The cohesin complex: structure and principles of interaction with dna

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Когезин – это панэукариотический белковый комплекс, относящийся к группе SMC-комплексов (Structural Maintenance of Chromosomes, белок структурного поддержания хромосом), участвующий в процессах индивидуализации сестринских хроматид, декатенации хромосом, митотической и мейотической когезии, создания и поддержания специфической укладки ДНК в клетках, репарации двухцепочечных разрывов и стабилизации остановленных репликативных вилок [1, 2]. Как и другие SMC-комплексы, когезин представляет собой, с одной стороны, мультисубъединичную ABC-ATPазу, а с другой – ДНК-связывающий комплекс, не имеющий предпочтений к специфическим нуклеотидным последовательностям. Связывание и гидролиз ATP сопряжены с конформационными изменениями когезина, а также с изменениями аффинности разных элементов комплекса к ДНК. Повторяющиеся циклы связывания/гидролиза ATP приводят к направленному движению комплекса вдоль ДНК-нити, таким образом, когезин является моторным белком – ДНК-транслоказой.

В клетках эукариотических организмов когезин выполняет две различные функции: обеспечение когезии сестринских хроматид и так называемую экструзию хроматиновых петель (рис. 1, а). Процесс экструзии начинается с захвата небольшой ДНК-петли, после чего ее рост происходит за счет процессивного затягивания фланкирующих участков ДНК внутрь [3–6]. В основании растущих петель располагается активный SMC-комплекс, а их размер может достигать сотен тысяч пар оснований (рис. 1, а (2)). Экструзионная активность сопряжена с гидролизом ATP и является универсальной биохимической активностью всех SMC-комплексов [1]. По всей видимости, экструзия возникла на заре клеточной эволюции как способ пострепликативного разделения массивных молекул геномной ДНК (рис. 1, б); в этом процессе SMC-комплексы кооперируют с топоизомеразами II типа. Обеспечиваемая когезиновыми кольцами когезия сестринских хроматид (рис. 1, а (1)), по всей вероятности, не связана с экструзионной активностью комплекса [7, 8], хотя для погрузки на ДНК когезиновых колец, участвующих в когезии, также необходим гидролиз ATP [7, 9].

Рис. 1. Когезия сестринских хроматид и экструзия ДНК-петель, осуществляемые SMC-комплексами. а – Две базовые активности когезина: когезия (1) и экструзия (2). б – Экструзия, осуществляемая SMC-комплексами, и активность ДНК-топоизомераз типа II обеспечивают пострепликативную индивидуализацию сестринских геномов во всех клетках, прокариотических и эукариотических

Информация о структуре белков важна для понимания их активности и вдвойне важна для понимания активности моторных белков. В этом обзоре мы приведем данные о структуре когезина, а также суммируем современные представления о его взаимодействиях с ДНК, конформационных изменениях и о том, как взаимодействия с ДНК и цикл связывания/гидролиза ATP контролируют эти конформационные изменения. Данные о биологической роли когезин-зависимой экструзии, а также молекулярный механизм этого процесса подробно рассматриваются во втором обзоре серии, опубликованном в этом же выпуске журнала [10].

КОЛЬЦЕВОЙ КОРОВЫЙ ТРИМЕР КОГЕЗИНОВОГО КОМПЛЕКСА

Все эукариотические геномы кодируют по крайней мере четыре SMC-комплекса из трех разных классов: две разновидности когезина (митотический и мейотический), конденсин I и SMC5/6-комплекс [3, 4] (таблица). Инвариантной основой SMC-комплексов является тример, состоящий из двух SMC-субъединиц и одной клейзиновой субъединицы [2, 3, 11]. SMC-Белки [12] и клейзины [13] представляют собой два неродственных белковых семейства. Представители разных классов SMC-комплексов разделены сотнями миллионов лет эволюции и утратили гомологию в большей части аминокислотной последовательности, сохранив сходство в пределах коротких функционально важных мотивов и общую базовую структуру [14]. Тем не менее внутри шести основных подсемейств эукариотических SMC-белков (SMC1–6) и трех подсемейств эукариотических клейзинов (клейзины α–γ) наблюдается существенная степень консервативности на уровне аминокислотной последовательности. Особенно высокая консервативность наблюдается внутри SMC1- и SMC3-подсемейств. Так, например, SMC3 человека и мыши фактически идентичны.

Субъединичный состав панэукариотических SMC-комплексов

Примечание. HAWK-Субъединицы присутствуют только в когезинах и конденсинах, в то время как прокариотические SMC-комплексы и SMC5/6-комплекс имеют в своем составе вспомогательные субъединицы, объединяемые в группу KITE-белков [15]. Указаны названия субъединиц человека и названия гомологичных субъединиц Saccharomyces cerevisiae (в скобках).

В случае когезина (под когезином мы будем подразумевать более изученный митотический вариант комплекса) пара SMC-белков представлена гетеродимером SMC1 (Smc1)–SMC3 (Smc3)¹, а клейзиновая субъединица – белком RAD21 (Scc1). SMC-Белки – это палочковидные молекулы длиной порядка 50 нм с двумя глобулярными доменами на концах, соединенными относительно лабильной фибриллярной структурой (рис. 2, а) [16–18]. Полипептид, состоящий из 1200–1300 а.о., сложен вдвое внутри палочковидной структуры SMC-белка так, что один из терминальных глобулярных доменов образуется в результате взаимодействия N- и C-концов, а другой – образован непрерывным фрагментом полипептидной цепи, расположенным приблизительно посредине линейной последовательности [17, 19]. Первый из глобулярных доменов носит название головного домена, а второй – петлевого (hinge), внутри последнего происходит поворот полипептидной цепи SMC-белка на 180°. Фибриллярная структура, соединяющая два глобулярных домена, представляет собой внутримолекулярную антипараллельную суперспираль (coiled-coil), называемую плечевым доменом (arm).

Рис. 2. Субъединичная структура когезинового комплекса. а – Фолдинг и основные структурные особенности SMC-белков. б – Общая структура трехчастного когезинового кольца и взаимодействие с ним HAWK-субъединиц. в – Общая структура крючкообразных HAWK-субъединиц SMC-комплексов

Стабильная димеризация SMC-белков достигается за счет гомотипического взаимодействия между петлевыми доменами [17, 18]. Суперспиральные плечевые домены направлены в одну сторону от взаимодействующих петлевых доменов; таким образом, димер SMC1–SMC3 при отсутствии ATP представляет собой V-образную структуру с димеризованными петлевыми доменами на одном полюсе и парой разобщенных головных доменов – на другом [17, 20].

RAD21-Клейзиновая субъединица имеет длину порядка 500–700 а.о. с двумя структурированными доменами на N- и C-концах и протяженной, в значительной мере неупорядоченной, областью между ними [13]. N-Концевой домен клейзина взаимодействует с областью сочленения головного и плечевого доменов SMC3-субъединицы, а C-концевой – с головным доменом SMC1 (рис. 2, б) [21].

Молекулы трех коровых субъединиц когезина за счет устойчивых концевых взаимодействий образуют замкнутую кольцевую структуру [17, 22]. Вытянутая форма каждой из коровых субъединиц приводит к тому, что в некоторых конформациях когезин обладает пространным топологически замкнутым межсубъединичным компартментом, называемым S-K-кольцом (рис. 3, а). Просвет S-K-кольца, также называемый S-K-компартментом, может поддерживать сквозное прохождение глобулярных частиц диаметром порядка 10 нм [23, 24]. Показано, что через S-K-компартмент могут также проходить одна или две ДНК-нити, в этом случае кольцевой комплекс оказывается надет на ДНК как бисеринка на нить. В G2-фазе клеточного цикла за счет такого топологического взаимодействия молекул когезина с парами сестринских хроматид поддерживается когезия [7].

Рис. 3. Разнообразие конформационных состояний когезина. а – O-, E- и J-конфигурации головных доменов когезина и переходы между ними, RAD21-субъединица не показана для ясности рисунка. На пиктограммах обозначены S-K-кольцо и субкомпартменты (E-S, E-K и J-K), образуемые при взаимодействии головных доменов между собой. б – Основные конформационные состояния когезина, обнаруженные с помощью микроскопических методов

Петлевые домены SMC-белков представляют собой компактные структуры, состоящие из двух (N- и C-концевого) субдоменов α/β-класса, каждый из субдоменов имеет в своем составе небольшой β-лист [17, 18]. N-Концевой субдомен взаимодействует с C-концевым субдоменом своего димеризационного партнера с образованием единого составного β-листа. Таким образом, два петлевых домена в составе димера имеют пару взаимодействующих поверхностей. За счет того, что субдомены в составе каждого из петлевых доменов разделены небольшим желобом, димеризованные петлевые домены выглядят как тороидальная структура с вращательной псевдосимметрией второго порядка (рис. 2, б). Небольшой канал внутри димера петлевых доменов содержит группу функционально важных положительно заряженных аминокислот, которые, как предполагается, могут участвовать в электростатических взаимодействиях комплекса с ДНК. Асимметрия в гетеродимере SMC-субъединиц когезина позволяет различать две поверхности взаимодействия петлевых доменов между собой. Одну из них, более удаленную от головных доменов, принято называть северной, другую – южной (рис. 2, б).

Плечевой домен каждого из SMC-белков представляет собой пару антипараллельных суперспирализованных α-спиралей (coiled coil), каждая из которых состоит из 300–400 а.о. Суперспираль плечевого домена имеет дефекты, в которых одна или обе антипараллельных цепи теряют регулярную α-спиральную структуру [19]. Два таких разрыва в суперспирали плечевого домена обладают высокой эволюционной консервативностью и, по всей вероятности, играют важную роль в активности SMC-комплексов. Первый, расположенный около середины плечевого домена, чуть ближе к димеру петлевых доменов, получил название «локоть» (elbow) (рис. 2, а). Эта область обеспечивает механическую гибкость плечевых доменов: одновременное сгибание локтевых регионов обеих SMC-субъединиц комплекса может приводить к сближению петлевых доменов с головными доменами (рис. 3, б). Второй консервативный разрыв суперспирали находится вблизи головного домена, на расстоянии примерно 50 а.о., его принято называть «суставом» (joint) (рис. 2, а). «Суставы» SMC-субъединиц являются важными хабами взаимодействия с дополнительными субъединицами комплекса [25], также они принимают участие в движениях головных доменов друг относительно друга [26].

Головные домены SMC-белков представляют собой ATPазы ABC-типа [16, 27]. Как и другие ABC-белки, когезин способен гидролизовать ATP исключительно при физическом взаимодействии двух ATPазных доменов в составе димера (рис. 3, а) [28, 29]. Головной домен одной из субъединиц димера связывает ATP, а головной домен другой необходим для гидролиза связанной молекулы. Каждый цикл когезин-зависимого гидролиза ATP включает связывание ATP каждым из головных доменов, в результате чего в каждом цикле гидролиза расходуется две молекулы ATP. Взаимодействие головных доменов SMC-субъединиц прекращается при гидролизе нуклеозидтрифосфата и вновь устанавливается при связывании новой пары молекул ATP. Таким образом, в отличие от взаимодействия петлевых доменов между собой, димеризация головных доменов зависит от субстрата и носит динамический характер (рис. 3, а).

С точки зрения структуры ABC-ATPаза головного домена – это глобула, ядром которой является незамкнутый β-цилиндр с β-цепями, принадлежащими как N-, так и C-концевой части SMC-белка [9, 16, 28]. На одном из полюсов β-цилиндра располагаются две консервативные каталитически значимые последовательности: мотив Уокера А (также называемый P-петлей или фосфат-связывающей петлей) и мотив Уокера B. Оба этих мотива характерны не только для всех представителей суперсемейства ABC-ATPаз, но и для более обширной монофилетической группы белков, называемых «NTPазами с P-петлей» (P-loop NTPases) [27]. Мотив Уокера А, расположенный в N-концевой части, отвечает за связывание β- и γ-фосфатных групп молекулы ATP. Мотив Уокера B расположен в С-концевой части и отвечает за координацию Mg2+ в активном центре. В отличие от других «NTPаз с P-петлей», для эффективного гидролиза фосфатной связи ABC-ATPазами требуется сближение нуклеозидтрифосфата, связанного мотивами Уокера A и B, с остатком серина в составе так называемого SGG-мотива. SGG-Мотив также расположен в головном домене, но на сравнительно большом расстоянии от ATP-связывающего β-цилиндра, поэтому такое сближение невозможно в рамках головного домена SMC-мономера, оно может реализовываться только между ATP-связывающим участком одного головного домена и SGG-мотивом другого при их димеризации (рис. 3, а). По этой причине ATPазная активность когезина реализуется только при физическом взаимодействии головных доменов двух SMC-субъединиц в составе комплекса.

Структурированные N- и C-концевые домены RAD21 взаимодействуют с головными доменами двух SMC-белков асимметрично (рис. 2, б) [30]. N-Концевой домен RAD21 связывается с участком плечевой суперспирали, непосредственно выходящей из головного домена SMC3. Участок плечевого домена, с которым связывается N-концевой домен клейзина, расположенный между головным доменом и «суставом», называют «шеей» (neck). Фрагмент шейного участка суперспирали SMC3 взаимодействует с двумя N-концевыми α-спиралями RAD21 с образованием четырехспирального α-пучка [30, 31]. С-Концевой глобулярный домен RAD21 имеет укладку типа «крылатая спираль» (winged-helix fold) и взаимодействует с вершиной головного домена SMC1 [32].

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ HAWK-БЕЛКОВ С КЛЕЙЗИНОВОЙ СУБЪЕДИНИЦЕЙ

Коровый тример когезина взаимодействует с тремя дополнительными субъединицами: STAG1/2² (Scc3), PDS5A/B (Pds5) и NIPBL (Scc2). Дополнительные субъединицы участвуют в связывании комплекса с ДНК и регуляции его активности [1–3]. В значительной степени неупорядоченная центральная часть RAD21 является основным местом взаимодействия корового тримера с дополнительными субъединицами [33–35].

Все три дополнительные субъединицы когезина относятся к семейству HAWK-белков (HEAT proteins Associated With Kleisin, HEAT-белок, ассоциированный с клейзином) [15]. Это полностью α-спиральные структуры в форме крюков (рис. 2, в) [33, 36], состоящие из порядка 20 HEAT-повторов [37]. Каждый повтор состоит из 30–40 а.о., организованных в пару взаимодействующих антипараллельных амфипатических α-спиралей. α-Спирали каждого из HEAT-повторов уложены перпендикулярно оси крюка HAWK-субъединицы. Внутренняя часть изгиба крюка участвует во взаимодействии с клейзином.

STAG1/2 стабильно связывается с клейзином и, таким образом, является конститутивным компонентом комплекса [38]. NIPBL и PDS5A/B взаимодействуют с клейзином транзиентно; кроме того, две эти субъединицы конкурируют между собой за один сайт связывания [35]. Таким образом, в каждый момент времени комплекс может содержать одну (STAG1/2) или две (STAG1/2 + NIPBL или STAG1/2 + PDS5A/B) HAWK-субъединицы (рис. 2, б). Вхождение в состав когезина NIPBL или PDS5A/B кардинально изменяет активность комплекса [35]. NIPBL существенно повышает ATPазную активность комплекса [39, 40]. Эта субъединица абсолютно необходима для экструзионной активности когезина [40, 41]. PDS5A/B-Субъединица подавляет ATPазную активность, в ее присутствии к когезиновому кольцу может привлекаться белок WAPL, катализирующий отделение N-концевого участка RAD21 от SMC3-субъединицы [42, 43]. Ацетилирование SMC3-субъединицы, а также взаимодействия комплекса с другими компонентами хроматина, такими как инсуляторный белок CTCF, регулируют связывание NIPBL и PDS5A/B с когезиновым кольцом [25, 44–46].

КОНФОРМАЦИОННЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КОГЕЗИНОВОГО КОМПЛЕКСА

Функционирование всех белков так или иначе связано с лиганд-зависимыми изменениями конформации. SMC-Комплексы демонстрируют способность к радикальным конформационным перестроениям, которые и обеспечивают их моторную активность.

Разнообразные микроскопические техники, рентгеноструктурный анализ, а также непрямые методы определения конформации, такие как анализ ферстеровского переноса энергии (Förster Resonance Energy Transfer, FRET), химическое сшивание и анализ устойчивости ДНК-белковых комплексов к физико-химическим воздействиям, позволили задокументировать широкий спектр различных конформационных состояний когезина (рис. 3, б) [3, 4].

Все многообразие известных конформаций можно в значительной мере описать тремя параметрами: (1) наличием или отсутствием контакта между головными доменами двух SMC-субъединиц, (2) расстоянием между петлевыми и головными доменами, изменяющимся при сгибании «локтей», (3) расстоянием между плечевыми суперспиралями двух SMC-субъединиц. Так, в I-конформации и в сложенной конформации головные домены контактируют между собой, а плечевые суперспирали взаимодействуют по всей длине; отличие заключается в том, что в первой из конформаций плечевые домены находятся в выпрямленном состоянии, тогда как во второй – в полностью согнутом. O- и B-конформации отличаются от предыдущей пары отсутствием взаимодействий между плечевыми доменами (рис. 3, б).

Часть конформационных перестроений когезина строго сопряжена со связыванием или гидролизом ATP, другие – происходят спонтанно. Вероятно, направление некоторых спонтанных перестроений может контролироваться прохождением цикла связывания/гидролиза ATP.

Димеризация головных доменов и гидролиз ATP.

Связывание ATP индуцирует тесное взаимодействие между двумя головными доменами когезина, называемое E-состоянием (engaged state) [9, 28, 47]. Это короткоживущая структура, распадается при гидролизе ATP (рис. 3, а). За гидролизом ATP следует высвобождение продуктов гидролиза и изменение положения головных доменов друг относительно друга. Ранее считалось, что гидролиз ATP обязательно приводит к полному разобщению головных доменов, обозначаемому как O-состояние (open state). Однако оказалось, что даже при отсутствии ATP головные домены могут взаимодействовать в так называемом наложенном, J-состоянии (juxtaposed state), в котором SGG-мотивы двух SMC-белков оказываются сближены между собой [26, 48] (рис. 3, а). Так как это взаимодействие осуществляется за счет поверхностей, находящихся довольно далеко друг от друга в E-состоянии, переход из E-состояния в J-состояние и обратно сопряжен со значительным вращением головных доменов друг относительно друга.

Дополнительные конформационные изменения, сопряженные со связыванием и гидролизом ATP. Связывание ATP и взаимодействие головных доменов в E-состоянии сопряжено с несколькими важными конформационными перестроениями: локальным разобщением плечевых доменов, временной диссоциацией клейзина от SMC3 и формированием между двумя головными доменами дополнительного мостика, образованного NIPBL [25, 44, 49].

В J- и E-состоянии суперспирали плечевого домена, непосредственно отходящие от головных доменов, строго позиционированы друг относительно друга. Несмотря на относительную гибкость плечевых доменов, сравнительно протяженные участки суперспирали, прилегающие к головным доменам, оказываются конститутивно разобщенными в E-состоянии [25, 44, 49]. В то же время в J-состоянии положение головных доменов обеспечивает сближение суперспиральных участков SMC1 и SMC3 [26, 48]. Структурные данные указывают на то, что в J-состоянии плечевые домены контактируют друг с другом на всем протяжении (рис. 3, а). Таким образом, если при отсутствии ATP (в так называемой апо-форме) плечевые домены могут быть как разобщены, так и в разной степени взаимодействовать друг с другом, связывание ATP приводит к разобщению суперспиралей, по крайней мере в регионе, непосредственно прилегающем к головным доменам.

При взаимодействии головных доменов друг с другом в E- и J-состоянии единый S-K-компартмент разделяется на пару компартментов: S и K, ограниченных соответственно SMC-димером и клейзиновой субъединицей (рис. 3, а). В зависимости от того, какова природа взаимодействия головных доменов, различают следующие субкомпартменты: E-K, E-S, J-K и J-S, причем последний в силу плотного контакта между суперспиралями плечевых доменов фактически лишен просвета.

Еще одно изменение конформации когезина, ассоциированное со связыванием ATP в активном центре, – кратковременное открытие так называемых N-клейзиновых ворот комплекса. В момент образования E-состояния N-концевой домен RAD21 диссоциирует от своего сайта связывания на SMC3-субъединице [47, 49], что приводит к временному нарушению целостности компартмента E-K.

Связывание ATP приводит также к изменениям паттерна взаимодействия NIPBL с другими субъединицами. Помимо своего основного сайта связывания в центральной части клейзина, NIPBL имеет дополнительные ATP-регулируемые сайты взаимодействия с SMC-субъединицами. При отсутствии ATP NIPBL взаимодействует с димером петлевых доменов, связывание ATP приводит к диссоциации NIPBL от петлевых доменов и привлечению к головному домену SMC3 [50]. Этот перескок NIPBL, по-видимому, стимулирует образование E-состояния, в котором NIPBL также образует дополнительные контакты с головным доменом SMC1 [25, 44, 49]. Во взаимодействии NIPBL с головным доменом SMC3 важную роль играет пара консервативных остатков лизина SMC3: K105/K106 (K112/K113 – в Smc3 S. cerevisiae), ацетилирование которых ацетилтрансферазой ESCO2 (Eco1) является ключевым фактором стабилизации когезивного связывания. После гидролиза ATP NIPBL теряет связь с головными доменами и восстанавливает свое взаимодействие с петлевыми участками [50].

Спонтанные изменения конформации когезинового комплекса.

Микроскопические наблюдения, а также данные FRET указывают на то, что плечевые домены когезина и других SMC-комплексов являются довольно лабильными структурами главным образом за счет возможности сгибания в локтевых участках [17, 19, 49–51]. Амплитуда этого сгибания достигает 180°, с максимальным сближением головных и петлевых доменов в полностью согнутом состоянии (рис. 3, б).

Обнаружение J-состояния и осознание того факта, что переходы между E- и J-состояниями должны сопровождаться значительными изменениями во взаимном расположении плечевых доменов, привели к возникновению гипотезы, согласно которой сгибание и разгибание локтевых доменов может строго контролироваться циклом гидролиза ATP [19]. Однако полученные позже экспериментальные данные указывают на то, что сгибание и разгибание плечевых доменов происходит спонтанно [50].

Важнейшим следствием сгибания локтевых доменов является взаимодействие петлевых доменов с головными в полностью согнутом состоянии. Возможность временного взаимодействия между головными и петлевыми доменами лежит в основе многих механистических моделей, описывающих процесс SMC-зависимой экструзии [19, 50, 52, 53]. Несмотря на то что сгибание плечевых доменов само по себе спонтанно, есть указания на то, что может существовать храповой механизм, сопрягающий сгибание и гидролиз ATP. Так, предполагается, что полное сгибание локтевых доменов может быть необходимо для формирования E-состояния [25, 44, 49, 50].

Еще одним спонтанным изменением архитектуры когезина является взаимодействие суперспиральных участков плечевых доменов, прилежащих к петлевым доменам. Такое взаимодействие распространяется от петлевых доменов в сторону локтей и, возможно, ассоциировано с закручиванием двух плечевых суперспиралей друг относительно друга [50]. Это закручивание может быть необходимо для сгибания локтевых участков.

РАЗНООБРАЗИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ КОГЕЗИНА С ДНК

Связывание с ДНК – ключевой аспект активности SMC-комплексов. У взаимодействия SMC-комплексов с ДНК есть две характерные черты: (1) изменение аффинности к ДНК разных участков комплекса при изменении конформации и (2) способность комплексов топологически надеваться на ДНК.

В отличие от классического электростатического взаимодействия, характерного для большинства ДНК-связывающих белков, топологическое связывание представляет собой качественно отличную модальность нековалентного взаимодействия, в рамках которой нет необходимости в прямом физическом контакте между ДНК-нитью и белком [1, 44]. При топологическом связывании ДНК оказывается продетой через замкнутое S-K-кольцо комплекса как нить, продетая через бисеринку (рис. 4, а). Таким образом, даже при отсутствии дополнительных электростатических взаимодействий комплекс оказывается стабильно связан с ДНК.

Рис. 4. Топологическое взаимодействие когезинового кольца с ДНК. а – Топологическое (1) и псевдотопологическое (2) взаимодействие когезина с ДНК. На пиктограммах с помощью символов ● и + отражено направление прохождения ДНК-нити через плоскость рисунка, серой заливкой обозначено топологическое связывание. б – Методы выявления топологической природы взаимодействия между белковым комплексом и ДНК: анализ устойчивости связывания в буферах с высокой ионной силой (1); анализ чувствительности взаимодействия к протеолитическому расщеплению одной из субъединиц (2); анализ чувствительности к разрыву в молекуле ДНК (3); анализ устойчивости взаимодействия в денатурирующих условиях после ковалентной сшивки белкового кольца при помощи цистеин-специфических сшивающих агентов (BMOE, bBBr) (4). в – Два пути снятия когезинового кольца с ДНК, реализуемые в эукариотических клетках: WAPL-зависимый (1) и протеолитический (2)

Когезин может взаимодействовать с ДНК и более классическим электростатическим способом: несколько положительно заряженных участков на поверхности комплекса обеспечивают этот тип связывания (рис. 5) [3, 50]. Важным принципом электростатических взаимодействий когезина с ДНК является кооперативность: отдельные небольшие сайты, разбросанные по разным субъединицам, как правило, не способны образовывать стабильные контакты с ДНК, достаточной аффинностью обладают составные поверхности, образованные сближением нескольких ДНК-связывающих участков разных субъединиц. Такие составные поверхности собираются в одних конформациях когезина и разбираются – в других. Динамически образуемые и разрушаемые ДНК-связывающие сайты являются важным компонентом сопряжения процессов гидролиза ATP, изменений конформации комплекса и его движения вдоль нити ДНК при экструзии.

Рис. 5. Электростатические взаимодействия когезина с ДНК. а – Два гипотетических пути формирования «ДНК-захвата», предложенных для описания активности когезина S. cerevisiae (1) и Schizosaccharomyces pombe (2). На пиктограммах с помощью символов ● и + отражено направление прохождения ДНК-нити через плоскость рисунка, серой заливкой обозначено топологическое связывание. В парах пиктограмм, на левой отражено образование E-S- и E-K-субкомпартментов и положение ДНК-нитей относительно них, на правой – положение ДНК-нитей относительно S-K-кольца. Пунктирные части RAD21-субъединицы соответствуют областям, в которых путь белковой цепи для ясности рисунка показан условно (в действительности HAWK-субъединицы остаются связанными с RAD21 на всех представленных стадиях). б – Электростатические взаимодействия петлевых доменов когезина с ДНК. Показано три (не взаимоисключающих) сценария: опосредованное NIPBL-субъединицей взаимодействие (1), прямой контакт ДНК с внутренней поверхностью поры петлевых доменов (2) и прямой контакт ДНК с южным полюсом димера петлевых доменов (3). в – Взаимодействие HAWK-B субъединиц когезина (STAG1/2) и конденсина (CAP-G) с ДНК. Пептидная петля, называемая «ремнем безопасности», формируемая клейзиновой субъединицей конденсина (CAP-H), дополнительно стабилизирует связывание HAWK-B субъединицы (CAP-G) с ДНК

Топологическое надевание когезина на ДНК.

Когезин, как и едва ли не все другие SMC-комплексы, способен связывать ДНК топологически³. Три наблюдения легли в основу кольцевой гипотезы, согласно которой когезин может связывать ДНК топологически внутри трехчастного S-K-кольца [22, 54]: (1) структура комплекса, предполагающая наличие пространного топологически замкнутого компартмента [17, 55]; (2) способность к исключительно стабильным взаимодействиям с хроматином в G2-фазе [56, 57] и (3) моментальная дестабилизация этих взаимодействий при протеолизе клейзиновой субъединицы в анафазе [21, 58]. После более чем десятилетнего накопления косвенных свидетельств эта гипотеза была подтверждена напрямую, в экспериментах по ковалентному зашиванию когезиновых колец in vivo [7, 30, 48].

Ряд экспериментальных подходов был разработан для подтверждения топологического характера связывания белков и белковых комплексов с ДНК. На топологический характер взаимодействия могут указывать: (1) устойчивость связывания в буферах с высокой ионной силой [39, 56] (рис. 4, б (1)); (2) чувствительность взаимодействия к протеолитическому расщеплению одной из субъединиц комплекса [22, 39] (рис. 4, б (2)); (3) чувствительность к двухцепочечному разрыву в молекуле ДНК (в тех случаях, когда во взаимодействии участвует кольцевая молекула ДНК) [39, 59] (рис. 4, б (3)); (4) устойчивость взаимодействия в денатурирующих условиях после ковалентной сшивки белкового кольца [30, 60] (рис. 4, б (4)). Выводы, сделанные на основании результатов, полученных в рамках первых трех из упомянутых экспериментальных подходов, носят в значительной степени предварительный характер, в то время как эксперименты по ковалентной сшивке белковых колец позволяют уверенно делать выводы о модальности связывания комплекса с ДНК.

Наиболее строгие доказательства того, что SMC-комплексы способны топологически взаимодействовать с ДНК, были получены при изучении ковалентно сшитых S-K-колец [7, 60, 61]. Разрешение атомарной структуры трех участков взаимодействия между парами субъединиц S-K-кольца (димера петлевых доменов SMC1 и SMC3, N-концевого домена RAD21, взаимодействующего с шейным участком SMC3, и C-концевого домена RAD21, взаимодействующего с головным доменом SMC1) позволило методами генной инженерии модифицировать когезиновые комплексы так, чтобы S-K-компартменты могли быть ковалентно сшиты бифункциональными тиолспецифическими агентами типа бис-малеимидоэтана (BMOE) или дибромобимана (bBBr). Сшиваемость достигается за счет размещения трех пар цистеиновых остатков в перечисленных местах взаимодействия трех коровых субъединиц между собой таким образом, чтобы два цистеина в каждой паре были расположены на разных субъединицах комплекса на расстоянии не более 1 нм (рис. 4, б (4)). Длинные линейные молекулы геномной ДНК и кольцевые плазмиды, топологически взаимодействующие с модифицированными когезиновыми комплексами, после обработки сшивающими агентами не могут быть отделены от белкового тримера даже в жестких денатурирующих условиях, это позволяет легко детектировать такие молекулы ДНК по уменьшению электрофоретической подвижности. Существование топологически взаимодействующих с ДНК когезиновых комплексов не только в искусственных in vitro системах, но и в живых клетках было окончательно подтверждено с помощью подобного подхода [7, 30, 48]. Помимо обнаружения самого факта топологического взаимодействия SMC-комплексов с ДНК, использование тиолспецифического сшивания дополнительных цистеиновых пар позволяет установить, в каких именно субкомпартментах S-K-кольца (E-S, E-K, J-S или J-K) удерживается ДНК (рис. 3, а) [44, 48, 62].

Для понимания физиологической активности когезина чрезвычайно важным является изучение механизмов формирования и терминации топологических взаимодействий S-K-кольца с ДНК. Теоретически такое взаимодействие может устанавливаться и разрушаться при временном разобщении одного из трех нековалентных взаимодействий, формирующих S-K-кольцо: контакта петлевых доменов SMC3 и SMC1 (петлевых ворот), контакта между клейзином и SMC3-субъединицей (N-клейзиновых ворот) или контакта между клейзином и SMC1 (С-клейзиновых ворот) (рис. 4, а (1)). Кроме того, топологическое взаимодействие когезина с ДНК может разрушаться при протеолизе одной из коровых субъединиц комплекса.

Механизмы терминации топологического связывания когезина поняты сравнительно хорошо. Установлено, что непротеолитическое снятие комплекса с ДНК (рис. 4, в (1)) осуществляется консервативным ядерным белком WAPL (Wpl1) (winged-apart like) и сопряжено с открытием N-клейзиновых ворот [42, 63, 64]. С-Концевой структурированный домен WAPL состоит из восьми HEAT-повторов и может взаимодействовать с головными доменами SMC1 и SMC3, сближенными в E-состоянии. Неструктурированный N-концевой домен содержит консервативные YSR- и FGF-мотивы, участвующие во взаимодействии с HAWK-субъединицами PDS5A/B и STAG1/2 [43]. WAPL не является постоянным компонентом когезинового комплекса, но может транзиентно взаимодействовать с PDS5A/B-содержащими кольцами [42, 65]. Считается, что связывание WAPL и высвобождение ДНК происходит во время нахождения комплекса в E-состоянии. Формирование E-состояния всегда приводит к кратковременному открытию N-клейзиновых ворот, однако WAPL стабилизирует комплекс в таком открытом состоянии, что увеличивает вероятность выхода ДНК из кольца [43, 66]. Для выхода из S-K-кольца по этому механизму ДНК-нить должна быть предварительно перемещена в E-K-субкомпартмент. После высвобождения ДНК из комплекса происходит диссоциация WAPL и закрытие выходных ворот.

Топологическое взаимодействие когезина с ДНК разрушается также при протеолизе клейзиновой субъединицы в анафазе [21, 58, 67]. После прохождения анафазного чекпоинта сериновая протеаза сепараза разрезает центральную неструктурированную часть RAD21-субъединицы и таким образом высвобождает нити сестринских хроматид из топологического связывания с когезиновыми комплексами (рис. 4, в (2)).

Значительно меньше известно о том, как устанавливается топологическое связывание когезина с ДНК. В клетках и в in vitro системах способность когезина к гидролизу ATP, а также присутствие NIPBL и STAG1/2 необходимы для топологической погрузки комплекса [7, 44]. В то же время другие данные указывают на то, что по крайней мере in vitro комплекс PDS5A/B–WAPL может катализировать реакцию погрузки когезина на ДНК при отсутствии NIPBL-субъединицы [39, 68].

Неизвестными остаются не только детали механизма погрузки, но даже и то, какие именно ворота SMC-комплекса пропускают ДНК внутрь кольца. С одной стороны, считается, что образование E-состояния сопровождается временным открытием N-клейзиновых ворот, через которые нить ДНК может проходить внутрь S-K-компартмента [49]. С другой стороны, показано, что комплексы с ковалентно закрытыми N- или C-клейзиновыми воротами могут, несмотря ни на что, эффективно топологически надеваться на ДНК [7]. Кроме того, показано, что положительно заряженные аминокислотные остатки, расположенные внутри поры между петлевыми доменами SMC-белков, необходимы для установления топологического взаимодействия между когезином и ДНК, что указывает на возможную роль петлевых ворот в этом процессе [7, 8].

В рамках гипотезы топологического взаимодействия когезина с ДНК с самого начала предполагалось, что S-K-кольцо может заключать в себе одновременно две нити ДНК, обеспечивая таким образом когезию сестринских хроматид в G2-фазе клеточного цикла [22, 54]. Впоследствии такой механизм когезии был подтвержден экспериментально [7, 48]. Некоторые из обсуждаемых в настоящее время моделей когезин-зависимой экструзии предполагают, что основания растущей петли также представляют собой две нити ДНК, удерживаемые внутри одного S-K-кольца [26, 53, 62]. Такая петля, в ходе формирования которой S-K-компартмент остается постоянно замкнутым, не содержит истинного топологического зацепления между SMC-комплексом и ДНК-нитью и является примером так называемых псевдотопологических взаимодействий (рис. 4, а (2)). В отличие от топологического надевания когезина на ДНК, псевдотопологическое взаимодействие пока что является в большей степени умозрительной моделью, нежели наблюдаемым феноменом.

Топологически надетые когезиновые комплексы способны к пассивной одномерной диффузии по ДНК-нити [23, 24]. In vitro исследования показали, что размер поры когезина позволяет таким комплексам преодолевать небольшие ДНК-связанные белки при диффузии, однако нуклеосомные частицы диаметром 10 нм уже являются существенным препятствием, а частицы диаметром 20 нм становятся непреодолимыми барьерами для такого движения [23]. Предполагается, что псевдотопологически надетые когезиновые кольца также способны к диффузии по ДНК-нитям, удерживаемым внутри поры комплекса [40, 53].

«ДНК-захват»: транзиентное ATP-зависимое связывание головных доменов и NIPBL-субъединицы с ДНК.

Важнейшим открытием в структурной биологии когезина стало обнаружение связи между образованием E-состояния в присутствии ATP и связыванием ДНК. Было замечено, что когезиновые комплексы с EQ-мутациями в мотиве Уокера B (подавляющими ATPазную активность) в присутствии ATP, а также когезиновые комплексы дикого типа в присутствии негидролизуемых аналогов ATP образуют с ДНК стабильный комплекс, названный конфигурацией «ДНК-захвата» (gripping state/DNA clamping) [25, 44, 49]. Для образования такого комплекса также необходимо присутствие NIPBL, не являющегося постоянным компонентом когезина. Во время «захвата» двойная спираль взаимодействует с димеризованными головными доменами (рис. 5, а), кроме того, ДНК оказывается прижата к головному домену SMC3 при помощи NIPBL, который в присутствии ATP связывается с суставным участком плечевого домена SMC3 и головными доменами обеих SMC-субъединиц.

В конфигурации «захвата» сахарофосфатный остов ДНК образует серию электростатических взаимодействий с разными участками когезина: верхней поверхностью димера головных доменов SMC-субъединиц, ДНК-связывающей поверхностью NIPBL и N-концевым доменом RAD21. Все ДНК-связывающие сайты, участвующие в «ДНК-захвате», сближаются друг с другом и образуют небольшой канал, комплементарный связываемой двойной спирали ДНК, только на краткое время нахождения комплекса в конфигурации «захвата». После гидролиза ATP E-состояние распадается, а вместе с ним разбирается составная ДНК-связывающая поверхность. Таким образом, в комплексах дикого типа «захват» является короткоживущим состоянием, образование и разрушение которого сопряжено со связыванием и гидролизом ATP.

В присутствии ATP, ДНК, NIPBL и когезина дикого типа происходит периодическое сближение головных доменов SMC и NIPBL-субъединицы между собой; при замене ATP на негидролизуемый аналог или при внесении EQ-мутаций это сближение становится конститутивным [49, 50]. Примечательно также, что при связывании ATP ДНК сначала взаимодействует с головным доменом SMC3 и NIPBL-субъединицей в так называемом «предзахвате» (pre-engaged clamp), и только после этого происходит сближение головных доменов между собой с образованием полноценной конфигурации «захвата» (рис. 5, а (1)) [50].

При отсутствии ДНК головные домены SMC-белков способны динамически взаимодействовать между собой с быстрым образованием и разрушением E-состояния [49, 50]; добавление ДНК в систему не приводит к увеличению частоты таких взаимодействий [49, 50], однако значительно стимулирует ATPазную активность когезина [39, 40]. По всей видимости, ДНК увеличивает продуктивность взаимодействий между головными доменами за счет аллостерического влияния на активный центр и делает гидролиз ATP необходимым условием для разобщения головных доменов [50]. По этой причине каталитически неактивные (содержащие EQ-мутации) SMC-комплексы в присутствии ДНК и ATP оказываются замороженными в конфигурации «захвата» [44, 49].

Предложено два альтернативных сценария формировании «захвата». Данные, полученные с помощью тиолспецифического ковалентного перешивания когезина S. cerevisiae, показывают, что при формировании «захвата» ДНК-нить оказывается заключенной одновременно и в E-K-, и в E-S-субкомпартментах. В то же время ДНК-нить не обнаруживается внутри S-K-компартмента, таким образом, предполагается, что в этом случае S-K-кольцо псевдотопологически захватывает небольшую петлю ДНК (рис. 5, а (1)) [44]. Предполагается, что образование такого комплекса происходит за счет того, что ДНК подходит к когезину со стороны разомкнутых головных доменов и, проходя через них перед образованием E-состояния, оказывается одновременно заключенной в E-K- и в E-S-субкомпартментах (рис. 5, а (1)). В результате при формировании «захвата» S-K-кольцо не оказывается топологически надето на ДНК. На такой механизм указывают данные по кинетике входа ДНК в E-K- и E-S-субкомпартменты: для прохождения двух этих процессов достаточно очень короткой инкубации ДНК с когезином, и оба процесса при этом происходят с идентичной скоростью.

Результаты, полученные при изучении формирования «ДНК-захвата» когезином Schizosaccharomyces pombe, противоречат описанному выше сценарию [49]. Эти данные указывают на то, что небольшая ДНК-петля продевается внутрь S-K-кольца, после чего ближняя к головным доменам часть петли участвует в формировании «захваченного» состояния (рис. 5, а (2)). В момент образования головными доменами E-состояния N-клейзиновые ворота временно открываются и могут в редких случаях пропускать ДНК внутрь S-K-кольца. Таким образом, в рамках этой модели «ДНК-захват» может быть одним из интермедиатов реакции топологической погрузки. Однако в рамках этой модели нить ДНК, как правило, не проходит через N-клейзиновые ворота при формировании «захвата», и большинство циклов гидролиза ATP не приводят к топологической погрузке комплекса.

Расшифровка механизма формирования «ДНК-захвата» имеет центральное значение для понимания механизмов когезин-зависимой экструзии и связи экструзии с топологическим надеванием S-K-колец на ДНК [4, 5, 53].

Электростатические взаимодействия петлевых доменов с ДНК.

Димеризованные петлевые домены SMC-субъединиц когезина взаимодействуют с двухцепочечной ДНК электростатически [50, 69, 70]. При отсутствии ATP (в апо-форме комплекса) петлевые домены взаимодействуют с NIPBL [50], за счет чего, вероятно, образуется еще более сильный сайт, совмещающий ДНК-связывающие поверхности петлевых доменов и HAWK-субъединицы (рис. 5, б (1)). Связывание ATP головными доменами приводит к разрушению этого составного сайта и к уменьшению аффинности петлевых доменов к ДНК.

Достоверно не установлено, какие именно аминокислоты петлевых доменов участвуют в связывании ДНК (рис. 5, б (2 и 3)). Несмотря на то что консервативные положительно заряженные аминокислоты, выстилающие небольшую пору димера петлевых доменов, необходимы для прохода ДНК внутрь S-K-компартмента [7, 8], их физическое взаимодействие с ДНК до сих пор не было продемонстрировано. Пора слишком мала для того, чтобы удерживать внутри себя двухцепочечную ДНК; тем не менее некоторые авторы предполагают, что потеря контактов между петлевыми доменами на одном из полюсов димера может экспонировать внутреннюю поверхность поры для связывания ДНК [7, 71] (рис. 5, б (2)). Интересно, что одна из опубликованных структур когезинового комплекса в конфигурации «захвата» содержит петлевые домены с разобщенной северной димеризационной поверхностью [25].

По другим данным, за связывание с ДНК отвечают участки петлевых доменов на южном полюсе димера, смотрящие внутрь S-K-кольца, а также прилегающие к ним участки плечевых суперспиралей [50, 70] (рис. 5, б (3)).

Участие STAG1/2 во взаимодействии комплекса с ДНК.

В отличие от NIPBL, который, по всей видимости, контактирует с ДНК исключительно в рамках составных сайтов, кооперируясь с головными или петлевыми доменами, STAG1/2 является более-менее автономным ДНК-связывающим модулем (что, однако, не исключает участия в кооперативном связывании); так, есть указания на то, что STAG1/2 взаимодействует с ДНК в захваченном состоянии в непосредственной близости от места взаимодействия с ДНК NIPBL-субъединицы [25]. Аминокислотные остатки, отвечающие за взаимодействия STAG1/2 с ДНК, локализуются в областях, гомологичных соответствующим ДНК-связывающим патчам на поверхности NIPBL (рис. 5, в). Основной такой областью является положительно заряженный желоб на боковой поверхности длинного N-концевого субдомена крючкообразной молекулы [50, 72]. Интересно, что электростатическое взаимодействие CAP-G/ CAP-G2-субъединицы конденсина – гомолога STAG1/2 – с ДНК дополнительно стабилизировано за счет того, что клейзиновая субъединица CAP-H/CAP-H2 образует вокруг ДНК-нити, удерживаемой CAP-G/CAP-G2, нековалентно замкнутую пептидную петлю [62, 73, 74] (рис. 5, в). Эта петля, длиной порядка 100 а.о., называемая «ремнем безопасности», образована за счет контактов между двумя короткими гидрофобными фрагментами в срединной неглобулярной части клейзина. У клейзиновой субъединицы когезина, RAD21, по всей вероятности, отсутствует структура, подобная «ремню безопасности».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Некоторые характерные структурные особенности SMC-комплексов, такие как кольцевая архитектура и способность к топологическому надеванию на ДНК-нити, были описаны задолго до открытия процесса экструзии. Изучение способности когезина к топологическому надеванию на ДНК было сопряжено с выяснением молекулярных механизмов установления, поддержания и терминации когезии. Когезия, не связанная напрямую с экструзионной активностью, по всей видимости, является, скорее, исключением, чем правилом: подавляющее большинство физиологических активностей когезина и других SMC-комплексов зависит от их способности к активному формированию ДНК-петель. Тот факт, что эти белковые комплексы, как оказалось, являются в первую очередь моторными белками, привлек дополнительный интерес к изучению их структуры.

Именно стремление расшифровать молекулярный механизм экструзии мотивирует интерес к структуре когезина в последние годы. Успехи в этой области во многом связаны с развитием экспериментальных техник, позволяющих изучать динамически изменчивую и в известной степени полиморфную структуру массивных мультисубъединичных SMC-комплексов. К таким техникам, внесшим в последнее время наиболее существенный вклад в развитие представлений о структуре когезина, относятся криоэлектронная микроскопия [25, 44, 49], атомно-силовая микроскопия [50], FRET [49, 50] и методы реконструкции процесса экструзии in vitro и микроскопического наблюдения за ним в реальном времени [8, 40]. Эти методы позволили установить множество отдельных молекулярных деталей процесса экструзии. Важнейшими из такого рода открытий являются обнаружение того, что в ходе экструзии происходит периодическое ATP-зависимое образование структуры, названной «ДНК-захватом», а также установление роли NIPBL-субъединицы в формировании этой структуры.

К сожалению, отдельные наблюдения, структурные, биохимические и генетические, все еще не складываются в целостную модель, описывающую процесс экструзии хроматиновых петель когезином (механистические модели этого процесса, базирующиеся на имеющихся данных о структуре и активности SMC-комплексов, представлены во втором обзоре серии [10]). Есть все основания предполагать, что накопление эмпирических данных, в первую очередь структурных, в ближайшие годы приведет к окончательному установлению молекулярного механизма SMC-зависимой экструзии.

Вклад авторов. Голов А.К. – обобщение данных, написание первоначального текста рукописи; Гаврилов А.А. – постановка проблемы, руководство и редактирование текста.

Благодарности. Авторы благодарят Разина С.В. за глубокое и плодотворное обсуждение многих тем, затронутых в этом обзоре. Также авторы выражают признательность Головой А.В. за помощь в подготовке иллюстраций.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 21-64-00001).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

1В основном тексте указаны названия белков человека, в скобках (при первом упоминании) – названия гомологичных белков Saccharomyces cerevisiae.

2Геномы позвоночных, как правило, кодируют по паре паралогичных HAWK-субъединиц типа Scc3 и Pds5, экспрессирующихся в соматических клетках: STAG1/STAG2 и PDS5A/PDS5B. Эти паралоги в большинстве случаев структурно и функционально эквивалентны, поэтому далее в тексте мы будем использовать обозначения STAG1/2 и PDS5A/B.

3В определенных конформациях когезин в дополнение к S-K-кольцу способен образовывать топологически замкнутые субкомпартменты, в которых может находиться нить ДНК. К таким структурам относятся NIPBL-SMC3-субкомпартмент, E-S-, E-K- и J-K-субкомпартменты. Целостность таких субкомпартментов, в отличие от целостности S-K-кольца, обычно быстро нарушается. В тексте под топологическим связыванием мы всегда подразумеваем связывание внутри стабильного S-K-кольца.

About the authors

A. K. Golov

Author for correspondence.
Email: golovstein@gmail.com
Russian Federation, Moscow; Haifa, Israel

A. A. Gavrilov

Email: aleksey.a.gavrilov@gmail.com
Russian Federation, Москва

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Sister chromatid cohesion and DNA loop extrusion mediated by SMC complexes. a – Two basic cohesin activities: cohesion (1) and extrusion (2). b – Extrusion mediated by SMC complexes and the activity of type II DNA topoisomerases mediate post-replicative individualization of sister genomes in all cells, prokaryotic and eukaryotic.

Download (772KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Subunit structure of the cohesin complex. a – Folding and main structural features of SMC proteins. b – General structure of the three-part cohesin ring and interaction of HAWK subunits with it. c – General structure of hook-shaped HAWK subunits of SMC complexes

Download (902KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Diversity of conformational states of cohesin. a – O-, E- and J-configurations of cohesin head domains and transitions between them, RAD21 subunit is not shown for clarity of the figure. The pictograms indicate the S-K ring and subcompartments (E-S, E-K and J-K) formed by the interaction of the head domains with each other. b – Main conformational states of cohesin, revealed using microscopic methods

Download (714KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Topological interaction of the cohesin ring with DNA. a – Topological (1) and pseudo-topological (2) interaction of cohesin with DNA. The pictograms use ● and + symbols to reflect the direction of the DNA strand passing through the plane of the figure; topological binding is indicated by the gray fill. b – Methods for identifying the topological nature of the interaction between the protein complex and DNA: analysis of the stability of binding in buffers with high ionic strength (1); analysis of the sensitivity of the interaction to proteolytic cleavage of one of the subunits (2); analysis of sensitivity to a break in the DNA molecule (3); analysis of the stability of the interaction under denaturing conditions after covalent cross-linking of the protein ring using cysteine-specific cross-linking agents (BMOE, bBBr) (4). c – Two pathways for removing the cohesin ring from DNA, realized in eukaryotic cells: WAPL-dependent (1) and proteolytic (2)

Download (1MB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Electrostatic interactions of cohesin with DNA. a – Two hypothetical pathways of “DNA capture” formation proposed to describe the activity of cohesin in S. cerevisiae (1) and Schizosaccharomyces pombe (2). The pictograms use ● and + symbols to reflect the direction of DNA strand passage through the plane of the figure; topological binding is indicated by gray filling. The pairs of pictograms show the formation of E-S and E-K subcompartments and the position of DNA strands relative to them on the left one, and the position of DNA strands relative to the S-K ring on the right one. The dotted parts of the RAD21 subunit correspond to the regions in which the path of the protein chain is shown conditionally for clarity of the figure (in reality, the HAWK subunits remain bound to RAD21 at all stages shown). b – Electrostatic interactions of the loop domains of cohesin with DNA. Three (non-mutually exclusive) scenarios are shown: NIPBL-subunit-mediated interaction (1), direct DNA contact with the inner surface of the loop domain pore (2), and direct DNA contact with the south pole of the loop domain dimer (3). c – Interaction of the HAWK-B subunits of cohesin (STAG1/2) and condensin (CAP-G) with DNA. A peptide loop, called a “safety belt”, formed by the kleisin subunit of condensin (CAP-H), additionally stabilizes the binding of the HAWK-B subunit (CAP-G) to DNA.

Download (1MB)

Indexing metadata