Extending linker sequences between antigen-recognition modules provides more effective production of bispecific nanoantibodies in the periplasma of E. coli

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The use of technology for the production of single-domain antibodies (NANOBODY® molecules, also referred to as nanoantibodies, nAb, or molecules based on other stable protein structures) and their derivatives to solve current problems in biomedicine is becoming increasingly popular. Indeed, the format of one small, highly soluble protein with a stable structure, fully functional in terms of specific recognition, is very convenient as a module for creating multivalent, bi-/oligo-specific genetically engineered targeting molecules and structures. The production of nAb in the periplasm of the E. coli bacterium is a very convenient and fairly universal way to obtain analytical quantities of nAb for the initial study of the properties of these molecules and the selection of the most promising nAb options. The situation is more complicated with the production of bi- and multivalent derivatives of initially selected nAbs under the same conditions. In this work, extended linker sequences (52 and 86 aa) between antigen-recognition modules in cloned expression constructs were developed and applied in order to increase the efficiency of production of bispecific nanoantibodies (bsNB) in the periplasm of E. coli bacteria. Three variants of model bsNBs described in this study were produced in the periplasm of bacteria and isolated in soluble form with preservation of the functionality of all protein domains. If earlier our attempts to produce bsNB in the periplasm with traditional linkers no longer than 30 aa were unsuccessful, the extended linkers used here provided a significantly more efficient production of bsNB, comparable in efficiency to the traditional production of the original monomeric nAbs. The use of highly elongated linkers can presumably be useful for increasing the efficiency of production of other bsNBs and similar molecules in the periplasm of E. coli bacteria.

Full Text

Принятые сокращения: бсНТ – биспецифичное наноантитело; нАТ – наноантитело; ILZ – тримеризующийся домен, «изолейциновая молния»; PBS – стандартный фосфатно-солевой буферный раствор.

Введение

Новые лекарства и инструменты на основе моноклональных антител и их производных произвели революцию в биомедицине и иммунобиотехнологии. В последние годы, в дополнение к классическим моноклональным антителам, многими исследователями уделяется всё большее внимание инженерии рекомбинантных фрагментов антител, а также других антиген-связывающих молекул. Сегодня одной из самых перспективных технологий для создания таргетных генно-инженерных молекул, мультивалентных и би-/олигоспецифических структур является технология получения рекомбинантных производных однодоменных антиген-связывающих фрагментов (VHH) особых антител (HCAb, Heavy-Chain only antibodies), представляющих собой гомодимер укороченной тяжёлой цепи при полном отсутствии лёгких цепей. Такие особые антитела присутствуют в норме в крови представителей семейства Camelidae и у некоторых видов хрящевых рыб в дополнение к классическим типам иммуноглобулинов [1, 2]. Верблюдовые естественным образом производят антитела, в которых модуль распознавания мишени состоит из одного вариабельного домена (VHH), рекомбинантную версию которого также обозначают как однодоменное антитело, наноантитело (нАТ) или молекула НАНОТЕЛО® (NANOBODY® и NANOBODIES® являются зарегистрированными товарными знаками «Ablynx NV», дочерней компании «Sanofi», поэтому далее в статье мы не будем использовать эти названия). Основными особенностями нАТ являются небольшие размеры (в 10 раз меньше классического антитела), высокая растворимость, стабильность (в широком диапазоне температур и рН), способность узнавать необычные, скрытые для классических антител эпитопы, возможность использования очень эффективного метода фагового дисплея для селекции оптимальных вариантов нАТ, а также простота осуществления всевозможных модификаций методами генной инженерии. нАТ могут быть соединены с Fc-доменами, другими нАТ, пептидными метками или токсинами и химически конъюгированы с лекарствами, радионуклидами, фотосенсибилизаторами и наночастицами [3–5]. Разработаны эффективные методы генно-инженерной модификации (форматирования) исходно отбираемых моновалентных нАТ с целью их адаптации для конкретного использования. Создаваемые на их основе более сложные производные молекулы, мультивалентные, биспецифичные и иные конструкции могут приобретать заметно более высокую специфичность и эффективность связывания, существенно более высокую биологическую активность. На основе форматированных нАТ могут быть разработаны новые биологические инструменты и материалы с улучшенными свойствами, например, для борьбы с вирусными или иными инфекциями [6–10]. Несмотря на уже многочисленные примеры создания и применения биспецифичных нАТ (бсНТ) [11–14], в том числе и в бактериальных системах экспрессии [15–17], в настоящее время пока не создано достаточно универсального способа их быстрого получения в растворимом и функциональном виде для предварительного тестирования и отбора наиболее перспективных вариантов. Исследователи уделяют внимание способам индукции синтеза белка, подходящим штаммам клеток, особым плазмидным векторам. В большинстве недавних работ [11, 13], в том числе рассмотренных в обзорах [15–17], бсНТ получали в клеточном лизате бактерий, однако при таких условиях бсНТ могут денатурировать и образовывать нежелательные связи с другими (загрязняющими) белками. При этом описано крайне мало подходов по получению бсНТ с достаточно хорошим выходом в условиях, приближённых к физиологическим. Одним из эффективных вариантов может быть выделение таких нАТ из периплазмы бактерий, где, в отличие от цитозоля, правильно формируются цистеиновые связи, стабилизирующие иммуноглобулиновую структуру [18].

Особое внимание при конструировании экспрессионных конструкций с двумя и более вариабельными антиген-узнающими доменами антител уделяется линкерным последовательностям (линкерам) между этими доменами. Показано, что как длина, так и состав линкеров могут влиять на эффективность наработки, стабильность и биологическую активность как генно-инженерного одноцепочечного антитела [19, 20], так и бсНТ [21]. Наиболее подробная информация о разработке линкеров между антиген-узнающими модулями при создании бсНТ приведена в обширном патенте на эту тему [22] от главного в мире разработчика технологии нАТ и биомедицинских продуктов на её основе – бельгийской компании «Ablynx NV», которая недавно стала частью глобальной фармкомпании «Sanofi». Авторы патента перечисляют с указанием ссылок большое число линкеров, которые были описаны и использовались до 2014 года включительно. В патенте длины рассматриваемых возможных линкеров варьируют от 1 до 50 аминокислотных остатков (а.о.).

Следует отметить, что наработка би- и мультивалентных производных нАТ в периплазме бактерий часто является сложной задачей. В частности, в нашей лаборатории накоплен значительный опыт по наработке в периплазме бактерий разнообразных моновалентных нАТ, однако наши первоначальные эксперименты по созданию и наработке в периплазме бактерий биспецифичных и многовалентных нАТ выявили ненадёжность (нестабильность конструкций, высокая мутабельность, очень низкая эффективность наработки и выделения растворимых нАТ) использования для этой цели наиболее популярного сегодня метода клонирования двух копий VHH, разделённых традиционной линкерной последовательностью, такой как (GGGGS)3, или линкером длиной 28 а.о., созданным на базе шарнирного участка неканонического антитела Верблюдовых [8].

Целью данного исследования была проверка предположения о возможности повысить эффективность наработки бсНТ путём существенного удлинения линкера, создаваемого на основе комбинации более коротких линкерных последовательностей, использованных нами ранее. Основными задачами данной работы были: 1) создание новых конструкций для экспрессии бсНТ с двумя вариантами удлинённых линкеров на основе ранее проклонированных последовательностей моновалентных нАТ, 2) использование полученных конструкций для проверки эффективности наработки бсНТ в периплазме бактерий и их выделения в растворимом виде, 3) анализ функциональности антиген-связывающих модулей выделенных бсНТ.

Материалы и методы

Молекулярное клонирование экспрессионных конструкций для наработки бсНТ в периплазме E. coli. Клонирование конструкций, схематично отображённых на рис. 1, проводили, используя компетентные клетки E. coli XL-1 Blue («Евроген», Россия), на основе полученных ранее вариантов нАТ [8, 23–25], уже содержащих на конце последовательности форматированного нАТ левую N-концевую часть указанных линкеров (шарнирный участок длиной 28 а.о. закрашен серым цветом на рис. 1; также использовали клоны, в которых дополнительно за шарнирным участком следует ILZ – тримеризующийся домен, «изолейциновая молния») в фагмидном векторе pHEN6 [26], имеющем в составе ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Проводили ПЦР-клонирование из нескольких этапов, используя пары заказанных олигонуклеотидов (таблица), реакции рестрикции и лигирования, подобно тому, что описано ранее [8]. Финальные биспецифичные конструкции были встроены в фагмидный вектор pHEN6 по сайтам NcoI и EcoRI. Эти конструкции состоят из четырёх принципиальных фрагментов (рис. 1): NcoI – BamHI (VHH1 и N-конец линкера), BamHI – SalI (C-конец линкера, PGGGGSGGGGSGGGGLE), SalI – NotI (VHH2) и NotI – EcoRI (HA-таг, His-таг). Эти фрагменты получали рестрикцией ПЦР-продуктов, синтезируемых с помощью следующих пар праймеров: NcoI-VHH-fd и BamHI-rev (в качестве матрицы использовали ранее полученные клоны нАТ); BamHI-fd и SalI-rev (без ДНК-матрицы); SalI-fd и NotI-rev (клоны нАТ); NotI-fd и EcoRI-rev (клоны нАТ). Правильность промежуточных конструкций подтверждали с помощью ПЦР и проверки длины получаемых продуктов, финальные конструкции после завершения клонирования подтверждали секвенированием. Полная информация о последовательностях полученных конструкций содержится в нашей патентной заявке [27].

 

Рис. 1. Схема используемой экспрессионной конструкции для синтеза бсНТ и последовательности линкеров, разделяющих последовательности, кодирующие нАТ. Слева направо в конструкции обозначены: лактозный промоторный участок (Plac/operator); участок связывания с рибосомой (RBS); начало трансляции (стрелка); сигнальный пептид для периплазматической локализации (pelB); последовательности, кодирующие нАТ (VHH1 и VHH2), разделённые линкерной последовательностью (аминокислотные последовательности использованных линкеров указаны в нижней части рисунка); последовательности HA-тага (YPYDVPDYA) и шесть остатков гистидина на самом конце. ILZ – тримеризующийся домен, «изолейциновая молния»

 

Праймеры для ПЦР-клонирования

Название

Последовательность (5′–3′)

NcoI-VHH-fd

CGAGCCGACCATGGCCCTGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

BamHI-rev (для линкера 1)

АССТGGATCCCTCGAGCCGCTTTCTGGTTCAGG

BamHI-rev (для линкера 2)

АССТGGATCCCTCGAGCCGCTACGTTCACCCAC

BamHI-fd

CGAGGGATCCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCA

Sal-rev

ATGTCCGTCGACTCTAGACCGCCACCGCCGCTGCCACCT

SalI-fd

GCGGTCGACGGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGT

NotI-rev

GGACTAGTGCGGCCGCTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT

NotI-fd

GCGAGCGGCCGCTACCCGTACGAC

EcoRI-rev

GCGGAATTCTATTAGCCGGAAGCGTAGTC

 

Наработка и очистка бсНТ. Экспрессию нАТ и получение периплазматического экстракта проводили по описанному ранее протоколу [28] с небольшими модификациями. Ночную культуру бактерий E. coli XL1 Blue, содержащих плазмидную ДНК c экспрессионной конструкцией, получали из свежевыращенной одиночной колонии на чашке Петри с LB-агаром, содержащим 1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина после инкубации в 5 мл LB-среды с 0,2% глюкозы и 70 мкг/мл ампициллина в течение ночи на шейкере-инкубаторе Excella C24R («New Brunswick Scientific», США) при 180 об./мин и 37 °С. Ночную культуру разводили в 50–100 раз в 300 мл среды 2хYT, содержащей 0,2% глюкозы. Бактерии культивировали в течение 30 мин при 180 об./мин и 37 °С, после чего добавляли ампициллин до 70 мкг/мл и продолжали инкубацию. При достижении культурой бактерий оптической плотности 0,6 при длине волны 600 нм добавляли 0,5 мМ раствора изопропил-бета-D-галактопиранозида (ИПТГ), температуру инкубации понижали до 28–30 °С и инкубировали клетки в течение 5 часов. Клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 3000 g. Далее проводили процедуру осмотического шока для выделения периплазматического экстракта. Клеточный осадок суспендировали в буфере, содержащем сахарозу (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 мМ ЭДТА, 20%-ная сахароза, 10 мМ имидазол, свежедобавленный 1 мМ PMSF), и оставляли в ледяной бане на 30 мин. Затем добавляли водный забуференный раствор (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ MgCl2), тщательно и быстро перемешивали, после чего оставляли суспензию клеток в ледяной бане ещё на 30 мин, затем клетки центрифугировали 20 мин при 16 000 g. Отбирали супернатант, содержащий периплазматический экстракт, и добавляли NaCl до конечной концентрации 0,3 M. В случае выделения периплазматического экстракта, содержащего тримеризующееся бсНТ, принципиально было использовать дополнительные модификации процедуры, включающие разрушение клеточной стенки путём добавления 5 мг/мл лизоцима в раствор, содержащий сахарозу, и добавление 20 мМ имидазола в последующий водный раствор.

Очистку целевого белка проводили с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии на Ni2+-NTA-агарозе, используя гель HIS-Select Niсkel Affinity Gel («Sigma-Aldrich», США). Данная очистка возможна благодаря наличию на С-конце форматированного нАТ шести гистидиновых остатков (His-таг). Очистку проводили согласно протоколу производителя. Объём колонки подбирали в зависимости от объёма исходной культуры и получаемого периплазматического экстракта, в среднем колонку объёмом 0,5 мл использовали для очистки нАТ, выделяемого из 300 мл культуры. Колонку уравновешивали «лизирующим» буфером (50 мМ NaH2PO4, pH 8,0, 0,3 М NaCl, 10 мМ имидазол). При очистке предположительно тримеризующихся бсАТ количество имидазола в буфере увеличивали до 20 мМ. Периплазматический экстракт добавляли в колонку и проводили сорбцию белка «batch»-методом, перемешивая экстракт и агарозу на мини-ротаторе Bio RS-24 («Biosan», Латвия) в течение 30–40 мин. Затем колонку переводили в вертикальное положение, давали осесть Ni2+-NTA-агарозе и пропускали через неё экстракт. После этого колонку промывали в три этапа лизирующим буфером суммарным объёмом, равным 10 объёмам колонки. Элюцию белка проводили дробно, путём трёхкратного добавления одного объёма колонки элюирущего буфера (50 мМ NaH2PO4, pH 8,0, 0,3 М NaCl, 250 мМ имидазол). Таким образом, с одной колонки объёмом 0,5 мл получали элюат объёмом 1,5 мл.

Электрофорез белков. Качество и количество нАТ, содержащегося в полученном элюате, определяли при помощи анализа аликвот очищенных нАТ методом электрофореза в 5–19%-ном градиентном SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) в восстанавливающих условиях по Лэммли [29]. Использовали прибор MiniProtean II («Bio-Rad», США), источник питания – Эльф-4 («ДНК-Технология», Россия). В качестве восстанавливающего агента использовали ДТТ (дитиотреитол). Перед нанесением к образцам добавляли буфер (31,25 мМ Tris-HCl, pH 6,8; 12,5%-ный глицерин; 1%-ный SDS; 0,005%-ный бромфеноловый синий), пробы прогревали 10 мин при 97 °С. Электрофорез проводили в стандартном SDS-буфере (0,2 М глицин, 0,025 М Tris, 0,1%-ный SDS). Контроль разделения молекул проводили с использованием белкового маркера Precision Plus Protein Standards (161-0363, «Bio-Rad»). Примерное количество нАТ в соответствующей полосе на окрашенном геле оценивали относительно интенсивности полос маркера (так, в 5 мкл маркера интенсивность полосы 50 кДа соответствует примерно 375 нг, а полосы 20 кДа – 75 нг белка).

Иммуноферментный анализ для проверки функциональности обоих модулей нАТ в составе получаемого двухмодульного бсНТ. Использовали следующие антигены: рекомбинантный ICAM-1 человека («R&D Systems», США), рекомбинантный аллерген пыльцы берёзы Bet v 1 («Biomay AG», Австрия), рекомбинантный гемагглютинин (HA-H5) вируса гриппа H5N2 («Sino Biotechnological Inc.», Китай) и очищенный IgA человека («Имтек», Россия). Раствор антигена в концентрации 2 мкг/мл в стандартном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS: 137 мM NaCl, 2,7 мM KCl, 10 мM Na2HPO4, 2 мM KH2PO4, pH 7,4) использовали для иммобилизации антигена в течение ночи при +4 °C в лунках 96-луночного планшета с плоским дном (MaxiSorp, «Nunс», Дания). Контрольные лунки не содержали антиген, а далее обрабатывались параллельно с остальными экспериментальными лунками. Лунки промывали PBS трижды, затем блокировали в 1%-ном БСА в PBS в течение часа, снова промывали дважды PBS. Проверяемые нАТ наносили в разных концентрациях, преимущественно в диапазоне 0,4–1 мкг/мл, в 0,1%-ном БСА в 1× PBS, и инкубировали в течение 1 часа при эпизодическом перемешивании. Лунки тщательно промывали (5 раз в PBS) и добавляли вторичные мышиные анти-HA-таг-антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена («Sigma-Aldrich»), разведённые 1 : 2000 в 0,1%-ном БСА/PBS. Через 1 час лунки снова тщательно промывали и затем добавляли индикаторную смесь 1-Step Ultra TMB («Thermo Fisher Scientific», США). Для остановки реакции использовали 2 М серную кислоту. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на планшетном фотометре. Данные получали в трёх повторах.

Результаты и обсуждение

В нашей лаборатории уже много лет ведутся исследования, связанные с получением новых однодоменных антител (нАТ) для широкого спектра антигенов-мишеней, направленные на решение актуальных задач биомедицины. В настоящее время для ряда текущих проектов лаборатории очень актуальной задачей является создание бсНТ на базе получаемых или уже полученных ранее нАТ. Для этого предпочтительна бактериальная система экспрессии (E. coli), так как именно в периплазме бактерий мы рутинно нарабатываем нАТ и их производные. Ранее в нашей лаборатории уже проводили эксперименты по наработке в одной рамке считывания сразу двух нАТ, кодирующие последовательности которых разделены линкером. Однако при этом выявлялись проблемы нестабильности получаемых конструкций в бактериях (необычно высокий мутагенез выявляли путём секвенирования и ПЦР-анализа разных получаемых клонов) и очень низкого выхода рекомбинантного белка с двумя модулями нАТ (ниже уровня фоновых бактериальных белков). Эти проблемы были как при использовании традиционного линкера (Gly4-Ser)×3, так и линкера на основе длинного шарнирного участка особых антител верблюдов, состоящего из 28 аминокислотных остатков (а.о.). В данной работе был учтён прежний опыт и предпринята попытка использовать ещё более удлинённый комбинированный линкер между последовательностями, кодирующими нАТ. На рис. 1 приведена схема используемой в данной работе экспрессионной конструкции на основе плазмидного вектора pHEN6 [26] для индуцируемой экспрессии бсНТ в периплазме E. coli, а также представлены два варианта разработанных линкеров (мы не нашли в публикациях других авторов упоминания об использовании столь удлинённых линкеров).

Линкер 1 (длиной 52 а.о.) состоит из длинного шарнирного участка особых антител верблюда (28 а.о.), соединённого с традиционным линкером Gly4-Ser-Gly4-Ser-Gly4 (как в фагмиде pIT2) с несколькими дополнительными а.о., а в линкере 2 (длиной 86 а.о.) между двумя указанными частями линкера 1 встроена дополнительная последовательность рекомбинантного домена ILZ [8]. Ранее было показано, что нАТ, к которым был добавлен ILZ-домен, действительно эффективно тримеризуются в периплазме бактерии сразу после их синтеза [8].

В данном коротком сообщении приведены примеры и первичные характеристики первых бсНТ, полученных с использованием двух указанных вариантов линкеров.

Получение и анализ бсНТ с линкером 1. В совместной работе с австрийскими партнёрами нам недавно удалось получить нАТ (aBet) к основному аллергену пыльцы берёзы (Bet v 1) [24], а также нАТ (aICAM1) к мажорному поверхностному рецепторному белку эпителия ICAM1 [23]. Одной из дальнейших целей этой работы было получение бсНТ, связывающихся с ICAM1 на поверхности клеток эпителия верхних дыхательных путей человека и способных после этого также связывать поступающий из внешней среды пыльцевой аллерген, блокируя его и тем самым препятствуя аллергической реакции. В данной работе мы получили два варианта бсНТ, содержащего оба этих нАТ, aBet-л1-aICAM1 и aICAM1-л1-aBet, но идущих в разной последовательности. Любопытно, что первый вариант бсНТ воспроизводимо (в трёх независимых повторах) заметно лучше нарабатывался параллельно в тех же условиях по сравнению со вторым вариантом (дорожки 3 и 4 соответственно на рис. 2, а). Уровень наработки для бсНТ aBet-л1-aICAM1 был вполне сравним со средним уровнем наработки исходных одномодульных нАТ (примерно 2 мг из 1 л культуры). Выявляемые бсНТ двигались при электрофорезе в полном соответствии с ожидаемым размером 36 кДа. В концентрации 0,4 мкг/мл оба бсНТ специфически узнавали каждый из иммобилизованных антигенов, как Bet v 1, так и ICAM1 (рис. 2, б). Таким образом, эти предварительные данные указывают на то, что в периплазме бактерии вполне возможно наработать в растворимом и активном виде заданные бсНТ. При этом порядок следования последовательностей нАТ в конструкции может иметь значение для уровня наработки.

 

Рис. 2. SDS-PAGE и иммуноферментный анализ бсНТ aBet-л1-aICAM1 и aICAM1-л1-aBet. а – Электрофоретическое разделение в 5–19%-ном градиентном SDS-полиакриламидном геле белков периплазматических экстрактов (1, 2) и аффинно очищенных нАТ (3, 4). Стрелкой показано положение бсНТ. В крайней левой дорожке нанесён маркер (М) и указаны (в кДа) размеры маркерных полос. б – Иммуноанализ связывания полученных бсНТ в концентрации 0,4 мкг/мл с иммобилизованными рекомбинантными антигенами. Представлены усреднённые данные трёх измерений с указанием области разброса данных

 

Получение и анализ бсНТ с линкером 2. В другом нашем актуальном проекте поставлена задача разработки средства для блокировки/задержки патогенных респираторных вирусов в верхних дыхательных путях человека на основе бсНТ. Для этого мы получили и продолжаем получать как нАТ, специфически связывающие консервативные поверхностные эпитопы актуальных патогенных вирусов (в первую очередь вирусов гриппа и коронавирусов), так и нАТ к мажорным компонентам слизи или, в частности, к мажорному иммуноглобулину (IgA) слизистых тканей. Связываясь с вирусной частицей, молекулы IgA вызывают опсонизацию патогена и дают иммунной системе сигнал для его уничтожения. Ранее было показано, что для связывания и блокирования вируса предпочтительно использовать тримеризованное нАТ [8]. С целью исследования того, как влияет на наработку бсНТ добавление в состав линкера тримеризующегося домена (ILZ), в данной работе был проверен второй вариант линкера (линкер 2, рис. 1). На этот раз использовались два других, полученных ранее нАТ. Одно, aHN13, связывает гемагглютинин (HA) вируса птичьего гриппа (H5N2) [8], а другое, E7, связывает IgA человека [25]. Ожидаемый размер мономерной версии данного бсНТ составляет примерно 39 кДа, что хорошо соответствует подвижности белка, выявляемого при электрофорезе в восстанавливающих условиях (рис. 3, а), при которых предполагаемый формирующийся тример распадается на мономеры.

 

Рис. 3. SDS-PAGE и иммуноферментный анализ бсНТ aHA-л2-E7(aIgA), также обозначаемого (HN-E7)x3. а – Электрофоретическое разделение в 5–19%-ном градиентном SDS-полиакриламидном геле аффинно очищенного бсНТ, исходного (1), проскока на фильтре с номинальным отсечением по молекулярной массе 100 кДа (2), очищенного от мелких примесей и, предположительно, тримеризованного бсНТ (3), задержанного над фильтром с отсечением по молекулярной массе 100 кДа. Стрелкой показано положение мономерного бсНТ. В крайней правой дорожке нанесён маркер (М) и указаны (в кДа) размеры маркерных полос. б – Иммуноанализ связывания полученных бсНТ (HN-E7)x3, а также контрольных моновалентных нАТ (E7 – против IgA и HN13 – против гемагглютинина HA-H5 вируса птичьего гриппа) в концентрации 1 мкг/мл с иммобилизованными рекомбинантными антигенами (IgA и HA-H5). Контрольные лунки были без антигена (столбцы «без АГ»). Представлены усреднённые данные трёх измерений с указанием области разброса данных

 

В случае тримеризации размер нАТ должен увеличиться до примерно 117 кДа. В данном коротком сообщении мы пока не ставили задачу тщательно исследовать именно тримеризацию получаемого нАТ, но в качестве косвенного указания на тримеризацию нарабатываемого белка можно привести два факта. Первый: при ультрафильтрации, в процессе которой используется центрифужный концентратор с номинальным отсечением по молекулярной массе 100 кДа (Vivaspin Turbo 4, «Sartorius», Германия), данное нАТ ведёт себя как высокомолекулярный белок и практически полностью концентрируется над фильтром, тогда как другие белковые молекулы, загрязняющие исходный препарат нАТ и имеющие размер (на электрофореграмме) вплоть до 75 кДа, заметно уходят в проскок, в отличие от нАТ, движущегося при денатурирующем электрофорезе как мономерный белок размером 39 кДа. Другое указание – затруднённое выделение этого нАТ в составе периплазматического экстракта. Исходя из предположения о его трёхмерной структуре, были специально подобраны условия для более эффективного извлечения этого нАТ из периплазмы бактерий. Мы добавили процедуру разрушения клеточной стенки лизоцимом и повысили ионную силу элюирующего раствора (подробнее – в описании методов). Уровень наработки для нАТ aHA-л2-E7 при использовании модифицированных условий выделения был также сравним со средним уровнем наработки исходных одномодульных нАТ (примерно 1 мг из 1 л культуры). Полученное нАТ обладало необходимой функциональностью и узнавало оба белка-мишени в иммуноферментном анализе (рис. 3, б). Взятые в качестве позитивных контролей мономерные нАТ, anti-IgA (Е7) [25] и нАТ против гемагглютинина HA-H5 вируса птичьего гриппа (HN13) [8] при связывании давали несколько более сильный сигнал. Это может отражать двукратный молярный избыток этих моноспецифических нАТ по сравнению с половинной долей E7 и HN13 в бсНТ (при одинаковой концентрации всех трёх вариантов нАТ), а также может указывать на возможные стерические ограничения при использовании в этом анализе предположительно тримеризованного нАТ. Заметим, что для сравнения данное бсНТ также нарабатывали с линкером 1 (аНА-л1-Е7), без тримеризующегося домена. Выход бсНТ был в этом случае в 2 раза выше. При использовании более коротких традиционных линкеров все три варианта описанных бсНТ вообще не удавалось наработать в детектируемых количествах.

Таким образом, мы продемонстрировали, что нарабатываемые бсНТ содержат все заданные домены в функциональном состоянии: они выделяются из периплазмы, при выделении с помощью аффинной металл-хелатной хроматографии работает His-таг, оба антиген-распознающих модуля нАТ и НА-таг функциональны в иммуноанализе. Удлинённые линкерные последовательности, по-видимому, способствуют ослаблению нежелательных взаимодействий (потенциальных рекомбинаций) между консервативными каркасными GC-богатыми участками в следующих друг за другом VHH-последовательностях в случае гетерологичной бактериальной системы экспрессии, что выражается в стабильности конструкций (продуцентов) и в повышении уровня наработки этих бсНТ. Мы полагаем, что в нашей работе впервые рассматриваются столь удлинённые линкеры для решения задачи повышения эффективности наработки бсНТ в периплазме. Полученные результаты определённо наполняют оптимизмом наши планы по дальнейшему использованию подобных форматов производных нАТ для самого широкого круга актуальных задач биомедицины.

Подана патентная заявка на изобретение для защиты приоритета описанных в данной статье разработок [27].

Вклад авторов. Тиллиб С.В. – концепция и руководство работой, проведение клонирования, а позже – функциональная проверка нАТ в иммуноферментном анализе; Горяйнова О.С., Тиллиб С.В. – эксперименты по наработке и выделению нАТ; Тиллиб С.В., Горяйнова О.С. – написание статьи.

Финансирование. Работа была поддержана Министерством науки и высшего образования Российской федерации (договор № 075-15-2021-1086, контракт № RF–193021X0015).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

×

About the authors

S. V. Tillib

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: tillib@genebiology.ru
Russian Federation, 119334, Moscow; 119991, Moscow

O. S. Goryainova

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences

Email: tillib@genebiology.ru
Russian Federation, 119334, Moscow; 119991, Moscow

References

  1. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, E. B, Bendahman, N., and Hamers, R. (1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 363, 446-448, https://doi.org/ 10.1038/363446a0.
  2. Flajnik, M. F., and Kasahara, M. (2010) Origin and evolution of the adaptive immune system: genetic events and selective pressures, Nat. Rev. Genet., 11, 47-59, https://doi.org/10.1038/nrg2703.
  3. Bannas, P., Hambach, J., and Koch-Nolte, F. (2017) Nanobodies and nanobody-based human heavy chain antibodies as antitumor therapeutics, Front Immunol., 8, 1603, https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01603.
  4. Jovčevska, I., and Muyldermans, S. (2020) The Therapeutic Potential of Nanobodies, BioDrugs, 34, 11-26, https:// doi.org/10.1007/s40259-019-00392-z.
  5. Тиллиб С. В. (2020) Перспективы использования однодоменных антител в биомедицине, Мол. Биол., 54, 362-373, https://doi.org/10.31857/S0026898420030167.
  6. Stone, E., Hirama, T., Tanha, J., Tong-Sevinc, H., Li, S., MacKenzie, C. R., and Zhang, J. (2007) The assembly of single domain antibodies into bispecific decavalent molecules, J. Immunol Methods, 318, 88-94, https://doi.org/10.1016/ j.jim.2006.10.006.
  7. Hultberg, A., Temperton, N. J., Rosseels, V., Koenders, M., Gonzalez-Pajuelo, M., Schepens, B., Ibañez, L. I, Vanlandschoot, P., Schillemans, J., Saunders, M., Weiss, R. A., Saelens, X., Melero, J. A., Verrips, C. T., Van Gucht, S., and de Haard, H. J. (2011) Llama-derived single domain antibodies to build multivalent, superpotent and broadened neutralizing anti-viral molecules, PLoS One, 6, e17665, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017665.
  8. Tillib, S., Ivanova, T. I., Vasilev, L. A., Rutovskaya, M. V., Saakyan, S. A., Gribova, I. Y., Tutykhina, I. L., Sedova, E. S., Lysenko, A. A., Shmarov, M. M., Logunov, D. Y., Naroditsky, B. S., and Gintsburg, A. L. (2013) Formatted single-domain antibodies can protect mice against infection with influenza virus (H5N2), Antiviral Res., 97, 245-254, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2012.12.014.
  9. Huet, H. A., Growney, J. D., Johnson, J. A., Li, J., Bilic, S., Ostrom, L., Zafari, M., Kowal, C., Yang, G., Royo, A., et al. (2014) Multivalent nanobodies targeting death receptor 5 elicit superior tumor cell killing through efficient caspase induction, mAbs, 6, 1560-1570, https://doi.org/10.4161/19420862.2014.975099.
  10. Laursen, N. S., Friesen, R. H. E., Zhu, X., Jongeneelen, M., Blokland, S., Vermond, J., van Eijgen, A., Tang, C., et al. (2018) Universal protection against influenza infection by a multidomain antibody to influenza hemagglutinin, Science, 362, 598-602, https://doi.org/10.1126/science.aaq0620.
  11. Efimov, G. A., Kruglov, A. A., Khlopchatnikova, Z. V., Rozov, F. N., Mokhonov, V. V., Rose-John, S., Scheller, J., Gordon, S., Stacey, M., Drutskaya, M. S., Tillib, S. V., and Nedospasov, S. A. (2016) Cell-type-restricted anti-cytokine therapy: TNF inhibition from one pathogenic source, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 113, 3006-3011, https://doi.org/10.1073/pnas.1520175113.
  12. Hanke, L., Das, H., Sheward, D. J., Perez Vidakovics, L., Urgard, E., Moliner-Morro, A., Kim, C., Karl, V., Pankow, A., Smith, N. L., Porebski, B., Fernandez-Capetillo, O., et al. (2022) A bispecific monomeric nanobody induces spike trimer dimers and neutralizes SARS-CoV-2 in vivo, Nat. Commun., 13, 155, https://doi.org/10.1038/s41467-021-27610-z.
  13. Liu, Y., Ao, K., Bao, F., Cheng, Y., Hao, Y., Zhang, H., Fu, S., Xu, J., and Wu, Q. (2022) Development of a bispecific nanobody targeting CD20 on B-cell lymphoma cells and CD3 on T cells, Vaccines (Basel), 10, 1335, https://doi.org/10.3390/vaccines10081335.
  14. Ma, H., Zhang, X., Zeng, W., Zhou, J., Chi, X., Chen, S., Zheng, P., Wang, M., Wu, Y., Zhao, D., et al. (2022) A bispecific nanobody dimer broadly neutralizes SARS-CoV-1 & 2 variants of concern and offers substantial protection against Omicron via low-dose intranasal administration, Cell Discov., 8, 132, https://doi.org/10.1038/s41421-022-00497-w.
  15. De Marco, A. (2015) Recombinant antibody production evolves into multiple options aimed at yielding reagents suitable for application-specific needs, Microb. Cell Factories, 14, 125, https://doi.org/10.1186/s12934-015-0320-7.
  16. Sandomenico, A., Sivaccumar, J. P., and Ruvo, M. (2020) Evolution of Escherichia coli expression system in producing antibody recombinant fragments, Int. J. Mol. Sci., 21, 6324, https://doi.org/10.3390/ijms21176324.
  17. Huleani, S., Roberts, M. R., Beales, L., and Papaioannou, E. H. (2022) Escherichia coli as an antibody expression host for the production of diagnostic proteins: significance and expression, Crit. Rev. Biotechnol., 42, 756-753, https://doi.org/10.1080/07388551.2021.1967871.
  18. Skerra, A., and Plückthun, A. (1988) Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli, Science, 240, 1038-1041, https://doi.org/10.1126/science.3285470.
  19. Le Gall, F., Reusch, U., Little, M., and Kipriyanov, S. M. (2004) Effect of linker sequences between the antibody variable domains on the formation, stability and biological activity of a bispecific tandem diabody, Protein Eng. Des. Sel., 17, 357-366, https://doi.org/10.1093/protein/gzh039.
  20. Wang, Q., Chen, Y., Park, J., Liu, X., Hu, Y., Wang, T., McFarland, K., and Betenbaugh, M. J. (2019) Design and production of bispecific antibodies, Antibodies (Basel), 8, 43, https://doi.org/10.3390/antib8030043.
  21. Huang, C., Huang, J., Zhu, S., Tang, T., Chen, Y., and Qian, F. (2023) Chem. Eng. Sci., 270, 118521, https://doi.org/ 10.1016/j.ces.2023.118521.
  22. Roobrouck, A., and Stortelers, C. (2015) Bispecific nanobodies. Applicant – ABLYNX NV (Belgium). WIPO/PCT patent publication number WO2015044386 A1. Publication date April 2, 2015.
  23. Zettl, I., Ivanova, T., Zghaebi, M., Rutovskaya, M. V., Ellinger, I., Goryainova, O., Kollárová, J., Villazala-Merino, S., Lupinek, C., Weichwald, C., Drescher, A., Eckl-Dorna, J., Tillib, S. V., and Flicker, S. (2022) Generation of high affinity ICAM-1-specific nanobodies and evaluation of their suitability for allergy treatment, Front. Immunol., 13, 1022418, https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1022418.
  24. Zettl, I., Ivanova, T., Strobl, M. R., Weichwald, C., Goryainova, O., Khan, E., Rutovskaya, M. V., Focke-Tejkl, M., Drescher, A., Bohle, B., Flicker, S., and Tillib, S. V. (2022) Isolation of nanobodies with potential to reduce patients’ IgE binding to Bet v 1, Allergy, 77, 1751-1760, https://doi.org/10.1111/all.15191.
  25. Горяйнова О. С., Иванова Т. И., Рутовская М. В., Тиллиб С. В. (2017) Метод параллельного и последовательного генерирования однодоменных антител для протеомного анализа плазмы крови человека, Мол. Биол., 51, 985-996.
  26. Conrath, K. E., Lauwereys, M., Galleni, M., Matagne, A., Frère, J. M., Kinne, J., Wyns, L., and Muyldermans, S. (2001) Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae, Antimicrob. Agents Chemother., 45, 2807-2812, https://doi.org/10.1128/AAC.45.10.2807-2812.2001.
  27. Тиллиб С. В., Горяйнова О. С.(2024) Биспецифичные нанотела с удлиненными линкерными последовательностями между антиген-узнающими модулями для наработки в периплазме E. coli. Заявка на патент РФ № 2024101830 (от 25.01.2024), ФИПС, Москва.
  28. Baral, T. N., and Arbabi-Ghahroudi, M. (2012) Expression of single-domain antibodies in bacterial systems, Methods Mol Biol., 911, 257-275, https://doi.org/10.1007/978-1-61779-968-6_16.
  29. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, 680-685, https://doi.org/10.1038/227680a0.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. The scheme of the expression structure used for the synthesis of bsNT and the sequence of linkers separating the sequences encoding nAT. From left to right, the design indicates: the lactose promoter site (Plac/operator); the ribosome binding site (RBS); the beginning of translation (arrow); the signal peptide for periplasmic localization (pelB); the sequences encoding nAT (VHH1 and VHH2) separated by a linker sequence (the amino acid sequences of the used linkers are indicated at the bottom drawing); HA-tag sequences (YPYDVPDYA) and six histidine residues at the very end. ILZ is a trimerizing domain, "isoleucine lightning"

Download (95KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. SDS-PAGE and enzyme immunoassay of bsNT aBet-l1-aICAM1 and aICAM1-l1-aBet. a is the electrophoretic separation in a 5-19% gradient SDS polyacrylamide gel of proteins from periplasmic extracts (1, 2) and affine purified NATs (3, 4). The arrow shows the position of the bsNT. There is a marker (M) in the leftmost track and the dimensions of the marker strips are indicated (in kDa). b – Immunoassay of binding of the obtained bsNT at a concentration of 0.4 mcg/ml with immobilized recombinant antigens. The averaged data of three dimensions are presented, indicating the area of data dispersion

Download (75KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. SDS-PAGE and enzyme immunoassay of bsNT aHA-l2-E7(aIgA), also referred to as (HN-E7)x3. a – Electrophoretic separation in a 5-19% gradient SDS polyacrylamide gel of affine purified bsNT, initial (1), overshoot on a filter with a nominal molecular cutoff a mass of 100 kDa (2), purified from fine impurities and, presumably, trimerized bsNT (3), delayed above the filter with a molecular weight cutoff of 100 kDa. The arrow shows the position of the monomeric bsNT. A marker (M) is applied in the rightmost track and the dimensions of the marker strips are indicated (in kDa). b – Immunoassay of binding of the obtained bsNT (HN-E7)x3, as well as control monovalent NATs (E7 – against IgA and HN13 – against hemagglutinin HA-H5 avian influenza virus) at a concentration of 1 mcg/ml with immobilized recombinant antigens (IgA and HA-H5). The control wells were without antigen (columns "without AG"). The averaged data of three dimensions are presented, indicating the area of data dispersion

Download (75KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».