Влияние РНК-связывающего белка Sam68 на активность поли(ADP-рибоза)-полимеразы 1

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Принимая во внимание участие РНК-связывающих белков в регуляции активности поли(ADP-рибоза)-полимеразы 1 (PARP1), ключевого фактора репарации ДНК, было проведено исследование влияния внутренне неупорядоченного белка Sam68 на каталитическую активность этого фермента. Для проведения исследования была получена плазмидная конструкция, содержащая в своем составе кодирующую последовательность белка Sam68, проведена оптимизация условий экспрессии Sam68 в клетках Escherichia coli, отработана методика его выделения и подобраны условия для рефолдинга этого белка из телец включения. Наши исследования в реконструированной системе показали, что Sam68 способен регулировать каталитическую активность PARP1, стимулируя ее авто-поли(ADP-рибозил)ирование. Определено сродство Sam68 к поврежденной ДНК и очищенной поли(ADP-рибозе) (PAR). На основании полученных экспериментальных данных была предложена гипотеза, объясняющая механизм стимуляции активности PARP1 белком Sam68. Согласно этой гипотезе, Sam68 взаимодействует с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1, экранирует отрицательный заряд PAR и тем самым увеличивает время жизни активного комплекса авто-поли(ADP-рибозил)ированной PARP1 с поврежденной ДНК. Это приводит к возрастанию уровня PAR, синтезируемой этим ферментом.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

К. Н. Науменко

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

Е. А. Бережнев

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

Т. А. Кургина

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

М. В. Суханова

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

О. И. Лаврик

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, 630090 Новосибирск

Список литературы

  1. Vermeij, W. P., Hoeijmakers, J. H., and Pothof, J. (2016) Genome integrity in aging: human syndromes, mouse models, and therapeutic options, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 56, 427-445, https://doi.org/10.1146/annurev- pharmtox-010814-124316.
  2. Althaus, F. R., Kleczkowska, H. E., Malanga, M., Müntener, C. R., Pleschke, J. M., et al. (1999) Poly ADP-ribosylation: a DNA break signal mechanism. Mol. Cell. Biochem., 193, 5-11, https://doi.org/10.1007/978-1-4419-8740-2_1.
  3. D’Amours, D., Desnoyers, S., D’Silva, I., and Poirier, G. G. (1999) Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions, Biochem. J., 342 (Pt 2), 249-268, https://doi.org/10.1042/bj3420249.
  4. Huang, D., and Kraus, W. L. (2022) The expanding universe of PARP1-mediated molecular and therapeutic mechanisms, Mol. Cell, 82, 2315-2334, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.02.021.
  5. Alemasova, E. E., and Lavrik, O. I. (2019) Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP1: reaction mechanism and regulatory proteins, Nucleic Acids Res., 47, 3811-3827, https://doi.org/10.1093/nar/gkz120.
  6. Ayyappan, V., Wat, R., Barber, C., Vivelo, C. A., Gauch, K., Visanpattanasin, P., Cook, G., Sazeides, C., and Leung, A. K. L. (2021) ADPriboDB 2.0: an updated database of ADP-ribosylated proteins, Nucleic Acids Res., 49, D261-D265, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa941.
  7. Corley, M., Burns, M. C., and Yeo, G. W. (2020) How RNA-binding proteins interact with RNA: molecules and mechanisms, Mol. Cell, 78, 9-29, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.03.011.
  8. Altmeyer, M., Neelsen, K. J., Teloni, F., Pozdnyakova, I., Pellegrino, S., Grøfte, M., Rask, M. D., Streicher, W., Jungmichel, S., Nielsen, M. L., and Lukas, J. (2015) Liquid demixing of intrinsically disordered proteins is seeded by poly(ADP-ribose), Nat. Commun., 6, 8088, https://doi.org/10.1038/ncomms9088.
  9. Singatulina, A. S., Hamon, L., Sukhanova, M. V., Desforges, B., Joshi, V., Bouhss, A., Lavrik, O. I., and Pastré, D. (2019) PARP-1 activation directs FUS to DNA damage sites to form PARG-reversible compartments enriched in damaged DNA, Cell Rep., 27, 1809-1821.e5, https://doi.org/10.1016/j.celrep.2019.04.031.
  10. Neelamraju, Y., Hashemikhabir, S., and Janga, S. C. (2015) The human RBPome: from genes and proteins to human disease, J. Proteomics, 127 (Pt A), 61-70, https://doi.org/10.1016/j.jprot.2015.04.031.
  11. Alemasova, E. E., Naumenko, K. N., Pestryakov, P. E., and Lavrik, O. I. (2017) Production, purification of the recombinant analog of Y-box-binding protein 1 and its interaction with poly(ADP-ribose), RNA, single- and double-stranded DNAs, Biopolym. Cell, 33, 214-220, https://doi.org/10.7124/bc.000954.
  12. Alemasova, E. E., Naumenko, K. N., Kurgina, T. A., Anarbaev, R. O., and Lavrik, O. I. (2018) The multifunctional protein YB-1 potentiates PARP1 activity and decreases the efficiency of PARP1 inhibitors, Oncotarget, 9, 23349-23365, https://doi.org/10.18632/oncotarget.25158.
  13. Naumenko, K. N., Sukhanova, M. V., Hamon, L., Kurgina, T. A., Alemasova, E. E., Kutuzov, M. M., Pastré, D., and Lavrik, O. I. (2020) Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity by Y-box-binding protein 1, Biomolecules, 10, 1325, https://doi.org/10.3390/biom10091325.
  14. Naumenko, K. N., Sukhanova, M. V., Hamon, L., Kurgina, T. A., Anarbaev, R. O., Mangerich, A., Pastré, D., and Lavrik, O. I. (2022) The C-terminal domain of Y-box binding protein 1 exhibits structure-specific binding to poly(ADP-ribose), which regulates PARP1 activity, Front. Cell. Dev. Biol., 10, 831741, https://doi.org/10.3389/fcell.2022.831741.
  15. Sun, X., Fu, K., Hodgson, A., Wier, E. M., Wen, M. G., Kamenyeva, O., Xia, X., Koo, L. Y., and Wan, F. (2016) Sam68 is required for DNA damage responses via regulating poly(ADP-ribosyl)ation, PLoS Biol., 14, e1002543, https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002543.
  16. Gagné, J. P., Pic, E., Isabelle, M., Krietsch, J., Ethier, C., Paquet, E., Kelly, I., Boutin, M., Moon, K. M., Foster, L. J., and Poirier, G. G. (2012) Quantitative proteomics profiling of the poly(ADP-ribose)-related response to genotoxic stress, Nucleic Acids Res., 40, 7788-7805, https://doi.org/10.1093/nar/gks486.
  17. Studier, F. W. (2005) Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein expr. purif., 41, 207-234, https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016.
  18. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.
  19. Kurgina, T. A., Anarbaev, R. O., Sukhanova, M. V., and Lavrik, O. I. (2018) A rapid fluorescent method for the real-time measurement of poly(ADP-ribose) polymerase 1 activity, Anal. Biochem., 545, 91-97, https:// doi.org/10.1016/j.ab.2017.12.033.
  20. Costa, S., Almeida, A., Castro, A., and Domingues, L. (2014) Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system, Front. Microbiol., 5, 63, https:// doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063.
  21. Lukong, K. E., and Richard, S. (2003) Sam68, the KH domain-containing superSTAR. Biochim. Biophys. Acta, 1653, 73-86, https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2003.09.001.
  22. Duan, Y., Du, A., Gu, J., Duan, G., Wang, C., Gui, X., Ma, Z., Qian, B., Deng, X., Zhang, K., Sun, L., Tian, K., Zhang, Y., Jiang, H., Liu, C., and Fang, Y. (2019) PARylation regulates stress granule dynamics, phase separation, and neurotoxicity of disease-related RNA-binding proteins, Cell Res., 29, 233-247, https://doi.org/10.1038/s41422-019-0141-z.
  23. Churion, K. A., and Bondos, S. E. (2012) Identifying solubility-promoting buffers for intrinsically disordered proteins prior to purification, Methods Mol. Biol., 896, 415-427, https://doi.org/10.1007/978-1-4614-3704-8_28.
  24. Shukla, D., and Trout, B. L. (2010) Interaction of arginine with proteins and the mechanism by which it inhibits aggregation, J. Phys. Chem. B, 114, 13426-13438, https://doi.org/10.1021/jp108399g.
  25. Sarma, R., and Paul, S. (2013) Exploring the molecular mechanism of trimethylamine-N-oxide’s ability to counteract the protein denaturing effects of urea, J. Phys. Chem. B, 117, 5691-5704, https://doi.org/10.1021/jp401750v.
  26. Mamontova, E. M., Clément, M. J., Sukhanova, M. V., Joshi, V., Bouhss, A., Rengifo-Gonzalez, J. C., Desforges, B., Hamon, L., Lavrik, O. I., and Pastré, D. (2023) FUS RRM regulates poly(ADP-ribose) levels after transcriptional arrest and PARP-1 activation on DNA damage, Cell Rep., 42, 113199, https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113199.
  27. Arakawa, J., Uegaki, M., and Ishimizu, T. (2011) Effects of L-arginine on solubilization and purification of plant membrane proteins, Protein Expr. Purif., 80, 91-96, https://doi.org/10.1016/j.pep.2011.05.014.
  28. Teloni, F., and Altmeyer, M. (2016) Readers of poly(ADP-ribose): designed to be fit for purpose, Nucleic Acids Res., 44, 993-1006, https://doi.org/10.1093/nar/gkv1383.
  29. Lin, Q., Taylor, S. J., and Shalloway, D. (1997) Specificity and determinants of Sam68 RNA binding. Implications for the biological function of K homology domains, J. Biol. Chem., 272, 27274-27280, https://doi.org/10.1074/jbc.272.43.27274.
  30. Gibson, T. J., Thompson, J. D., and Heringa, J. (1993) The KH domain occurs in a diverse set of RNA-binding proteins that include the antiterminator NusA and is probably involved in binding to nucleic acid, FEBS Lett., 324, 361-366, https://doi.org/10.1016/0014-5793(93)80152-k.
  31. Chen, T., Damaj, B. B., Herrera, C., Lasko, P., and Richard, S. (1997) Self-association of the single-KH-domain family members Sam68, GRP33, GLD-1, and Qk1: role of the KH domain, Mol. Cell. Biol., 17, 5707-5718, https://doi.org/10.1128/MCB.17.10.5707.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Анализ экспрессии His-tag-Sam68 в лизате различных штаммов-продуцентов методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250 (а) или методом вестерн-блота (б). Дорожки: 1 и 14 – маркер молекулярных масс («Bio-Rad», США); 2 и 3 – штамм BL21(DE3) до и после индукции; 4 и 5 – штамм BL21(DE3)GeneX до и после индукции; 6 и 7 – штамм BL21(DE3)pLysS до и после индукции; 8 и 9 – штамм Rosetta(DE3) до и после индукции; 10 и 11 – штамм Rosetta(DE3)pLysS до и после индукции; 12 и 13 – штамм Rosetta(DE3)GamiB до и после индукции

Скачать (241KB)
Метаданные
3. Рис. 2. При экспрессии в клетках E. coli Sam68 накапливается в виде телец включения. а – Анализ содержания His-tag-Sam68 в растворимой и нерастворимой фракциях методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Дорожки: 1 и 8 – маркер молекулярных масс («Bio-Rad»); 2 – растворимая фракция после центрифугирования лизированных клеток; 3 – лизат штамма продуцента Rosetta(DE3)pLysS; 4 – растворимая фракция в 1 М мочевине после центрифугирования лизированных клеток; 5 – нерастворимая фракция; 6 – растворимая фракция в 8 М мочевине; 7 – нерастворимая фракция после обработки лизата клеток 8 М мочевиной. б – Анализ содержания белка после хроматографии на колонке с Ni-NTA. Дорожки: 1 – маркер молекулярных масс; 2 – 0,1 мкг; 3 – 0,2 мкг; 4 – 0,3 мкг; 5 – 0,4 мкг; 6 – 0,5 мкг; 7 – 1 мкг белка, полученные после элюции с Ni-NTA

Скачать (177KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Анализ растворимости Sam68 в мочевине методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 200 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мкМ Sam68 и мочевину в соответствующей концентрации (125 мМ–8 М)

Скачать (71KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Анализ растворимости Sam68 при низкой концентрации мочевины (150 мМ) в присутствии аргинина (а) или TMAO (б) методом денатурирующего гель-электрофореза в 10%-ном Ds-Na-ПААГ с последующим окрашиванием Кумасси R-250. Реакционная смесь содержала 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 1 мМ ДТТ, 150 мМ мочевины, 1 мкМ Sam68 и аргинин/ТМАО в указанной концентрации. Анализировали растворимую фракцию (↑) и осадок (↓)

Скачать (182KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Влияние мочевины (а и б) и аргинина (в и г) на каталитическую активность PARP1. а – Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования в присутствии мочевины. б – Диаграмма, построенная после анализа распределения радиоактивности в геле, представленном на панели (а). Активность PARP1 при отсутствии мочевины принята за 100%. в – Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования в присутствии аргинина. г – Диаграмма, построенная после анализа распределения радиоактивности в геле, представленном на панели (в). Активность PARP1 при отсутствии аргинина принята за 100%

Скачать (371KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Sam68 стимулирует активность PARP1. а – Кинетика уровня синтеза PAR в присутствии различных концентраций Sam68. Pеакцию синтеза PAR проводили с использованием [32P]NAD+ и останавливали перенесением аликвот реакционной смеси на бумажный фильтр Whatman, пропитанный ТХУ. На графиках приведены средние значения ± стандартные отклонения для трех независимых экспериментов. б – Анализ авто-PAR-илирования PARP1 и транс-PAR-илирования Sam68 методом денатурирующего гель-электрофореза. Радиоавтограф 10%-ного Ds-Na-ПААГ, в котором проводили разделение продуктов реакции PAR-илирования белков

Скачать (284KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Связывание PAR белком Sam68. а – Радиоавтограф нативного 5%-ного ПААГ, в котором проводилось разделение комплексов Sam68•PAR. б – Относительный уровень связывания Sam68 с PAR, оцененный по данным анализа электрофореграммы, представленной на панели (а). Сродство (EC50) Sam68 к PAR определяли как концентрацию Sam68, при которой 50% PAR находится в комплексе. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 500 мМ мочевины, 100 мкг/мл БСА, 10 нМ [32P]-меченой PAR и Sam68 в указанных концентрациях (75 нМ–5 мкМ)

Скачать (194KB)
Метаданные
9. Рис. 8. Сродство Sam68 к поврежденной ДНК. Изменение анизотропии флуоресценции ДНК (FAМ-Nick) в присутствии различных концентраций Sam68. Реакционные смеси содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, 500 мМ мочевины, 10 нМ ДНК (FAM-Nick) и Sam68 в указанных концентрациях

Скачать (147KB)
Метаданные
10. Рис. 9. Исследование комплексообразования PARP1 и Sam68 с ДНК (FAM-Nick) методом анизотропии флуоресценции. Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 50 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 500 мМ мочевины, 10 нМ ДНК (FAM-Nick), 0–10 мкМ Sam68 и 100 нМ PARP1

Скачать (145KB)
Метаданные
11. Рис. 10. Гипотетический механизм регуляции активности PARP1 белком Sam68. а – Образование комплекса PARP1 с поврежденной ДНК. б – Авто-поли(ADP-рибозил)ирование PARP1. в – Образование комплекса Sam68 с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1. Связываясь с PAR, ковалентно присоединенной к PARP1, Sam68 экранирует отрицательный заряд этого полимера, стабилизируя комплекс PARP1 с поврежденной ДНК, и тем самым стимулирует синтез поли(ADP-рибозы)

Скачать (171KB)
Метаданные
12. Приложение
Скачать (130KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».