований, обсчёт результатов, изготовление рисунков, написание варианта статьи и обсуждения результатов; Медведева В.А. – проведение кинетических исследований; Тихазе А.К. – подготовка списка литературы, участие в написании обсуждения статьи; Коновалова Г.Г. – проведение клинического исследования.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-15-00013).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Клиническая часть исследования проводилась в соответствии с этическими стандартами национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 года и её последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включённых в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Экспериментальные протоколы были одобрены Этическим комитетом Института клинической кардиологии НМИЦК Минздрава России 29 января 2018 года (идентификационный код проекта 233).

About the authors

V. Z. Lankin

National Medical Research Center of Cardiology Named after Academician E. I. Chazov, Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: lankin0309@mail.ru
Russian Federation, 121552 Moscow

K. B. Shumaev

National Medical Research Center of Cardiology Named after Academician E. I. Chazov, Ministry of Health of the Russian Federation; Bach Institute of Biochemistry, Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences

Email: lankin0309@mail.ru
Russian Federation, 121552 Moscow; 119071 Moscow

V. A. Medvedeva

National Medical Research Center of Cardiology Named after Academician E. I. Chazov, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: lankin0309@mail.ru
Russian Federation, 121552 Moscow

A. K. Tikhaze

National Medical Research Center of Cardiology Named after Academician E. I. Chazov, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: lankin0309@mail.ru
Russian Federation, 121552 Moscow

G. G. Konovalova

National Medical Research Center of Cardiology Named after Academician E. I. Chazov, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: lankin0309@mail.ru
Russian Federation, 121552 Moscow

References

Supplementary files