Functional Analysis of the Channel Rhodopsin Genes from the Green Algae of the White Sea Basin

全文:

Принятые сокращения: CCR – катионные канальные родопсины; RACE – метод быстрой амплификации концов кДНК.

ВВЕДЕНИЕ

Канальные родопсины представляют особую группу интегральных мембранных ретиналь-связывающих белков, которые в ответ на активацию светом напрямую осуществляют пассивный ионный транспорт, в отличие от остальных родопсинов (в частности, зрительных), регулирующих ионные каналы опосредованно, через активацию энзиматических каскадов [1]. В природе канальные родопсины обнаружены преимущественно у подвижных фототрофных организмов, микроводорослей Chlorophyta и Cryptophyta, где выполняют функции фоторецепторов, участвующих в фототаксисе. Впервые фотоэлектрический ответ при фототаксисе in vivo был показан на клетках зеленой водоросли Haematococcus pluvialis [2] и впоследствии детально изучен на зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii [3]. Идентифицированные фоторецепторы CrChR1 и CrChR2 C. reinhardtii являются катионными канальными родопсинами (CCR) и различаются как по параметрам фотоиндукции, так и по кинетике фотоэлектрического ответа [3, 4]. Предполагается, что основную роль при фототаксисе выполняет CrChR2, в то время как CrChR1 участвует в защите от света высокой интенсивности.

Благодаря своим уникальным качествам канальные родопсины нашли широкое применение в оптогенетике – методе светоуправляемой регуляции процессов в клетке. В оптогенетическом эксперименте при гетерологичной экспрессии в клетках-мишенях гены канальных родопсинов и ионных помп со специфичностью к катионам и анионам обеспечивают деполяризацию и гиперполяризацию клеточной мембраны и позволяют таким образом регулировать нейрональную активность [5]. Несмотря на огромный прогресс в поиске новых генов канальных родопсинов методами геномного анализа, количество генов, кодирующих белки с экспериментально подтвержденной функциональной активностью, все еще очень ограничено [6]. В результате до сих пор для оптогенетических исследований наиболее изученным и применяемым в различных модификациях остается катионный канальный родопсин CrChR2 зеленой водоросли C. reinhardtii.

Наш проект нацелен на поиск новых генов канальных родопсинов у одноклеточных водорослей Chlorophyta и Cryptophyta Беломорского бассейна и базируется на уникальной коллекции природных изолятов микроводорослей NAMSU (https://depo.msu.ru/open/public/search?collection=algabiotech), созданной на кафедре биоинженерии биологического факультета МГУ. Представленные здесь результаты получены в продолжение нашего исследования по поиску новых CCR в зеленых водорослях Haematococcus и Bracteacoccus. Ранее с помощью разработанного нами ПЦР-теста впервые было показано наличие гена CCR (34CCR) в микроводоросли рода Bracteacoccus; также в двух изолятах Haematococcus lacustris были обнаружены гены CCR (37CCR и негомологичные гены 98CCR1, 98CCR1-1), соответствующие уже идентифицированным генам CCR H. lacustris [7]. Таким образом, данный ПЦР-тест оказался эффективен не только для анализа таксономической группы на присутствие генов CCR, но и для анализа мультигенных семейств CCR.

Для изучения экспрессии обнаруженных CCR-генов Haematococcus и Bracteacoccus были получены их транскрипты, проведен структурный анализ их белковых продуктов (Hl98CCR2 и Ba34CCR) и определена функциональная активность Hl98CCR2 и Ba34CCR при гетерологичной экспрессии в культуре клеток китайского хомячка СНО-К1. Мы показали, что белки Hl98CCR2 и Ba34CCR содержат 7 консервативных мембранных участков (ТМ1–ТМ7) трансмембранной локализации и способны к образованию гомодимеров, что типично для пространственной структуры канальных родопсинов. В электрофизиологических экспериментах с трансфицированными клетками СНО-К1 по методике пэтч-кламп было показано, что экспрессируемый белок Ba34CCR способен к светозависимой генерации тока и по параметрам сопоставим с катионным канальным родопсином CrChR2 C. reinhardtii. Таким образом, мы впервые обнаружили и охарактеризовали функциональный катионный канальный родопсин из зеленой микроводоросли Bracteacoccus.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Происхождение штаммов зеленых водорослей (Chlorophyta) и условия культивирования подробно описаны ранее [7]. Для выделения тотальной РНК использовали активно растущие культуры H. lacustris NAMSU-BM-7/15 и B. aggregatus NAMSU-BM-5/15 в среде BG-11 при инкубации в течение 1–2 недель при 25 °С и освещении белым светом 40 мкмоль квантов ФАР м−2·с−1.

Выделение РНК и получение CCR-специфических транскриптов. Суммарную РНК выделяли из 5–10 мл культур с помощью набора RNeasy plus («Qiagen», США). Для экстракции РНК образцы (~100 мг сырого веса) лизировали механическим разрушением в дезинтеграторе FastPrep-24™ 5G («MP Biomedicals», США) в присутствии микробусин Lysing Matrix type A. Для приготовления кДНК брали 250 нг РНК; полноразмерные транскрипты получали по методу быстрой амплификации концов кДНК (RACE) с использованием набора Мint–RАСЕ («Евроген», Россия). Полученные ПЦР-продукты анализировали электрофорезом в 1%-ной агарозе и элюировали из геля с помощью набора Cleanup Mini («Евроген»). Далее, ПЦР-продукты секвенировали по методу Сэнгера (ЦПК «Геном» при ИМБ РАН, Россия), последовательности выравнивали и совмещали по участкам гомологии (BLASTn, NCBI).

Структурно-функциональные характеристики транслированных продуктов CCR-специфических транскриптов и 3Д-моделирование. Для анализа транслированных аминокислотных последовательностей продуктов полученных CCR-транскриптов использовали построение гомологии с ранее идентифицированными белками CCR Chlorophyta методом множественного выравнивания CLUSTAL Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). 3Д-Моделирование выполняли в программе SWISS-MODEL (https:// swissmodel.expasy.org/) с использованием кристаллической структуры CrChR2 C. reinhardtii в качестве матрицы.

Гетерологичная экспрессия родопсинов в культуре клеток СНО-К1. Конструирование экспрессионных плазмид. Для экспрессии в клетках млекопитающих нуклеотидные последовательности транскриптов Hl98CCR2 (полная рамка считывания, 350 а.о.) и Ba34CCR (1–295 а.о.) были кодон-оптимизированы (GeneArt; «Thermo Fisher Scientific», США), выполнен химический синтез обоих генов («Евроген») и проведено их субклонирование в экспрессионный вектор pcDNA3.1 eYFP[8] по рестрикционным сайтам BamHI и NotI.

Трансфекция экспрессионных плазмид в культуру клеток СНО-К1. Для гетерологичной экспрессии белков Ba34CCR и Hl98CCR2 использовали иммортализованную линию эпителиальных клеток яичников китайского хомячка Cricetulus griseus СНО-К1 (Chinese Hamster Ovary cells). Трансфекцию клеток экспрессионными векторами pcDNA3.1 eYFP. Ba34CCR и pcDNA3.1 eYFP. Hl98CCR2 выполняли с использованием реагента Lipofectamine® LTX with Plus™ Reagent («Thermo Fisher Scientific»). Маркером успешной трансфекции являлась флуоресценция клеток под действием света при длине волны 490 нм. Трансфицированные клетки содержали в стандартных условиях культивирования в питательной среде DMEM/F12 («Gibco», «Thermo Fisher Scientific», США) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; «HyClone», США), 2 мМ глутамина («Sigma-Aldrich», США) и 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина («Gibco», «Thermo Fisher Scientific») при 37 °C в атмосфере 21% О₂ и 5% СО₂. Через 24 ч после трансфекции в культуральную среду добавляли 1 мкМ транс-ретиналя R2500 («SigmaAldrich»).

Флуоресцентная микроскопия экспрессированных родопсинов. Для определения локализации экспрессированных белков Ba34CCR и Hl98CCR2 трансфицированные клетки линии СНО-К1 обрабатывали флуоресцентными красителями, специфическими для цитоплазматических мембран (CellBrite Red; «Biotium», Великобритания) и ядер (Hoechst 33342, «Thermo Fisher Scientific»). Для этого клетки инкубировали с 10 мкМ CellBrite Red в нормальной среде, содержащей 1% ДМСО и 5 мкг/мл Hoechst 33342, в течение 15 мин, дважды промывали буфером PBS и один раз – DMEM. Прижизненные изображения были получены с использованием системы жизнеобеспечения на микроскопе Eclipse Ti-E с конфокальным модулем А1 («Nikon Corporation», Япония) и объективом Apo TIRF 63×/1,49. Все захваты изображений были получены при одинаковых настройках динамического диапазона.

Определение фотоэлектрической активности родопсинов Ba34CCR и Hl98CCR2. Электрофизиологические эксперименты проводили через 48 ч после трансфекции. Светоиндуцированный ток Hl98CCR2 (I₉₈) или Ba34CCR (I₃₄) регистрировали в трансфицированных клетках СНО-К1 с помощью техники пэтч-кламп в конфигурации whole-cell в режиме фиксации потенциала. Использовали усилитель Axopatch 200А («Molecular Devices», США).

Покровное стекло с культурой СНО-К1 помещали в экспериментальную камеру и перфузировали при комнатной температуре (23 ± 0,5 °C) раствором следующего состава: 150 мМ NaCl; 5,4 мМ KCl; 1,8 мМ CaCl₂; 1,2 мМ MgCl₂; 10 мМ глюкозы; 10 мМ HEPES (pH 7,6). Для регистрации выбирали только клетки, испускавшие зеленое флуоресцентное свечение при облучении их возбуждающим светом с длиной волны 490 нм. Пэтч-пипетки сопротивлением 2–2,5 МОм изготовляли из боросиликатного стекла («Sutter», США) и заполняли раствором следующего состава: 140 мМ KCl; 1 мМ MgCl₂; 5 мМ EGTA; 4 мМ MgATP; 10 мМ HEPES; 0,03 мМ Na₂GTP (pH 7,2). Перед началом регистрации тока компенсировали емкость пипетки, емкость исследуемой клетки и сопротивление доступа, а также выключали как проходящий свет, так и свет с длиной волны 490 нм. При обработке данных амплитуды токов нормировали на емкость клетки и выражали в пА/пФ.

Для регистрации I₉₈ и I₃₄ использовали два различных протокола, позволяющих изучить соответственно зависимость плотности токов от интенсивности возбуждающего света и вольтамперную зависимость токов. В обоих протоколах использовали поддерживаемый потенциал –60 мВ. В первом протоколе устанавливали значение потенциала, равное 0 мВ, а затем включали свет 490 нм на 1 с; возникающий при этом выходящий ток являлся светоиндуцированным, поскольку ток утечки при потенциале 0 мВ отсутствует. Последовательно подавали свет интенсивностью 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 и 100% от максимально возможной для источника света CoolLED pE-100 («CoolLED», Великобритания). Абсолютные значения интенсивности света определяли с помощью датчика PM160T («Thorlabs», США). Во втором протоколе потенциал ступенчато изменяли от поддерживаемого потенциала до значений от –100 до +60 мВ с шагом 20 мВ на 2 с, при этом во время каждой из ступенек на 1 с включали свет 490 нм с интенсивностью 50% от максимума. Светоиндуцированный ток в этом случае вычисляли как разность между током в присутствии и при отсутствии возбуждающего света при каждом из значений мембранного потенциала. В обоих случаях измеряли как максимальное (пиковое) значение светоиндуцированного тока, так и уровень плато тока (среднее значение тока в интервале 500–1000 мс подачи света). Статистическую обработку результатов и построение графиков проводили с помощью программы GraphPad Prism 7. Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение CCR-транскриптов из зеленых микроводорослей Haematococcus и Bracteacoccus. Суммарную РНК Haematococcus и Bracteacoccus выделяли, как описано в разделе «Материалы и методы», после чего CCR-специфические транскрипты получали по методу быстрой амплификации концов кДНК (RACE). Процедуру RACE выполняли последовательно за 3 раунда ПЦР, согласно табл. 1.

 

Таблица 1. ПЦР-праймеры для амплификации кДНК CCR Haematococcus и Bracteacoccus

RACE, раунды		Ген-специфические праймеры
		Haematococcus	Bracteacoccus
RACE 5′	раунд 1	CCR_rev: CCCTTGGGMACDGTRTGGTA	34CCR-ORF_rev: ACCACAGTGTGCGCGACGA
	раунд 2	Hae-687_rev: GTTGGGTGGACTCATAGCCGCAG	34CCR1_rev: CCGTAGCACAAACCAATGCAGA
	раунд 3	98CCR1_rev: GGTGCGTTTGGAGTAGTCATCC	34CCR2_rev: CAAACCCGTCAGGTTGGACAAG
RACE 3′	раунд 1	CCR_fwd: YGGHTGGGARGAGRTBTACGT	34CCR1_fwd: CTTGTCCAACCTGACGGGTTTG
	раунд 2	Hae-536_fwd: GGAGTGGTTACTGTCATGCCCAGT	34CCR2_fwd: TCTGCATTGGTTTGTGCTACGG
	раунд 3	98CCR1_ fwd: GGATGACTACTCCAAACGCACC	34CCR3_fwd: TCGTCGCGCACACTGTGGT

 

В результате проделанной работы были получены полноразмерный транскрипт гена CCR H. lacustris NAMSU-BM-7/15 и 5′-концевой фрагмент транскрипта гена CCR B. aggregatus NAMSU-BM-5/15.

Транскрипт CCR Haematococcus не является продуктом ни одного из идентифицированных нами генов: 98CCR1 (GenBank: ON643073.1) и 98CCR1-1 (GenBank: ON643074.1), как предполагалось исходно, но впоследствии мы идентифицировали его как ген 98CCR2 (данные не приведены). Гомология между полученным транскриптом Hl98CCR2 (GenBank: PP103616) и геном 98CCR1 составляет 81,9%.

Нам не удалось получить полноразмерный транскрипт гена CCR Bracteacoccus NAMSU-BM-5/15, но определено, что 5′-концевой фрагмент транскрипта Ba34CCR (GenBank: PP103617) является продуктом ранее идентифицированного гена 34CCR (GenBank: ON643076.1). К настоящему времени транскрипт Ba34CCR целиком прокартирован по геномной последовательности; установлено, что соответствующий участок гена содержит 4 интрона.

Структурно-функциональные характеристики белковых продуктов Hl98CCR2, Ba34CCR и 3Д-моделирование. Для определения структурно-функциональных характеристик использовали построение гомологии путем выравнивания транслированных аминокислотных последовательностей нативных CCR-транскриптов, полученных методом гомологичного клонирования [9] либо идентифицированных при анализе транскриптомов [3, 10, 11].

На рис. 1 представлено выравнивание транслированных аминокислотных последовательностей продуктов генов CCR Haematococcus и их нативных транскриптов. Как показано на рис. 1, продукты Hl37CCR, Hl98CCR1, Hl98CCR2 и Hl98CCR1-1 содержат 7 мембранных спиралей и консервативные аминокислотные остатки, типичные для канальных родопсинов. Присутствуют участок связывания ретиналя Lys257, Glu (82, 83, 101 и 123), а также Glu90, определяющий специфичность родопсинов к переносу катионов [1, 6]. Также консервативными являются Glu235 и Ser245, участвующие в определении рН-зависимости спектральных характеристик CCR-белков. Как было показано Hou et al. [9] на CCR Mesostigma viride, замена Ser в положении 245 на Glu приводила к полной потере канальной активности. Ser321 является единственным сайтом фосфорилирования белка CrChR2, который располагается в консервативном участке цитозольной петли, примыкающей к трансмембранному домену ТМ7 (helix 7). Мы не смогли определить наличие сайта фосфорилирования у Hl98CCR2, поскольку 3′-конец транскрипта является низкогомологичным.

 

Рис. 1. Выравнивание транслированных аминокислотных последовательностей (CLUSTAL Omega) продуктов генов CCR Haematococcus и их нативных транскриптов. Hl37CCR, 94 а.о.; Hl98CCR1, 84 а.о.; Hl98CCR1-1, 97 а.о. – фрагменты генов CCR H. lacustris [7]; Hl98CCR2, 350 а.о. – нативный транскрипт гена 98CCR2; нативные транскрипты – HpChR1 H. pluvialis (lacustris), 677 а.о. (GenBank: JN596950, [9]); HpChR H. pluvialis (lacustris), 449 а.о. [11]; HNG2ChR Haematococcus sp. NG2, 350 а.о. [11]; HdChR H. droebakensis (GenBank: KF992059, 307 а.о. [10]); CrChR2 C. reinhardtii, 737 а.о. (GenBank: AF508966, [3]). Функционально значимые аминокислотные остатки (даны в нумерации CrChR2) выделены цветом: Glu (82, 83, 90, 97, 101 и 123) – красным; Glu235 и Ser245 – голубым; Lys257 – зеленым; Ser321 – желтым

 

Ближайшим гомологом продукта частичного транскрипта Ba34CCR B. aggregatus NAMSU-BM-5/15 является CrChR2 C. reinhardtii (59,2% идентичности при 73% покрытия последовательности). На рис. 2 представлено выравнивание транслированных аминокислотных последовательностей Ba34CCR и нативных CCR-транскриптов из разных видов Chlamydomonas. Транскрипт Ba34CCR кодирует целиком мембранный фрагмент ТМ1–ТМ7 со всеми консервативными аминокислотными остатками в наличии и уникальный Lys-обогащенный фрагмент, не имеющий гомологии.

 

Рис. 2. Выравнивание транслированных аминокислотных последовательностей (CLUSTAL Omega) продуктов нативных CCR-транскриптов Bracteacoccus и Chlamydomonas. Ba34CCR, 325 а.о. – частичный транскрипт гена 34CCR B. aggregatus NAMSU-BM-5/15; нативные транскрипты – CrChR2 C. reinhardtii, 737 а.о. (GenBank: AF508966, [3]); CaChR1 C. augustae, 715 а.о. (GenBank: JN596951, [9]); CraChR2 C. raudensis, 635 а.о. (GenBank: JN596949, [9]); CyChR1 C. yellowstonensis, 717 а.о. (GenBank: JN596948, [9]). Функционально значимые аминокислотные остатки (даны в нумерации CrChR2) выделены цветом: Glu (82, 83, 90, 97, 101 и 123) – красным; Glu235 и Ser245 – голубым; Lys257 – зеленым; Ser321 – желтым

 

Таким образом, на основании анализа первичной структуры продуктов нативных транскриптов Hl98CCR2 и Ba34CCR мы делаем вывод, что кодируемые белки содержат 7 консервативных мембранных участков (ТМ1–ТМ7), наряду с функционально значимыми аминокислотными остатками, характерными для канальных родопсинов. 3Д-Модели белков Hl98CCR2 и Ba34CCR также продемонстрировали типичную для канальных родопсинов пространственную структуру: трансмембранную локализацию фрагмента ТМ1–ТМ7 и формирование гомодимеров (рис. 3). Эти результаты позволяют идентифицировать белки Hl98CCR2 и Ba34CCR как канальные родопсины и указывают на их возможную функциональную активность.

 

Рис. 3. 3Д-Модели идентифицированных канальных родопсинов (SWISSMODEL) Ba34CCR (а) и Hl98CCR2 (б). В качестве матрицы взята 6eid.1.A, кристаллическая структура CrChR2 C. reinhardtii. N и C указывают локализацию концов полипептидной цепи. Цветовой код (от красного к синему) показывает уровень гомологии с матрицей

 

Определение функциональной активности канальных родопсинов Ba34CCR и Hl98CCR2. Эта задача была выполнена на экспериментальной базе, впервые предложенной Nagel et al. [12, 13]. Было показано, что при экспрессии в ооцитах Xenopus laevis или в животных клетках (HEK293, BHK) канальные родопсины C. reinhardtii функционируют как свето-зависимые катионные каналы. При этом не только полноразмерные белки, но и их ТМ1–ТМ7-фрагменты способны к фотоиндукции ионных токов, которые можно детектировать методом пэтч-кламп (patch-clamp). Таким образом, экспериментальная задача данного этапа заключалась в определении фотоэлектрической активности родопсинов Ba34CCR и Hl98CCR при гетерологичной экспрессии в клетках млекопитающих.

Гетерологичная экспрессия Ba34CCR и Hl98CCR2 в клетках культуры СНО-К1. Для экспрессии в клетках млекопитающих кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности кДНК Hl98CCR2 и Ba34CCR были субклонированы в экспрессионный вектор pcDNA3.1 eYFP, как описано в разделе «Материалы и методы». При этом анализируемые гены транскрибируются с высокоэффективного промотора цитомегаловируса P_CMV и транслируются в одной рамке с YFP в качестве флуоресцентного маркера. Полученные экспрессионные плазмиды pcDNA3.1 eYFP. Ba34CCR и pcDNA3.1 eYFP. Hl98CCR2 использовали для трансфекции иммортализованной линии эпителиальных клеток яичников китайского хомячка СНО-К1. Уровень экспрессии и внутриклеточную локализацию белковых конъюгатов Ba34CCR-YFP и Hl98CCR2-YFP в трансфицированных клетках определяли с помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии после обработки клеток специфическими красителями.

Результаты типичного эксперимента представлены на рис. 4. Сравнение собственного свечения YFP-конъюгатов Ba34CCR и Hl98CCR2 c окрашиванием клеток CellBrite Red однозначно определяет локализацию экспрессированных белков в цитоплазматической мембране. При этом уровень экспрессии полноразмерного белка Hl98CCR2 воспроизводимо наблюдался ниже уровня экспрессии мембранного фрагмента ТМ1–ТМ7 белка Ba34CCR.

 

Рис. 4. Исследование локализации экспрессированных родопсинов Ba34CCR и Hl98CCR2 в клетках СНО-К1 методом прижизненной конфокальной микроскопии: Ba34CCR-YFP (верхний ряд) и Hl98CCR2-YFP (нижний ряд). Клеточные мембраны окрашены CellBrite Red, ядра окрашены Hoechst 33342. Линейка – 10 мкм

 

Определение фотоэлектрической активности экспрессированных родопсинов Ba34CCR и Hl98CCR2. На рис. 5 показаны результаты экспериментов с клетками СНО-К1, трансфицированными плазмидами pcDNA3.1 eYFP. Ba34CCR и pcDNA3.1 eYFP. Hl98CCR2.

В клетках, экспрессирующих Hl98CCR2, включение света с длиной волны 490 нм при отсутствии проходящего света при мембранном потенциале –20 мВ не вызывало появление выраженного входящего или выходящего тока, I₉₈ (рис. 5, а), либо же этот ток находился на уровне шума. Поэтому исследования зависимости тока от интенсивности и мембранного потенциала провести не удалось.

 

Рис. 5. Характеристика токов, генерируемых белками Ba34CCR и Hl98CCR2 при экспрессии в клетках СНО-К1. а – Репрезентативный пример оригинальных записей тока через Hl98CCR2 (I₉₈), индуцированного включением света с длиной волны 490 нм, различной интенсивности при уровне потенциала –20 мВ. б – Репрезентативный пример оригинальных записей тока через Ba34CCR (I₃₄) различной интенсивности, индуцированного включением света с длиной волны 490 нм (интенсивность указана у пика каждой из кривых в процентах от максимальной и в абсолютных значениях мВт/мм²), при уровне потенциала –20 мВ. в – Зависимость пикового тока I₃₄ и тока плато I₃₄ от уровня интенсивности света 490 нм. г – Вольтамперные кривые пикового тока и стационарного тока (плато) I₃₄, индуцируемого светом 490 нм, при интенсивности 50% от максимума (6,25 мВт/мм²)

 

В клетках, экспрессирующих Ba34CCR, включение света с длиной волны 490 нм при отсутствии проходящего света при мембранном потенциале –20 мВ вызывало появление входящего тока, I₃₄ (рис. 5, б), который при значениях интенсивности света от 0,67 мВт/мм2 и выше имел выраженную пиковую компоненту, инактивирующуюся в течение 20–65 мс, и стационарную компоненту (плато). Среднее значение постоянной времени для инактивации пикового I₃₄ при потенциале –60 мВ составило 11,3 ± 0,78 мс (n = 14). Среднее значение деактивации тока плато I₃₄ при выключении света составило 25,5 ± 2,5 мс (n = 14). Наблюдаемая зависимость может быть объяснена десенситизацией каналов, образованных белком Ba34CCR.

Амплитуда пикового тока и тока плато I₃₄ имели позитивную зависимость от интенсивности света 490 нм вплоть до значения 2,8 мВт/мм2. При большем увеличении интенсивности света наблюдали снижение амплитуды пикового тока (рис. 5, б и в). При отрицательных значениях мембранного потенциала как пиковый ток, так и ток плато имеют входящее направление. При переходе через 0 мВ и положительных значениях мембранного потенциала направление тока меняется на выходящее (рис. 5, г). Таким образом, 0 мВ является реверсивным потенциалом для тока I₃₄ при экспериментальных условиях, указанных в разделе «Материалы и методы».

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

С расширением оптогенетических исследований существенно возрастает потребность в увеличении разнообразия функциональных характеристик канальных родопсинов для решения различных экспериментальных задач. Именно поэтому в поисках новых генов-кандидатов для оптогенетики исследователи по-прежнему обращаются к анализу микроводорослей Chlorophyta, огромной группы фототрофных организмов, отличающейся многообразием форм и сред обитания. По данным на 2021 год [6], при тестировании 56 генов CCR Chlorophyta (из 164 идентифицированных) функциональная активность была обнаружена у 40 генов; также появились первые данные об идентификации и функциональной активности генов анионных канальных родопсинов (ACR) у зеленых водорослей [11]. Мы посчитали актуальным проанализировать гены канальных родопсинов природных изолятов микроводорослей родов Haematococcus и Bracteacoccus из Беломорского бассейна и определить функциональную активность их белковых продуктов.

Ранее мы идентифицировали 2 негомологичных CCR-гена в микроводоросли H. lacustris NAMSU-BM-7/15 (98CCR1 и 98CCR1-1), однако при экспрессионном анализе был получен и охарактеризован полноразмерный транскрипт Hl98CCR2, не являющийся продуктом ни одного из вышеперечисленных генов. Таким образом, с помощью быстрой амплификации концов кДНК (RACE) при использовании вырожденных праймеров нам удалось обнаружить третий CCR-ген H. lacustris NAMSU-BM-7/15.

Поскольку на данный момент в базе данных GenBank депонированы уже 7 предсказанных CCR-генов H. lacustris, представлялось актуальным определить гомологи генов 98CCR1-1, 98CCR1 и 98CCR2, идентифицированных нами в штамме H. lacustris NAMSU-BM-7/15. По нашим данным, ген 98CCR1-1 картируется в единственном участке генома, содержащем ген (предположительно) канального родопсина (GenBank: GFH21497). Ген 98CCR1 проявляет одинаковую гомологию (85% идентичности при 95% покрытии последовательности) с двумя областями, содержащими гены канального опсина 1 (GenBank: GFH25618 и GFH12230). Ген 98CCR2 и, соответственно, транскрипт Hl98CCR2 картируются в обширной области 8 т.п.н. контига BLLF01000737, кодирующей ген канального опсина 1 (GenBank: GFH14526). Однако, что примечательно, открытая рамка считывания Hl98CCR2 не соответствует модельной сборке белка GFH14526. На основании этих результатов мы делаем вывод, что нативный транскрипт Hl98CCR2 является одним из вариантов альтернативного сплайсинга.

С учетом этого факта для сравнительного анализа белкового продукта транскрипта Hl98CCR2 мы использовали нативные CCR-транскрипты Haematococcus, идентифицированные в транскриптомах или полученные гомологичным клонированием (рис. 1). При этом обращает на себя внимание, что полноразмерный транскрипт Hl98CCR2 кодирует консервативный мембранный фрагмент ТМ1–ТМ7 с коротким Ser-обогащенным гидрофильным участком общим размером 350 а.о. В противоположность этому, все нативные CCR-транскрипты, а также 5 из 6 предсказанных полноразмерных CCR-генов H. lacustris кодируют гигантские белки размером ~700 а.о., включающие цитозольные последовательности. Примечательно, что идентифицированный нами Hl98CCR2 является продуктом единственного «короткого» предсказанного гена (GenBank: GFH14526). Остается невыясненным, почему доминирующий CCR-белок H. lacustris NAMSU-BM-7/15 содержит только мембранный фрагмент ТМ1–ТМ7, а также при каких условиях происходит экспрессия полноразмерных CCR-белков с регуляторными цитозольными участками [14]. Мембранный интегральный белок Hl98CCR2 содержит все функционально значимые аминокислотные остатки, характерные для CCR-белков, и образует димеры, однако не обнаруживает фотоэлектрической активности при гетерологичной экспрессии в животных клетках в стандартных условиях (рис. 5, а). Пока мы не исключаем, что у белка Hl98CCR2, возможно, иные параметры для генерации фототоков (спектр поглощения, рН), однако отметим, что у его ближайшего гомолога и единственного тестированного CCR-белка H. lacustris, HpChR1 (85% идентичности), фотоэлектрической активности также не наблюдалось [9]. Следует добавить, что из CCR-транскриптов Haematococcus только для транскрипта из Haematococcus droebakensis подтверждена функциональная активность его белкового продукта, HdChR [10].

Несомненный интерес представляет продукт гена 34CCR, Ba34CCR – первый идентифицированный канальный родопсин у микроводорослей рода Bracteacoccus. Нам удалось получить 5′-концевой фрагмент транскрипта CCR-гена B. aggregatus NAMSU-BM-5/15, который кодирует мембранный фрагмент ТМ1–ТМ7 и короткий Lys-обогащенный участок, не имеющий гомологии. Белок Ba34CCR демонстрирует невысокий уровень гомологии с канальными родопсинами Chlorophyta: ближайшим гомологом является CrChR2 C. reinhardtii (59% идентичности). По результатам 3Д-моделирования, белок Ba34CCR имеет трансмембранную локализацию и образует гомодимеры, что характерно для канальных родопсинов (рис. 3). Все известные CCR-транскрипты Chlamydomonas кодируют белки размером 650–750 а.о., содержащие цитозольный фрагмент наряду с мембранным ТМ1–ТМ7 [9]. Вероятно, полноразмерный продукт Ba34CCR также относится к этому классу белков.

При гетерологичной экспрессии ТМ1–ТМ7-фрагмента белка Ba34CCR (1–295 а.о.) в культуре клеток СНО-К1 наблюдается его эффективное накопление в цитоплазматической мембране (рис. 4). Мы также выполнили электрофизиологические эксперименты с использованием техники пэтч-кламп и показали, что в клетках, экспрессирующих Ba34CCR, происходит генерация тока (I₃₄) в ответ на включение света с длиной волны 490 нм (рис. 5, б–г).

Поскольку спектр действия родопсина Ba34CCR на данном этапе не изучен, полученные результаты мы рассматриваем как предварительные, и их сравнение с имеющимися детальными электрофизиологическими характеристиками канальных родопсинов CrChR1 и CrChR2 возможно лишь отчасти. Тем не менее очевидно, что светоиндуцируемый ток I₃₄ существенно ближе по своим свойствам к току, генерируемому CrChR2, по сравнению с током родопсина CrChR1. Как и ток CrChR2 [13], I₃₄ подвержен десенситизации (инактивации), то есть при постоянной подаче возбуждающего света он самопроизвольно ослабевает, выходя в течение нескольких десятков миллисекунд на стационарный уровень. Напротив, для тока, генерируемого CrChR1, десенситизация нехарактерна [12].

Данные, опубликованные в недавней работе Hososhima et al. [15], позволяют сравнить амплитуду и кинетические характеристики тока, генерируемого CrChR2, с I₃₄, учитывая, что данные по CrChR2 были получены с использованием гетерологической экспрессии в другой клеточной линии (ND7/23). Клетки, экспрессирующие CrChR2, при облучении светом с интенсивностью 2,7 мВт/мм² генерировали при поддерживаемом потенциале –60 мВ ток с пиковой плотностью 32 ± 3,2 пА/пФ, снижающийся до уровня плато 12 ± 1,1 пА/пФ [15]. В наших экспериментах свет практически такой же интенсивности (2,8 мВт/мм2) подавали при поддерживаемом потенциале –20 мВ, однако, учитывая известную вольтамперную зависимость I₃₄ (рис. 5, г), можно приблизительно оценить значение пикового I₃₄ при –60 мВ в 3,7 пА/пФ, а тока уровня плато – в 1,06 пА/пФ. Таким образом, CrChR2 способен генерировать приблизительно в 10 раз больший ток, чем Ba34CCR, при облучении светом одинаковой интенсивности с длиной волны 470 нм и 490 нм соответственно. С другой стороны, величина тока плато составляет приблизительно 37,5% от величины пикового тока в случае CrChR2 [15] и 35% – для I₃₄, то есть по этому параметру токи CrChR2 и Ba34CCR практически не различаются.

Кинетические характеристики I₃₄ сравнимы с характеристиками тока CrChR2. Постоянная времени деактивации тока плато, происходящей после выключения света 490 нм, для I₃₄ составила 25,5 ± 2,5 мс (n = 14), в то время как ток CrChR2, по данным Hososhima et al. [15], деактивируется в 2 раза быстрее (τ_off = 12,2 ± 0,69 мс). Инактивация пиковой компоненты I₃₄, напротив, происходит в несколько раз быстрее (τ = 11,3 ± 0,78 мс; n = 14), чем можно приблизительно оценить для тока CrChR2 (~63 мс).

Ток, генерируемый CrChR2, имеет потенциал реверсии ~0 мВ при ионном составе внешней среды, близком к использованному в нашем исследовании [13]. При этом если при потенциалах, близких к 0 мВ (от –40 до 40 мВ), вольтамперная зависимость этого тока близка к линейной, то при более сильной гиперполяризации зависимость входящего тока от потенциала становится близка к экспоненциальной. Точно такой же тип вольтамперной зависимости характерен и для I₃₄. В отличие от тока CrChR1, имеющего исключительно протонную природу, ток, генерируемый CrChR2, является смешанным катионным током, что обусловлено неизбирательной проницаемостью CrChR2 для различных катионов, в том числе бивалентных [13]. Именно этим обусловлен нулевой потенциал реверсии данного тока в стандартных физиологических условиях. Дальнейшие эксперименты с вариациями ионного состава внешнего и внутриклеточного раствора позволят выяснить, является ли ток I₃₄ также неселективным катионным током.

Вклад авторов. Е.С. Лобакова, О.В. Карпова, Д.В. Абрамочкин – концепция и руководство работой; Е.Н. Виноградова, О.В. Карпова, А.М. Мойсенович, О.Б. Пустовит, А.А. Рамонова – проведение экспериментов; Е.С. Лобакова, О.В. Карпова, Д.В. Абрамочкин – обсуждение результатов исследования; О.В. Карпова, Д.В. Абрамочкин – написание текста; Е.С. Лобакова, Д.В. Абрамочкин – редактирование текста статьи.

Финансирование. Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках соглашения № 075-15-2021-1396 от 26.10.2021 г. Работы по ДНК-секвенированию проведены в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт».

Благодарности. Авторы выражают благодарность Т.А. Федоренко (МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва) за предоставление культур и рекомендации по выращиванию, Центру старения МФТИ (г. Долгопрудный) за предоставленный экспрессионный вектор pcDNA3.1 eYFP, а также Е.Г. Максимову (МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва) за предоставленный измеритель интенсивности излучения. В работе использовали оборудование, приобретенное в рамках «Программы развития Московского университета до 2020 года», и оборудование ЦКП МГУ имени М.В. Ломоносова.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

作者简介

O. Karpova

Lomonosov Moscow State University

编辑信件的主要联系方式.
Email: olgakarpova@ymail.com

Biology Department

俄罗斯联邦, 119991 Moscow

E. Vinogradova

Lomonosov Moscow State University; National Research Center “Kurtchatov Institute”

Email: olgakarpova@ymail.com

Biology Department; Genome Center

俄罗斯联邦, 119991 Moscow; 123182 Moscow

A. Moisenovich

Lomonosov Moscow State University

Email: olgakarpova@ymail.com

Biology Department

俄罗斯联邦, 119991 Moscow

O. Pustovit

Lomonosov Moscow State University

Email: olgakarpova@ymail.com

Biology Department

俄罗斯联邦, 119991 Moscow

А. Ramonova

Lomonosov Moscow State University

Email: olgakarpova@ymail.com

Biology Department

俄罗斯联邦, 119991 Moscow

D. Abramochkin

Lomonosov Moscow State University

Email: olgakarpova@ymail.com

Biology Department

俄罗斯联邦, 119991 Moscow

E. Lobakova

Lomonosov Moscow State University

Email: olgakarpova@ymail.com

Biology Department

俄罗斯联邦, 119991 Moscow

参考

补充文件