Acrylate reductase of an anaerobic electron transport chain of the marine bacterium shewanella woodyi

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В отсутствии кислорода многие микроорганизмы способны к анаэробному «дыханию» с использованием различных неорганических или органических соединений в качестве терминальных акцепторов электронов для дыхательной электрон-транспортной цепи. Среди органических соединений наиболее типичным терминальным акцептором является фумарат. Однако вариабельность аминокислотных остатков, формирующих каталитический центр гомологов фумаратредуктазы во многих бактериях, предполагает существование и других 2-еноатредуктазных активностей [1]. Действительно, среди гомологов фумаратредуктазы были идентифицированы ферменты с иной субстратной специфичностью, например, цитохром c:метакрилат-оксидоредуктазы, цитохром c:уроканат-оксидоредуктазы, NADH:(гидрокси)циннамат-оксидоредуктазы и NADH:акрилат-оксидоредуктазы [1–6].

Изучение регуляции экспрессии гена NADH:акрилат-оксидоредуктазы из морской бактерии Vibrio harveyi показало, что этот фермент индуцируется акрилатом вне зависимости от концентрации кислорода в среде роста [1]. Из-за этого вполне вероятно, что основной функцией NADH:акрилат-оксидоредуктазы является детоксификация акрилата в цитоплазме V. harveyi, а не собственно анаэробное дыхание на этой ненасыщенной карбоновой кислоте. В связи с этим интересно идентифицировать белки, прямо участвующие в работе анаэробной дыхательной цепи, использующей акрилат в качестве терминального акцептора электронов. Способность использовать акрилат в качестве терминального акцептора была ранее обнаружена с помощью микробиологических подходов у бактерии Halodesulfovibrio aestuarii (ранее известной как Desulfovibrio acrylicus), однако участвующие в этом процессе белки не были идентифицированы [7].

Основным природным источником свободной акриловой кислоты является диметилсульфониопропионат (DMSP) [8]. Это соединение, используемое многими морскими водорослями и растениями в качестве осмолита, накапливается в цитоплазме клеток этих организмов в больших (вплоть до сотен мМ) концентрациях. Как следствие, в земной биосфере образуется порядка 109 тонн DMSP в год, и он составляет существенный источник углерода, восстановленной серы и энергии для многих морских бактерий. Разложение DMSP бактериальными DMSP-лиазами DddL, DddP, DddQ, DddW и DddY сопровождается образованием акрилата (рис. 1) [8], что делает присутствие акриловой кислоты довольно характерным для разных морских экологических ниш.

 

Рис. 1. Катализируемая DMSP-лиазой DddY реакция разложения диметилсульфониопропионата

 

DMSP-лиаза DddY занимает особое место среди этих ферментов. Она проявляет высокую удельную активность и имеет необычную для DMSP-лиаз периплазматическую локализацию в бактериальной клетке [9]. Последний факт указывает на то, что образующийся из DMSP акрилат может не транспортироваться внутрь клетки, а использоваться в периплазматическом пространстве, и это хорошо согласуется с гипотетической ролью акрилата в качестве терминального акцептора электронов для анаэробной электрон-транспортной цепи. Действительно, контекстный анализ dddY-содержащих бактериальных геномов (работы Curson et al. и Arkhipova et al. [8–10], рис. S1 Приложения) показал, что у многих морских бактерий (например, из родов Shewanella, Ferrimonas и Arcobacter) в непосредственной близости от гена dddY на хромосоме расположены гены, кодирующие одну или две копии флавинсодержащих и гем C-содержащих субъединиц гипотетического флавоцитохрома c (swoo_0275 и swoo_0276 на рис. 2, а соответственно), сходного с цитохром c:фумарат-оксидоредуктазами этих бактерий. Продукты этих генов содержат сигнальные пептиды Tat- и Sec-типа для флавин- и гемсодержащих субъединиц соответственно, что указывает на периплазматическую локализацию зрелых белков. Биоинформатический анализ позиций аминокислотных остатков, участвующих в связывании восстанавливаемого субстрата [1, 4], показывает, что продукты dddY-ассоциированных генов флавинсодержащих субъединиц флавоцитохрома c содержат в своём составе аминокислотные остатки, ответственные за связывание карбоксильной группы, соответствующей C4-карбоксильной группе фумарата. Однако вместо консервативных остатков His и Thr(Ser) фумаратредуктаз, принимающих участие в связывании C1-карбоксильной группы фумарата, в первичной структуре представленных на рис. S1 Приложения DddY-ассоциированных редуктаз находятся остатки Gly и Tyr соответственно (рис. 2, б). Таким образом, можно заключить, что DddY-ассоциированные флавоцитохромы c участвуют в восстановлении какой-то другой, отличной от фумарата α,β-ненасыщенной карбоновой кислоты.

Обращает на себя внимание присутствие в большинстве dddY-ассоциированных генных кластеров гена, кодирующего NADPH:акрилоил-CoA-оксидоредуктазу AcuI (swoo_0272 на рис. 2, а), ответственную во многих бактериях за детоксификацию цитоплазматического акрилата [11]. Эти данные могут указывать на то, что весь генный кластер swoo_0272–swoo_0277 кодирует белки, связанные с метаболизмом акрилата. Если это так, то описанный выше флавоцитохром c Swoo_0275/Swoo_0276 S. woodyi и гомологичные ферменты из других dddY-содержащих бактерий являются хорошими кандидатами на роль акрилатредуктаз анаэробной дыхательной цепи. Экспериментальная проверка этого предположения и была целью данной работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и условия их выращивания.

Клетки Shewanella woodyi выращивали при 25 °C в жидкой среде MR (31,5‰ морских солей («Marine Life», Россия), 20 мМ L-лактат, 0,5%-ный пептон, 0,25%-ный дрожжевой экстракт, 20 мМ HEPES/NaOH (pH 7,5)) аэробно или анаэробно в присутствии различных акцепторов электронов или их сочетаний (0,5–20 мМ диметилсульфоксид (DMSO), акрилат или метакрилат). Анаэробные выращивания проводили в герметичных стеклянных колбах, полностью заполненных средой. Анаэробные условия достигались за счёт собственной оксидазной активности клеток.

Клетки Shewanella oneidensis растили при 28 °C аэробно в жидкой среде LB или анаэробно в жидкой среде, содержащей 0,225 г/л K₂HPO₄, 0,225 г/л KH₂PO₄, 0,46 г/л NaCl, 0,225 г/л (NH₄)₂SO₄, 0,117 г/л MgSO₄ · 7H₂O, 20 мМ L-лактат, 0,05%-ный дрожжевой экстракт, 20 мМ DMSO, 20 мМ HEPES/NaOH (pH 7,2). При необходимости в среды роста S. oneidensis добавляли канамицин (50 мкг/мл).

Конструирование экспрессионных векторов.

Экспрессионный вектор для компонентов флавоцитохрома ArdAB был получен за счёт амплификации ard-оперона (swoo_0275–swoo_0276) с геномной ДНК S. woodyi при использовании высокоточной полимеразы Tersus («Евроген», Россия) и праймеров Sh_wood_dir/Sh_wood_CR4_rev (последовательности праймеров указаны в табл. S1 Приложения). Амплифицированный фрагмент (2571 п.н.) клонировали в вектор pCR4-TOPO («Invitrogen», США) с получением плазмиды pSwoo_0275&Swoo_0276.

Экспрессионный вектор для белка ArdA получали с помощью частичного гидролиза плазмиды pSwoo_0275&Swoo_0276 эндонуклеазами рестрикции HindIII и NotI. Укороченный на 350 п.н. продукт затупляли и самолигировали с получением плазмиды pSwoo_0275. Сконструированные плазмиды проверяли секвенированием и трансформировали в клетки S. oneidensis MR-1 с помощью электропорации.

Получение периплазматической фракции из клеток Shewanella.

Клетки S. woodyi или S. oneidensis осаждали центрифугированием (10 000 g, 10 мин) и дважды промывали буфером (0,5 M NaCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) для S. woodyi или 75 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) для S. oneidensis). Периплазматическую фракцию получали обработкой полимиксином Б [12, 13]. Для этого клеточный осадок суспендировали в соответствующем буфере промывки (6–9×1010 клеток/мл), содержащем полимиксин Б (2000 единиц/мл), и инкубировали на льду в течение 20 мин. Обработанные полимиксином клетки удаляли центрифугированием (10 000 g, 10 мин), а полученный супернатант использовали в качестве периплазматической фракции для измерения акрилатредуктазной активности и для выделения Ard (акрилатредуктазы).

Выделение и характеризация Ard.

Для выделения Ard клетки растили анаэробно в шести литрах среды MR, содержащей 20 мМ DMSO и 1,5 мМ акрилат (выход биомассы составлял ~170 мг клеточного белка). Полученную из этих клеток периплазматическую фракцию концентрировали с помощью 30-кДа центрифужного фильтра, разбавляли средой (10 мМ Tris-HCl (pH 8,0)) до 80 мМ концентрации NaCl и наносили на колонку с DEAE-сефарозой CL-6B (16 × 30 мм), уравновешенную буфером 1 (10 мМ Tris-HCl (pH 8,0)), содержащим 80 мМ NaCl. Колонку промывали тремя объёмами буфера 1, содержащего 100 мМ NaCl, после чего смывали Ard с помощью линейного градиента NaCl от 100 до 340 мМ в буфере 1. Остаточный белок смывали с колонки 2 M NaCl в буфере 1. Наиболее активные фракции Ard (~0,6 мг белка) объединяли, концентрировали на центрифужном фильтре и хранили при −70 °C. Концентрацию белка определяли бицинхониновым методом [14], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта.

Связанные с Ard флавины экстрагировали трифторуксусной кислотой и разделяли с помощью ВЭЖХ, как описано ранее [13]. Электрофорез в ДСН-ПААГ (ДСН-ПААГЭ, ДСН – додецилсульфат натрия) проводили с использованием 12,5%-ных полиакриламидных гелей [15]. Гели окрашивали на белок с помощью раствора PageBlueTM («Fermentas», Литва), либо на гем C 3,3′,5,5′-тетраметилбензидином и H₂O₂ [16]. MALDI-TOF MS-анализ (MS – масс-спектрометрия) проводили на масс-спектрометре UltrafleXtreme MALDI-TOF-TOF («Bruker Daltonik», Германия), как описано ранее [5].

Определение ферментативных активностей.

Акрилатредуктазную активность определяли на спектрофотометре Hitachi-557 («Hitachi», Япония) при 606 нм по окислению восстановленного метилвиологена (MV, ε₆₀₆ = 13,7 мМ−1 см−1). Измерение проводили при 25 °C в герметичной кювете объёмом 3,2 мл, полностью заполненной средой. Среда измерения содержала 100 мМ HEPES/Tris (pH 7,5), 0,05–1 мМ акцептора электронов и 1 мМ MV. Создание анаэробных условий и восстановление MV осуществлялось за счёт дробных добавок дитионита. При этом MV восстанавливали до значений оптической плотности ~1,5–2,0 при 606 нм, что соответствовало ~110–150 мкМ восстановленной и ~850–890 мкМ окисленной формы MV. Одну единицу ферментативной активности определяли как количество фермента, катализирующего окисление 2 мкмоль MV за 1 мин.

Параметры уравнения Михаэлиса–Ментен для акрилат- и метакрилатредуктазных активностей Ard при 0–50 мкМ концентрации (мет)акрилата определяли по интегральной кинетике восстановления этих акцепторов электронов при 606 нм до полного исчерпания акцептора. Все измерения проводили при насыщающих концентрациях восстановленного MV (значение кажущейся K_m Ard для MV ≤ 2 мкМ). Скорости рассчитывали для 20 временных точек интегральной кинетики при её дифференцировании (-d[MV]/dt) с использованием пакета MATLAB («The MathWorks, Inc.», США). Концентрацию акцептора электрона в каждый момент времени рассчитывали из A₆₀₆, используя соотношение MV : акцептор, равное 2 : 1, и предполагая, что конечное значение A₆₀₆ соответствует 100%-ному восстановлению акцептора электронов. Скорости восстановления (мет)акрилата в 0,05–1 мМ диапазоне их концентраций определяли по начальной скорости реакции, как описано выше. Фиттирование данных уравнением Михаэлиса–Ментен проводили с помощью нелинейной регрессии.

Пропионатдегидрогеназную активность измеряли при 600 нм в присутствии феназинметасульфата и 2,6-дихлорфенолиндофенола в качестве акцепторов электронов. Среда измерения содержала 100 мМ HEPES/Tris (pH 7,5), 2 мМ пропионат, 2 мМ феназинметасульфат и 25 мкМ 2,6-дихлорфенолиндофенол.

Индукция акрилатредуктазной активности и экспрессии генов ardA и dddY в клетках S. woodyi. Клетки S. woodyi растили аэробно или анаэробно в среде MR, содержащей 20 мМ DMSO и соответствующий индуктор, в течение 4 ч для определения экспрессии генов методом количественной полимеразной цепной реакции (рвПЦР) или в течение 14 ч для измерения акрилатредуктазной активности.

Экстракцию РНК из клеток S. woodyi проводили с помощью кита RNA Solo («Евроген»). Полученный препарат дополнительно обрабатывали свободной от РНКаз ДНКазой I («Thermo Fisher Scientific», США) при 37 °C в течение 1 ч. кДНК синтезировали с использованием набора MMLV RT («Евроген») со случайными декануклеотидными праймерами. Для каждой реакции ставили контрольную пробу, не содержащую обратной транскриптазы. рвПЦР проводили с помощью набора qPCRmix-HS SYBR («Евроген»), используя полученные препараты кДНК в качестве матрицы и пар праймеров A1/A2 или D3/D4 (табл. S1 Приложения) для определения экспрессии ardA и dddY соответственно. Для нормализации использовали 16S рРНК (праймеры 16s_FWS/16s_RV). Для калибровки использовали последовательные разведения геномной ДНК S. woodyi, содержащей гены для DddY, ArdA и 16S рРНК в соотношении 1 : 1 : 10.

Биоинформатика.

Геномный контекстный анализ генов dddY проводили с использованием программы webFlags [17]. Множественное выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы Clustal Omega [18]. Клеточную локализацию бактериальных белков предсказывали, используя программу SignalP 6.0 [19]. Предсказание оперонной структуры проводили с помощью сервиса Operon-mapper [20], наличие терминаторов транскрипции определяли программой iTerm-PseKNC [21]. Идентификацию белков масс-спектрометрией проводили поиском MS- и MS/MS-ионов в базе данных NCBI, используя программный пакет Mascot 2.3.02 («Matrix Science», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение Ard из периплазматической фракции S. woodyi.

 Для поиска Ard анаэробной дыхательной цепи в качестве модельного организма нами была выбрана морская светящаяся бактерия S. woodyi [22], так как её геном содержит описанный выше dddY-ассоциированный генный кластер (рис. 2, а и рис. S1 Приложения), она способна расщеплять DMSP и демонстрирует высокую акрилатредуктазную активность при анаэробном выращивании в присутствии акрилата (см. последний раздел Результатов).

 

Рис. 2. dddY-Ассоциированные гены морской бактерии Shewanella woodyi. а – Расположение dddY-ассоциированных генов на хромосоме S. woodyi: swoo_0272 – ген NADPH:акрилоил-CoA-оксидоредуктазы; swoo_0273 – гипотетического белка с неизвестными функциями; swoo_0274 – регулятора транскрипции; swoo_0275 – флавинсодержащей субъединицы флавоцитохрома с; swoo_0276 – тетрагемового цитохрома с; swoo_0277 – DMSP-лиазы DddY (https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_organism?org=T00676). б – Выравнивание аминокислотных последовательностей цитохром c:фумарат-оксидоредуктазы из S. oneidensis MR-1 (So_FccA, GenBank: AAN54044), NADH:фумарат-оксидоредуктазы из Klebsiella pneumoniae (Kp_Frd, B5XRB0), субъединицы SdhA сукцинатдегидрогеназы из Escherichia coli (Ec_SdhA, HDZ3930178), NADH:акрилат-оксидоредуктазы из V. harveyi (Vh_Ard, P0DW92), белка Swoo_0275 S. woodyi (Sw_0275, ACA84576) и флавоцитохрома c из H. aestuarii (Ha_flc, SHJ73509). Два приведённых фрагмента выравнивания содержат аминокислотные остатки (выделены синим и зелёным цветом), вовлечённые в связывание соответственно C4- и C1-карбоксилатов фумарата в фумаратредуктазах, а также остатки (выделены жёлтым), участвующие в переносе протона к фумарату

 

Из выращенных в присутствии акрилата клеток S. woodyi выделяли периплазматическую фракцию и разделяли её ионообменной хроматографией на DEAE-сефарозе с детекцией акрилатредуктазной активности. При хроматографии наблюдался единственный пик этой активности (рис. 3, а), который хорошо совпадал с одним из пиков цитохромов, детектируемых по поглощению света с длиной волны 405 нм.

 

Рис. 3. Выделение Ard из клеток S. woodyi. а – Разделение периплазматической фракции клеток S. woodyi, выращенных анаэробно в присутствии акрилата, с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-сефарозе. Поглощение света при 405 нм показано синей кривой, концентрация NaCl показана пунктиром. Красными квадратами обозначена акрилатредуктазная активность в полученных фракциях. б – ДСН-ПААГЭ полученного препарата Ard. На каждую дорожку наносили по 2 мкг белка. Гель окрашивали либо на белок с помощью Кумасси (левая панель), либо на гем C с помощью тетраметилбензидина/H2O2 (правая панель). Полосы с числами с левой стороны указывают положение белковых маркеров молекулярных весов. Белковые полосы, идентифицированные с помощью MALDI-MS, указаны с правой стороны

 

Разделение полученного препарата с помощью ДСН-ПААГЭ выявило в нём два основных белка с массой ≈ 80 и 52 кДа (рис. 3, б, левая панель). MS- и MS/MS-анализ этих полос показал, что верхняя полоса представляет собой редуктазу триметиламин-N-оксида TorA (Swoo_3526, покрытие последовательности – 50%), тогда как полоса с массой ≈ 52 кДа идентифицировалась как флавинсодержащая субъединица флавоцитохрома c (Swoo_0275, покрытие последовательности – 65%), то есть именно тот белок, который был биоинформатически предсказан в качестве субъединицы гипотетического Ard.

Определение флавинов в полученном препарате (рис. 4, а) показало, что в нём детектируется только FAD (5 нмоль мг−1). Это также находится в хорошем согласии с идентификацией Ard S. woodyi, так как все известные на сегодняшний день флавоцитохромы c содержат FAD в качестве простетической группы [2–4, 23, 24]. Спектральный анализ полученного препарата показал, что он также содержит цитохром типа c (рис. 4, б). Важно отметить, что примесный периплазматический белок TorA не содержит в своём составе ни флавинов, ни гемов C [25]. Окраска электрофореграммы выделенного препарата на гем C (рис. 3, б, правая панель) выявляет гемсодержащую полосу с массой ≈ 18 кДа. Однако MS- и MS/MS-анализы этой полосы не позволили идентифицировать соответствующий белок. По-видимому, это связано с тем, что предполагаемая цитохромная субъединица Ard (Swoo_0276) содержит в своей первичной структуре четыре последовательности CxxCH и, по-видимому, присоединяет четыре гема восемью ковалентными связями. Таким образом, этот белок потенциально способен образовывать лишь один немодифицированный триптический пептид (на N-конце зрелого белка), аминокислотную последовательность которого также нельзя однозначно предсказать из-за альтернативных возможностей отрезания лидерного пептида.

 

Рис. 4. Идентификация простетических групп Ard. а – Разделение нековалентно связанных с Ard флавинов с помощью ВЭЖХ. Объёмы удержания стандартов FAD, FMN и рибофлавина (Rf) показаны стрелками. б – Спектры поглощения окисленного воздухом (синяя кривая) и восстановленного дитионитом (красная кривая) препаратов Ard. Спектры измеряли в 100 мМ Tris-HCl (pH 8,0) буфере, содержащем 0,1 мг/мл Ard. Специфичные для цитохромов c максимумы поглощения γ- и α-полос показаны стрелками

 

Гетерологичная экспрессия генов swoo_0275/swoo_0276 из S. woodyi в клетках S. oneidensis MR-1.

Фракционирование периплазматической фракции клеток S. woodyi позволяет предположить, что Ard этой бактерии представляет собой флавоцитохром c Swoo_0275/Swoo_0276. Однако наличие в выделенном препарате дополнительного белка (TorA) и невозможность идентификации Swoo_0276 с помощью масс-спектрометрии сделало необходимым использование альтернативных подходов для доказательства правильности идентификации Ard. Для этого мы провели гетерологичную экспрессию гена swoo_0275 и генов swoo_0275/swoo_0276 из S. woodyi в клетках S. oneidensis MR-1.

Было обнаружено, что клетки S. oneidensis MR-1, выращенные в присутствии или в отсутствии акрилата как в аэробных, так и в анаэробных условиях, не обладают собственной акрилатредуктазной активностью (табл. 1). Внесение плазмиды, содержащей гены swoo_0275/swoo_0276, в клетки S. oneidensis MR-1 приводило к появлению акрилатредуктазной активности в периплазматической фракции полученного штамма. В то же время экспрессия одиночного гена флавиновой субъединицы (swoo_0275) не сопровождалась появлением акрилатредуктазной активности в клетках S. oneidensis (табл. 1).

 

Таблица 1. Удельные активности Ard в периплазматических фракциях клеток различных штаммов S. oneidensis, выращенных аэробно в отсутствии акрилата

Штамм	Акрилатредуктазная активность1 (нмоль мин−1 мг клеточного белка−1)
S. oneidensis MR-1	< 0,3
S. oneidensis/ pSwoo_0275&Swoo_0276	19 ± 4
S. oneidensis/pSwoo_0275	< 0,3

1 Среднее для двух независимых измерений.

 

Таким образом, данные гетерологичной экспрессии подтверждают предположение о том, что Ard S. woodyi представляет собой флавоцитохром c, состоящий из FAD-содержащей субъединицы Swoo_0275 (ArdA) и гем C-содержащей субъединицы Swoo_0276 (ArdB).

Субстратная специфичность Ard.

Редуктазная активность Ard по отношению к различным природным α,β-ненасыщенным карбоновым кислотам была измерена при их концентрации 1 мМ. Как оказалось, фермент Ard довольно специфичен и способен восстанавливать только акрилат и метакрилат, но не кротоновую, фумаровую, сорбиновую, урокановую, коричную, п-кумаровую, кофейную или феруловую кислоты. Также оказалось, что для активности Ard необходимо наличие карбоксильной группы в восстанавливаемом субстрате, и поэтому этот фермент не восстанавливал акриламид. Активность Ard была максимальной при pH ≈ 7,5.

Для акрилата и метакрилата были определены кинетические параметры соответствующих ферментативных редуктазных активностей. В случае акрилата наблюдалась гиперболическая зависимость скорости катализируемой реакции от концентрации этого субстрата с K_m 16 ± 0,4 мкМ и максимальной удельной активностью 58 ± ± 0,5 мкмоль мин−1 мг−1 (рис. 5, а). Величина K_m для метакрилата была практически такой же (19 ± 1,1 мкМ), но значение максимальной удельной активности (2,6 ± 0,1 мкмоль мин−1 мг−1) было в 22 раза меньше (рис. 5, а, рис. S2 Приложения). Такое сходство в значениях K_m и существенное различие в значениях максимальной удельной активности указывает на то, что метакрилат может выступать в качестве конкурентного ингибитора акрилатредуктазной активности Ard. Действительно, внесение метакрилата в среду для измерения акрилатредуктазной активности приводило к ингибированию редуктазной активности фермента, зависящему от соотношения концентраций метакрилат/акрилат (рис. 5, б). Остальные исследованные α,β-ненасыщенные карбоновые кислоты (см. выше) не обладали таким эффектом и не ингибировали акрилатредуктазную активность Ard.

 

Рис. 5. Каталитические характеристики Ard из S. woodyi. а – Зависимость ферментативной активности Ard от концентрации акрилата (синие квадраты) или метакрилата (красные квадраты). Показаны значения акрилат- и метакрилатредуктазных активностей Ard, полученные с помощью анализа интегральной кинетики восстановления акцепторов в 0,5–50 мкМ диапазоне концентраций (мет)акрилата. Линиями показаны результаты фиттирования полученных данных уравнением Михаэлиса–Ментен (данные для метакрилата в увеличенном масштабе приведены на рис. S2 Приложения). б – Типичные кривые окисления MV в присутствии Ard. Добавки 1 или 0,1 мМ акрилата (Acr) и 1 мМ метакрилата (Mac) указаны стрелками. Числа над кривыми указывают остаточную ферментативную активность Ard после добавки метакрилата, где активность до этой добавки принимали за 100%

 

Была также проверена способность Ard катализировать обратную акрилатредуктазной реакцию. Оказалось, что этот белок не способен окислять пропионат при использовании феназинметасульфата и дихлорфенолиндофенола в качестве акцепторов электронов. Таким образом, Ard, так же как и многие другие редуктазы ненасыщенных карбоновых кислот [1, 2, 4, 13, 24], катализирует однонаправленную реакцию и функционирует в качестве молекулярного диода [26].

Индукция синтеза Ard в клетках S. woodyi.

Для определения способности различных субстратов Ard вызывать индукцию его синтеза в клетках S. woodyi проводили выращивание этой бактерии в аэробных или анаэробных условиях в отсутствии или в присутствии 1,5 мМ акрилата или метакрилата (выбранная концентрация субстрата равна максимальной концентрации акрилата, при которой ещё наблюдался анаэробный рост), а также в присутствии 5 мМ DMSP. Как видно в табл. 2, акрилатредуктазная активность не детектировалась в клетках S. woodyi при аэробном выращивании, в том числе и в присутствии в среде роста использованных потенциальных индукторов. Напротив, при анаэробном выращивании даже в отсутствии индукторов в клетках детектировалась низкая, но измеряемая акрилатредуктазная активность. Эта активность умеренно повышалась в присутствии DMSP и значительно индуцировалась в присутствии акрилата или метакрилата (в ~30 и 80 раз соответственно).

 

Таблица 2. Уровни транскрипции генов ardA и dddY, а также величины акрилатредуктазной активности в клетках S. woodyi, выращенных в различных условиях

Условия выращивания	Акрилатредуктазная активность (нмоль·мин−1·мг−1)	ardA мРНК/рРНК × 10−6	dddY мРНК/рРНК × 10−6
+ O2, без индукторов	< 0,3	1,5 ± 0,2	3,2 ± 0,6
+ O2, 5 мМ DMSP	< 0,3	0,9 ± 0,1	2,7 ± 0,4
+ O2, 1,5 мМ акрилат	< 0,3	1,6 ± 0,3	3,5 ± 0,2
+ O2, 1,5 мМ метакрилат	< 0,3	0,9 ± 0,2	1,9 ± 0,1
− O2, без индукторов	9,0 ± 4,0	20 ± 2,0	2,6 ± 0,2
− O2, 5 мМ DMSP	45 ± 15	13 ± 1,0	1,7 ± 0,2
− O2, 1,5 мМ акрилат	260 ± 30	87 ± 5,0	21 ± 1,0
− O2, 1,5 мМ метакрилат	780 ± 50	220 ± 40	27 ± 2,0

 

Сходные результаты были получены и при измерении уровня транскрипции ard-генов. Биоинформатический анализ показал, что гены swoo_0275– swoo_0276 образуют на хромосоме S. woodyi оперон (ard), не включающий в свой состав ген dddY (swoo_0277). Поэтому регуляцию транскрипции измеряли отдельно для ard-оперона и для гена dddY. Как видно в табл. 2, в аэробных условиях индукции ard-оперона не наблюдалось. Анаэробные условия выращивания приводили к ~13-кратному повышению транскрипции ard, присутствие в анаэробной среде роста акрилата или метакрилата сопровождалось дополнительным 4–11-кратным повышением транскрипции этого оперона (табл. 2).

Сходным образом индуцировалась и транскрипция гена dddY (swoo_0277). Максимальный уровень транскрипции наблюдался в анаэробных условиях в присутствии акрилата или метакрилата (табл. 2). Однако в случае гена dddY максимальное воздействие оказывало присутствие в среде роста несопряжённых карбоновых кислот, а анаэробные условия роста сами по себе были хоть и необходимым, но недостаточным условием для повышения транскрипции этого гена.

Для определения способности S. woodyi использовать субстраты Ard в качестве терминальных акцепторов электронов для анаэробного дыхания клетки этой бактерии выращивали в присутствии акрилата, метакрилата или DMSP, используя классический акцептор электронов DMSO в качестве контроля. Было обнаружено, что акрилат в концентрациях, превышающих 1 мМ, ингибировал анаэробный рост S. woodyi, что хорошо согласуется с известной токсичностью этого соединения [11, 27]. Поскольку концентрации терминального акцептора электронов менее 1 мМ не позволяют обнаружить стимуляцию роста при анаэробном дыхании, дальнейшие эксперименты проводили с использованием 10 мМ метакрилата, который гораздо менее токсичен [28], а также с такой же концентрацией DMSP или DMSO. Метакрилат и DMSP увеличивали выход биомассы на 20–25% (рис. 6). Похожий эффект вызывал и DMSO.

 

Рис. 6. Анаэробный рост S. woodyi в присутствии различных акцепторов электронов. Начальная оптическая плотность при посеве культуры составляла 0,005. Клетки выращивали анаэробно при 25 °C в течение 18 ч. Где указано, в среду роста добавляли 10 мМ метакрилат (Mac), DMSP или DMSO (столбец «нет» – без добавления акцепторов). Показаны конечные значения оптической плотности культур при 600 нм, планки погрешностей указывают стандартные отклонения для трёх биологических повторов

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведённые эксперименты показали, что (i) полученные при разделении периплазматических белков S. woodyi фракции, обладающие акрилатредуктазной активностью, содержат белок ArdA (Swoo_0275) в качестве одного из основных компонентов; (ii) гетерологичная экспрессия генов ardA/ardB (swoo_0275/swoo_0276), но не одиночного гена ardA (swoo_0275) в клетках S. oneidensis MR-1 приводит к появлению в их периплазме несвойственной для этой бактерии акрилатредуктазной активности; (iii) экспрессия ard-оперона индуцируется присутствием акрилата или метакрилата в среде при анаэробном выращивании S. woodyi, что сопровождается появлением акрилатредуктазной активности в периплазме этой бактерии. Совокупность этих наблюдений позволяет заключить, что флавоцитохром c ArdAB (Swoo_0275/Swoo_0276) ответственен за восстановление акрилата в клетках S. woodyi. По аналогии со сходными ферментами [28] можно предположить, что природным донором электронов для Ard является низкопотенциальный цитохром c.

Анализ ферментативной активности Ard показал, что этот белок довольно специфичен и восстанавливает только акрилат и метакрилат. По-видимому, в каталитическом центре Ard способны связываться α,β-ненасыщенные карбоновые кислоты только с небольшими по размеру заместителями в α- и β-положениях. При этом белок более чувствителен к размеру заместителя в β-положении, так как Ard не способен восстанавливать кротонат (β-метилакрилат), тогда как метакрилат (α-метилакрилат) восстанавливается Ard, хотя и с низкой скоростью. В случае метакрилата наличие метильной группы в α-положении слабо влияет на связывание этого соединения с Ard, однако, по-видимому, приводит к неправильной ориентации субстрата в активном центре, значительно замедляющей перенос гидрид-иона или протона на метакрилат. Это, по-видимому, и объясняет 22-кратное различие метакрилатредуктазной и акрилатредуктазной активностей Ard (рис. 5).

Исследование индукции синтеза Ard в клетках S. woodyi показало, что максимальная активность этого белка наблюдается в анаэробных условиях в присутствии акрилата и особенно метакрилата (табл. 2). Бо́льший индуцирующий эффект метакрилата, по-видимому, не физиологичен и объясняется медленным исчерпанием этого соединения в среде роста из-за низкой активности Ard по отношению к метакрилату. Интересно, что DMSP был лишь слабым индуктором Ard, возможно, из-за бо́льшей индукции Ard по сравнению с DddY в анаэробных условиях, вследствие чего стационарная концентрация акрилата при росте в присутствии DMSP должна быть незначительной. Такое соотношение активностей Ard и DddY, по-видимому, позволяет избежать токсического действия акрилата при DMSP-зависимом анаэробном росте этой бактерии.

Акрилатзависимая индукция синтеза Ard в анаэробных условиях и её отсутствие в аэробных условиях выращивания указывают на то, что данный белок нужен клеткам S. woodyi для анаэробного дыхания, использующего этот субстрат как терминальный акцептор в электрон-транспортной цепи. Проверка такого предположения осложнялась тем, что эта бактерия неспособна к анаэробному росту в минимальной среде, а использование богатых сред обеспечивает её анаэробный рост даже в отсутствии акцепторов электронов, что значительно снижает наблюдаемый эффект стимуляции ими анаэробного роста. Нам не удалось обнаружить стимуляцию роста S. woodyi в анаэробных условиях в присутствии акрилата (данные не представлены). Как уже отмечено выше, это, по-видимому, связано с токсичностью этой ненасыщенной карбоновой кислоты [11, 27], что не позволяет использовать концентрации акрилата более 1 мМ. Однако в присутствии метакрилата и DMSP наблюдалось небольшое, но достоверное увеличение выхода биомассы (на 20–25%), сравнимое с эффектом такого классического терминального акцептора, как DMSO (рис. 6).

Гены Ard-подобных белков широко распространены среди различных морских бактерий и зачастую вместе с геном dddY образуют на хромосоме характерный генный кластер (рис. S1 Приложения), по-видимому, позволяющий осуществлять анаэробное дыхание на таком широко распространённом в морских экологических нишах соединении, как DMSP. H. aestuarii, единственная описанная ранее бактерия, способная использовать образованный из DMSP акрилат в качестве терминального акцептора электронов [7], также содержит в своём геноме такой кластер, в том числе и ген ArdA-подобного белка (GenBank: SHJ73509). Аминокислотные последовательности белков ArdA из S. woodyi и H. aestuarii сходны между собой (50% идентичности, 66% сходства), особое сходство наблюдается для аминокислотных остатков каталитического центра (рис. 2, б). Интересно, что геном S. oneidensis MR-1 тоже содержит генный кластер dddY–ardAB (so_3622–so_3624), однако он инактивирован транспозоном ISSod3 [29], что, по-видимому, связано с адаптацией этой пресноводной бактерии к жизни в условиях, в которых водоросли и растения не синтезируют DMSP из-за низкой осмолярности среды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе идентифицирован фермент, ответственный за восстановление акрилата в электрон-транспортной цепи S. woodyi. Возможность протекания этой реакции позволяет осуществлять DMSP-зависимое анаэробное дыхание у этой и, по-видимому, у многих других морских бактерий.

Вклад авторов. А.В. Богачев – концепция работы; Ю.В. Берцова, М.В. Серебрякова, В.А. Богачев, А.А. Байков, А.В. Богачев – получение результатов и анализ данных; А.А. Байков и А.В. Богачев – написание и редактирование текста статьи.

Благодарности. MALDI-MS был доступен для нас в результате реализации Программы развития Московского государственного университета 5.13.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 24-24-00043).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Дополнительные материалы. Приложение к статье на английском языке опубликовано на сайте издательства Springer (www.springer.com/journal/10541), том 89, вып. 4, 2024.

About the authors

Y. V. Bertsova

Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: bogachev@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow

M. V. Serebryakova

Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University

Email: bogachev@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow

V. A. Bogachev

Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University

Email: bogachev@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow

A. A. Baykov

Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University

Email: bogachev@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow

A. V. Bogachev

Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University

Email: bogachev@belozersky.msu.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files