The Mechanism of Mycobacterial (p)ppGpp Synthetase Inhibition by Synthetic Erogorgiaene Analog

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The synthesis of (p)ppGpp alarmones plays a vital role in the regulation of metabolism cessation, growth rate control, virulence, bacterial persistence, and biofilm formation. The RelA/SpoT homologs superfamily proteins are responsible for (p)ppGpp alarmone synthesis, including long bifunctional RSH proteins and small alarmone synthetases. This study employs enzyme kinetics and dose-dependent inhibition methods to investigate the specific mechanism of action of DMNP involving RelMsm and RelZ proteins, which are (p)ppGpp synthetases in Mycolicibacterium smegmatis belonging to both types, as well as RelMtb protein from Mycobacterium tuberculosis. The compound DMNP has demonstrated its capability to inhibit the activity of the RelMtb protein. According to enzyme kinetics analysis, DMNP acts as a noncompetitive inhibitor targeting the RelMsm and RelZ proteins. Molecular docking analysis allowed to localize the DMNP binding site in proximity to the (p)ppGpp synthetase domain active site. This study advances the development of alarmone synthetase inhibitor class of compounds, which includes relacin and its derivatives, alongside the investigated compound DMNP – a synthetic analog of the marine coral metabolite erogorgiaene. Unlike the conventional antibiotics, alarmone synthetase inhibitors target metabolic pathways linked to the stringent response. Although these pathways are not essential for bacteria, they regulate the development of adaptation mechanisms. Combining the conventional antibiotics that target actively growing cells with compounds that impede bacterial adaptation may potentially address prevailing challenges associated with antimicrobial resistance and bacterial persistence.

Full Text

Принятые сокращения: ДМНП – 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановая кислота; (p)ppGpp – гуанозинтетрафосфат и гуанозинпентафосфат; RSH – гомологи RelA/SpoT.

ВВЕДЕНИЕ

Механизмы адаптации бактерий способны противодействовать бактерицидному действию антибиотиков, обеспечивая выживание клеток возбудителя при лечении бактериальных инфекций. Одним из таких механизмов является персистенция – способность популяции бактерий формировать временно нерастущую субпопуляцию клеток-персистеров, нечувствительную к антибиотикам [1]. Клетки-персистеры переживают действие антибиотика благодаря замедлению клеточного метаболизма. После окончания курса лечения антибиотиком персистеры способны возобновить растущий фенотип. В результате этого многие бактериальные инфекции, такие как туберкулёз, характеризуются рецидивирующим течением, связанным с эндогенной реактивацией болезни [2, 3].

Риск рецидива способствует повышению необходимой продолжительности курса антибиотикотерапии [4]. Исследования демонстрируют, что укороченный курс терапии туберкулёза ведёт к большей доле рецидивов [5]. Кроме того, многие виды бактерий, в том числе микобактерии туберкулёза, формируют биоплёнки [6]. В глубоких слоях биоплёнок создаются условия истощения питательного субстрата, что способствует замедлению метаболизма и формированию персистерных клеток [7]. Регуляторные пути Mycobacterium tuberculosis, ассоциированные с образованием биоплёнок и персистенцией, делают вклад в формирование хронической туберкулёзной инфекции [6].

Таким образом, в терапии бактериальных инфекций возрастает потребность в новых средствах лечения, способных к преодолению механизмов адаптации бактерий. Одним из подходов к решению данных проблем может быть разработка соединений, воздействующих на строгий ответ, адаптивную реакцию бактерий на стресс, которая регулируется сигнальными молекулами алармонов гуанозинтетрафосфатом и гуанозинпентафосфатом ((p)ppGpp) [8]. Повышенные внутриклеточные концентрации алармонов (p)ppGpp ассоциированы с проявлениями персистенции, толерантности и резистентности у широкого диапазона видов бактерий. Напротив, устранение способности продуцировать алармоны у бактерий приводит к потере данных фенотипов [9]. Так, нокаутный штамм M. tuberculosis ΔrelMtb, неспособный к продукции (p)ppGpp, характеризуется сниженной толерантностью к изониазиду, нарушением адаптации к голоданию [10], нарушением способности к хронической инфекции в модели мышей и дефектом формирования биоплёнок [11]. Приведённые факты подтверждают важную роль строгого ответа в формировании свойств бактерий, затрудняющих лечение инфекции.

Синтез и гидролиз алармонов (p)ppGpp осуществляют преимущественно белки суперсемейства гомологов RelA/SpoT (RSH), среди которых выделяют две основные группы: длинные и короткие RSH (рис. 1). Длинные гомологи RelA/SpoT – группа в основном бифункциональных ферментов, способных как к синтезу, так и к гидролизу алармонов. Короткие гомологи RelA/SpoT включают две подгруппы: малые алармонсинтетазы, способные только к синтезу алармонов, и малые алармонгидролазы, способные только к их гидролизу [12].

 

Рис. 1. Доменный состав ферментов суперсемейства RSH, катализирующих синтез и гидролиз алармонов (p)ppGpp. Бифункциональные длинные RSH, такие как RelMsm из M. smegmatis и RelMtb из M. tuberculosis, включают гидролазный (HYD) и синтетазный (SYN) домены в каталитической доле, а также С-терминальный регуляторный домен (REG). Монофункциональные короткие RSH содержат либо гидролазный, либо синтетазный домен. RelZ из M. smegmatis является необычной малой алармонсинтетазой, так как содержит также домен РНКазы HII (HII)

 

Соединения класса ингибиторов алармонсинтетаз, такие как релацин [13] и его производные [14–16], аскорбиновая кислота [17], GSK-X9 [10], 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановая кислота (ДМНП) [18, 19], являются перспективными средствами противодействия адаптационным механизмам бактерий [20]. Ингибиторы алармонсинтетаз подавляют (p)ppGpp-синтезирующую активность ферментов суперсемейства RSH. Таким образом, ингибирование синтеза (p)ppGpp снижает клеточные процессы, индуцируемые алармонами, такие как вирулентность, образование биоплёнок и персистенция [20]. В данном исследовании проведён анализ ферментативной кинетики (p)ppGpp-синтетаз Mycolicibacterium smegmatis RelMsm (EC 2.7.6.5 и 3.1.7.2) и RelZ (EC 2.7.6.5) в присутствии ранее установленного ингибитора алармонсинтетаз ДМНП [18, 19]. Кроме того, проведён анализ подавления активности белка M. tuberculosis RelMtb (EC 2.7.6.5 и 3.1.7.2) для дальнейшего изучения эффектов этого ингибитора.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование генов relMsm и relZ M. smegmatis и relMtb M. tuberculosis в экспрессионный вектор. Для продукции исследуемых белков сконструированы рекомбинантные плазмиды pET23b-relNTD, pET23b-relZ и pET23b-relMtb. Вставки кодирующих последовательностей генов амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы Phusion («Thermo Fisher Scientific», США) на матрице лизата M. smegmatis MC2155 для генов relMsm и relZ либо инактивированной культуры M. tuberculosis H37Rv для гена relMtb. Праймеры для ПЦР в этом исследовании синтезированы компанией «Евроген» (Россия) (табл. 1). Пара праймеров, relMsm (pET) NdeI и relNTD (pET) HindIII, амплифицирует область N-терминального домена гена relMsm и разработана на основе публикации Jain et al. [21], где описан минимальный фрагмент белка RelMsm, сохраняющий (p)ppGpp-синтетазную активность – RelNTD. Вставка полноразмерного гена relZ амплифицирована с использованием праймеров relZ (pET) NdeI и relZ (pET) HindIII. Вставка кодирующей последовательности гена relMtb получена в реакции с праймерами relMtb (pET) NdeI и relMtb (pET) HindIII. Вставка relNTD клонирована напрямую в pET23b. Вставка relZ клонирована в промежуточный вектор pAL2 («Евроген»), вставка relMtb – в промежуточный вектор pTZ57R («Thermo Fisher Scientific») при помощи ТА-клонирования. Для этого к вставке добавляли адениловые концы в ходе реакции с Taq-полимеразой. Клонирование в pET23b проводили путём осаждения ДНК вставки этанолом, обработки вектора и вставки рестриктазами NdeI и HindIII, а затем Т4 ДНК-лигазой («Thermo Fisher Scientific»). Наличие ожидаемых вставок в pET23b верифицировано ПЦР, а затем секвенированием с использованием стандартных праймеров T7 promoter и T7 terminator, а также с праймерами, специфичными средней области соответствующих генов: relZ seq и relMtb seq. Полученными плазмидами со слиянием кодирующих последовательностей генов с С-терминальным 6xHisTag трансформировали штамм Escherichia coli BL21(DE3).

 

Таблица 1. Названия и последовательности праймеров для ПЦР

Название

Последовательность (5′→3′)

relMsm (pET) NdeI

gGGgGGTGACAcatATGGTCGACGAGCCAG

relNTD (pET) HindIII

GTGAACACGAAaAgCTtCTGCGTGGCG

relZ (pET) NdeI

TGGAcAtATGCACCACCCCCCGT

relZ (pET) HindIII

aGCAagCTtGGCCTGCAGCTTCTCGA

relMtb (pET) NdeI

acacataTGGCCGAGGACCAGCTCACGGC

relMtb (pET) HindIII

tgaaagcttCGCGGCCGAGGTCACCCGGTA

relZ seq

CGCCTCGACCAAAAGTGAGCT

relMtb seq

GATGGCGGTATAGAGTGCTGACA

Примечание. Сайты рестрикции подчёркнуты, некомплементарные матрице нуклеотиды приведены в нижнем регистре.

 

Продукция и очистка белков. Культуры E. coli BL21(DE3) с плазмидой pET23b-relNTD, pET23b-relZ или pET23b-relMtb выращивали в пробирках со средой LB с 50 мкг/мл ампициллина до оптической плотности 0,6–1,0 при 600 нм, далее хранили при 4 °С и использовали для инокуляции в колбы. Для этого 2 мл культуры центрифугировали, осаждённые клетки ресуспендировали и переносили в колбу с 50 мл свежей среды LB с ампициллином, культивировали при 37 °С при вращении 120 об./мин. При достижении культурой оптической плотности 0,3–0,6 добавляли 0,2 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид. Спустя 3–4 ч после индукции при 30 °С культуру центрифугировали и удаляли среду. Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера для белков (20 мM Tris-HCl/500 мМ NaCl, pH 7,4) и разрушали при воздействии ультразвука на льду в течение 30 с по 3 раза при амплитуде 35% с перерывами в 30 с, затем центрифугировали в течение 5 мин при 15 000 g при 4 °С для разделения растворимой и нерастворимой фракций. Белки очищали при помощи набора HisPur Ni-NTA Spin Purification Kit («Thermo Fisher Scientific»). Растворимую фракцию белка с добавлением 5 мМ имидазола наносили на предварительно уравновешенную буфером для белков (5 мМ имидазол) центрифужную колонку с Ni-NTA-агарозой, инкубировали при мягком качании на льду в течение 30–60 мин для связывания гистидиновых меток белков с ионом никеля. Раствор с несвязавшимися белками удаляли центрифугированием 2 мин при 700 g и 4 °С. Затем связавшийся белок промывали 2 мл буфера для белков (25 мМ имидазол). Оставшуюся фракцию белка смывали с колонки в 3 этапа 200 мкл буфера для белков (250–500 мМ имидазол). Полученные растворы белков анализировали при помощи Ds-Na-ПААГ-электpофоpеза относительно стандарта Precision Plus Protein Dual Xtra («Bio-Rad», США). Концентрацию белка оценивали при помощи cпектрофотометра NanoDrop 2000C («Thermo Fisher Scientific»). Коэффициенты экстинкции и молекулярную массу белков рассчитывали при помощи инструмента Expasy ProtParam.

Определение активности алармонсинтетаз. Реакционная смесь c белком RelNTD (35 мкл) включала 40 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 1 мМ дитиотреитол, 10 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 27 мМ (NH4)2SO4, 5%-ный метанол (v/v), 0 или 600 мкМ ДМНП, 0–3000 мкМ GTP, 4 мМ ATP, 1–2 мкМ RelNTD (0,5 ч инкубации при 37 °С) [18]. Реакционная смесь с RelZ (35 мкл) включала 40 мМ Tris-HСl, рН 7,4, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl, 5%-ный метанол (v/v), 0 или 600 мкМ ДМНП, 0–4000 мкМ GDP, 4 мМ ATP, 1–2 мкM RelZ (0,5 ч инкубации при 37 °С), согласно публикации Murdeshwar и Chatterji [22] с некоторыми модификациями. Реакции по ингибированию RelMtb в диапазоне концентраций ДМНП проводили в условиях, описанных в публикации Singal et al. [23] с некоторыми модификациями. В реакционную смесь (70 мкл) включали 40 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 1 мМ дитиотреитол, 15 мМ MgCl2, 1 мМ GTP, 4 мМ ATP, 0,5–1 мкM RelMtb, 0 или 5%-ный метанол (v/v), 0–600 мкМ ДМНП (0,5 ч инкубации при 37 °С). Для остановки реакции к образцам добавляли 1/10 объёма пробы 0,4 N хлорной кислоты, затем центрифугировали их при 15 000 g в течение 5 мин для удаления преципитата. Супернатант разводили в 4 раза в деионизированной воде. Концентрации нуклеотидов в образцах определяли посредством обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии по методу, описанному в литературе [18, 24]. Хроматографический анализ проводили на системе LC-20A («Shimadzu», Япония), образцы разделяли на колонке Luna C18 (5 мкм, 250 мм × 4,6 мм) («Phenomenex», США), подвижная фаза – раствор 0,5%-ного CH3CN/99,5%-ного 50 мМ KH2PO4, рН 4,6. Идентификацию пиков проводили в области спектра 254 нм на основании сравнения времени удержания нуклеотидов в реакционных смесях и в растворах нуклеотидов GTP, GDP, ATP, AMP («Sigma-Aldrich», США). Активность ферментов (p)ppGpp-синтетаз количественно оценивали по изменению концентрации субстрата GTP (RelMtb) или продукта AMP (RelNTD, RelZ).

Анализ in silico. База данных AlphaFold (https:// alphafold.ebi.ac.uk/) послужила источником пред- сказанных трёхмерных структур (p)ppGpp-синтетаз RelMtb (P9WHG9), RelMsm (A0QWJ6) и RelZ (A0R4I7). Инструмент Protein Structure Alignment от «Schrödinger Maestro» использовали для пространственного выравнивания белков-мишеней. Расчёты молекулярного докинга проводились с помощью сервера Blind Docking Server (http:// bio-hpc.eu/software/blind-docking-server/).

Статистический анализ. Для визуализации и статистической обработки данных по ферментативной кинетике при помощи нелинейной регрессии использовали программу GraphPad Prism 8.0. Выбор при сравнении моделей по уравнению Михаэлиса–Ментен или уравнению Хилла осуществляли при помощи информационного критерия Акаике. Значимость различий в параметрах уравнения оценивали при помощи t-теста. При оценке нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. Данные графиков представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, а данные в таблице параметров уравнения Хилла представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Для визуализации и статистической обработки данных по ингибированию белка RelMtb использовали пакет Python Seaborn. При определении концентрации полумаксимального ингибирования ([I]50) использовали расчёт по функции с 3 параметрами с помощью Quest Graph IC50 Calculator.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Ферментативная кинетика длинной (p)ppGpp-синтетазы/гидролазы RelMsm. Для изучения механизма ранее установленного ингибиторного действия ДМНП [18] проведены эксперименты по ферментативной кинетике N-терминального домена длинной бифункциональной (p)ppGpp-синтетазы/гидролазы RelMsm. Данный белок RelNTD имеет N-терминальные гидролазный и синтетазный домены, но лишён С-терминального регуляторного домена. Он представляет собой минимальную каталитически активную форму RelMsm, демонстрирующую повышенную (p)ppGpp-синтетазную активность [21].

Активность RelNTD анализировали в диапазоне концентраций субстрата GTP от 0 до 3000 мкМ при добавке 600 мкМ ДМНП в сравнении с контролем без ингибитора. RelMsm катализирует (p)ppGpp- синтетазную реакцию, протекающую согласно урав- нению GTP/GDP + ATP ↔ pppGpp/ppGpp + AMP [25]. Cкорость реакции определяли по изменению концентрации продукта AMP в реакционной смеси (рис. 2, а).

 

Рис. 2. Влияние ингибитора ДМНП на ферментативную кинетику (p)ppGpp-синтетаз M. smegmatis. a – Хроматографический анализ нуклеотидов в образцах, взятых из ферментативной реакции с RelNTD спустя: 1 – 0 ч или 2 – 0,5 ч (детекция при 254 нМ, 1 мМ GTP, 4 мМ ATP). б – Анализ ферментативной кинетики N-терминального домена белка RelMsm из M. smegmatis. Приведены кривые зависимости скорости реакции (расчёт на 1 мкмоль белка) от концентрации субстрата GTP: 1 – в отсутствии добавки ингибитора; 2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП. в – Ds-Na-ПААГ-электpофоpез очищенного фермента RelNTD. г – Хроматографический анализ нуклеотидов в образцах, взятых из ферментативной реакции с RelZ спустя: 1 – 0 ч или 2 – 0,5 ч (детекция при 254 нМ, 1 мМ GDP, 4 мМ ATP). д – Анализ ферментативной кинетики малой алармонсинтетазы RelZ из M. smegmatis. Приведены кривые зависимости скорости реакции (расчёт на 1 мкмоль белка) от концентрации субстрата GDP: 1 – в отсутствии добавки ингибитора; 2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП. е – Ds-Na-ПААГ-электpофоpез очищенного фермента RelZ. ж – График Хилла для реакции с RelZ: 1 – в отсутствии добавки ингибитора; 2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП

 

Результаты экспериментов по ферментативной кинетике демонстрируют способность ДМНП подавлять активность RelNTD (рис. 2, б). ДМНП способен к ингибированию очищенного N-терминального домена белка RelMsm (рис. 2, в), не теряя активности в отношении варианта белка без С-терминального домена. Таким образом, предполагаемое место связывания ДМНП локализуется в области синтетазного или гидролазного доменов RelMsm, но не в области регуляторного домена.

При помощи метода нелинейной регрессии произведён фиттинг уравнений зависимости скорости реакции от концентрации субстрата GTP, согласно уравнению Михаэлиса–Ментен и согласно уравнению сигмоидной кривой Хилла (рис. 2, б), и определены параметры функции (табл. 2, а). Сравнение двух моделей по информационному критерию Акаике продемонстрировало большее совпадение экспериментальных данных по RelNTD с моделью по уравнению Михаэлиса–Ментен (вероятность корректности модели – 76,6% без добавки и 76,8% с добавкой ДМНП). Исследователи, ранее проводившие эксперименты по ферментативной кинетике полноразмерного белка RelMsm, обнаружили, что данные описываются уравнением Хилла [15].

 

Таблица 2. Параметры уравнения в зависимости от концентрации ингибитора ДМНП

Белок RelNTD – параметры уравнения Михаэлиса–Ментен

Концентрация ДМНП, мкМ

Vmax, мкмоль/мин

KGTPm, мкМ

R2

0

18,5 ± 2,3

1760 ± 218

0,95

600

14,2 ± 2,6

2412 ± 376

0,95

Белок RelZ – параметры уравнения Хилла

Концентрация ДМНП, мкМ

Vmax, мкмоль/мин

KGDP0,5, мкМ

h

R2

0

9,3 ± 0,7

1447 ± 172

1,8 ± 0,2

0,97

600

6,5 ± 0,9

2105 ± 310

2,2 ± 0,4

0,96

 

Расчёт значимости различий в параметрах в отсутствии и в присутствии ДМНП по t-тесту показывает, что значения максимальной скорости реакции Vmax имеют статистически значимые различия (p = 0,01), в отличие от константы Михаэлиса KGTPm (p = 0,13). Таким образом, ДМНП является неконкурентным ингибитором в отношении N-терминального домена длинного RSH-белка RelMsm. В то же время ранее в научных публикациях описывались ингибиторы алармонсинтетаз только с конкурентным [15] или смешанным [15, 17] типами ингибирования.

Ферментативная кинетика малой алармонсинтетазы RelZ. Помимо длинного RSH-белка RelMsm, нами исследована также ферментативная кинетика малой алармонсинтетазы M. smegmatis RelZ, в отношении которой ДМНП также является ингибитором [19]. Монофункциональная (p)ppGpp-синтетаза RelZ катализирует реакцию GTP/GDP/GMP + ATP → pppGpp/ppGpp/pGpp + AMP. В качестве субстрата использовали GDP, к которому RelZ имеет большую аффинность по сравнению с GTP [25]. Активность RelZ анализировали в диапазоне концентраций субстрата ATP от 0 до 4000 мкМ в присутствии 600 мкМ ДМНП или в его отсутствии. Скорость реакции определяли по изменению концентрации продукта AMP (рис. 2, г).

Результаты экспериментов по ферментативной кинетике RelZ демонстрируют способность ДМНП ингибировать очищенный фермент (рис. 2, д, е). Параметры кривых зависимости скорости реакции от концентрации субстрата также просчитаны как для уравнения Хилла (табл. 2, б), так и для уравнения Михаэлиса–Ментен. Сравнение моделей по критерию Акаике продемонстрировало большее совпадение экспериментальных данных с моделью по уравнению Хилла (вероятность корректности модели – 99,7% без добавки и 99,8% с добавкой ДМНП). ДМНП не оказывает влияние на кооперативное связывание субстрата белком RelZ (рис. 2, ж).

Расчёт по t-тесту значимости различий в параметрах катализируемой RelZ реакции в присутствии ДМНП или в его отсутствии (табл. 2, б) демонстрирует следующие результаты: значения Vmax имеют статистически значимые различия (p = 0,02), в отличие от KGDP0,5 и коэффициента Хилла (p = 0,07 и p = 0,39 соответственно). Таким образом, ДМНП является неконкурентным ингибитором как в отношении длинной алармонсинтетазы RelMsm, так и в отношении малой алармонсинтетазы RelZ.

Анализ подавления активности RelMtb. В результате выравнивания последовательностей аминокислот белков RelMsm и RelMtb посредством BLASTp обнаружена высокая степень совпадений в 95%. Поэтому далее мы исследовали способность ДМНП подавлять pppGpp-синтезирующую активность RelMtb, основной и единственной функциональной (p)ppGpp-синтетазы/гидролазы M. tuberculosis [26]. Результаты исследования демонстрируют способность ДМНП подавлять активность RelMtb (рис. 3). Активность фермента снижается по мере увеличения концентрации ДМНП. Кроме того, активность RelMtb возрастает при добавлении 5%-ного метанола приблизительно на 40%. Ранее эффект увеличения (p)ppGpp-синтезирующей активности при добавке метанола в реакционную смесь обнаруживали при анализе активности RelA [27], RelMsm [18] и RelZ [19]. Расчёт концентрации полумаксимального ингибирования [I]50 на основании полученных данных указывает значение в 362 мкМ ДМНП. Таким образом, ДМНП способен подавлять активность фермента строгого ответа у микобактерии туберкулёза и потому имеет потенциал применения при антибиотикотерапии туберкулёзной инфекции.

 

Рис. 3. pppGpp-Синтезирующая активность длинного RSH-белка RelMtb из M. tuberculosis в диапазоне концентраций ДМНП (0–600 мкМ) в 5%-ном метаноле. Скорость реакции оценивается по изменению концентрации субстрата GTP. MetOH- – реакция без добавки метанола и ДМНП

 

Молекулярный докинг ДМНП со структурами (p)ppGpp-синтетаз, предсказанными AlphaFold. Перспективным подходом к выявлению механизмов действия новых соединений является сочетание предсказаний структур посредством AlphaFold с моделированием молекулярного докинга для анализа взаимодействия белок-лиганд [28]. Чтобы установить вероятное место связывания ингибитора ДМНП на поверхности (p)ppGpp-синтетаз, мы провели анализ с использованием молекулярного докинга in silico. Структуры экспериментально установленных белков-мишеней (RelMtb, RelMsm, RelZ) были получены с помощью базы данных предсказанных структур белков AlphaFold [29]. Данные белки относятся к одному суперсемейству RSH [12] и потому характеризуются значительной долей совпадений последовательности аминокислот (RelMsm с RelMtb: 95%; RelZ с RelMsm/RelMtb: 29,27%). Исходя из этого, было выдвинуто предположение об общем механизме действия ДМНП в отношении исследуемых белков. В результате пространственного выравнивания трёх белков-мишеней идентифицированы области структурного сходства. Для малой алармонсинтетазы RelZ не характерны гидролазный и регуляторный домены, которые присутствуют у длинных RSH-белков RelMsm и RelMtb [30]. В свою очередь, длинные RSH не имеют домена РНКазы HII, специфического для RelZ [22]. Структурное сходство было обнаружено в областях синтетазного домена, характерного для всех трёх белков-мишеней (рис. 4). Аминокислоты этих областей в трёхмерных структурах RelMtb, RelMsm и RelZ были изолированы и использованы для расчётов молекулярного докинга ДМНП ко всей выделенной поверхности белков при помощи сервера Achilles Blind Docking Server [31].

 

Рис. 4. Пространственное выравнивание и результаты молекулярного докинга трёхмерных структур белков-мишеней M. tuberculosis RelMtb (синий), M. smegmatis RelMsm (фиолетовый) и RelZ (жёлтый), предсказанных AlphaFold. SYN – синтетазный домен; HYD – гидролазный домен; CTD – регуляторный C-терминальный домен; TGS – домен TGS; HII – домен РНКазы HII. Кластеры связывания ДМНП (зелёный): 1 – соответствующий активному сайту синтетазного домена, 2 – располагающийся вблизи активного сайта синтетазного домена

 

По результатам расчётов выявлены вероятные сайты связывания ДМНП на поверхности белков (рис. 4). Кластер № 1 имеет эффективные энергии связывания (RelMtb: −7,6 ккал/моль, RelMsm: −7,2 ккал/моль, RelZ : −5,4 ккал/моль) и соответствует активному центру синтетазного домена (рис. 4). В данном кластере ДМНП характеризуется взаимодействиями с аминокислотами Arg242 и Tyr309 RelMtb, которые ответственны за связывание субстрата GTP/GDP и модификация которых приводит к потере активности [26]. Однако взаимодействие в данном сайте не согласуется с экспериментальными данными ферментативной кинетики, указывающими на неконкурентный механизм действия ДМНП, который не препятствует взаимодействию фермента с субстратом. Кластер № 2 имеет сходные энергии связывания (RelMtb: −6,3 ккал/моль, RelMsm: −6,7 ккал/моль, RelZ: −5,8 ккал/моль) и располагается вблизи активного центра (p)ppGpp-синтетаз (рис. 4). Связывание ДМНП в данной области не препятствует связыванию субстрата, но может приводить к субоптимальной каталитической активности белков-мишеней, что согласуется с неконкурентным типом ингибирования, обнаруженным в экспериментальных исследованиях.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данной работе мы продемонстрировали способность ДМНП подавлять (p)ppGpp-синтезирующую активность микобактериальных белков семейства RelA/SpoT-гомологов в экспериментах с очищенными белками в условиях in vitro. Ингибиторная активность ДМНП исследована не только в отношении длинных RSH-белков RelMsm из M. smegmatis (рис. 2, б) и RelMtb из M. tuberculosis (рис. 3), но и в отношении короткого RSH-белка – малой алармонсинтетазы M. smegmatis RelZ (рис. 2, д). Несмотря на то что существование малых алармонсинтетаз было обнаружено сравнительно недавно [32], уже накоплен массив данных, касающихся их значимой роли в метаболизме алармонов (p)ppGpp и в адаптивных механизмах у Staphylococcus aureus [33], Vibrio cholerae [34], а также многих других видов бактерий [12]. Однако способность соединений из класса ингибиторов алармонсинтетаз подавлять не только длинные, но и малые алармонсинтетазы до сих пор исследована недостаточно: известно лишь то, что релацин оказался неспособен подавлять активность малой алармонсинтетазы RelQ из Enterococcus faecalis [35]. Таким образом, экспериментальные данные о способности ДМНП подавлять активность малой алармонсинтетазы RelZ из M. smegmatis могут указывать на перспективу применения этого соединения для более полноценного подавления строгого ответа видов бактерий, имеющих, помимо длинных RSH-белков, также и малые алармонсинтетазы.

В предыдущей работе мы исследовали активность соединения ДМНП в отношении полноразмерного белка RelMsm [18], а в данной работе показана способность ДМНП подавлять активность RelMsm, лишённого регуляторного домена (RelNTD) (рис. 2, б). Тот факт, что ДМНП сохраняет свою активность в отсутствии регуляторного домена, локализует наиболее вероятное место его связывания в гидролазном или синтетазном домене RelMsm (рис. 1).

При исследовании ферментативной кинетики N-терминального домена RelMsm в диапазоне концентрации субстрата GTP было обнаружено соответствие данных кривой по уравнению Михаэлиса–Ментен, в то время как ферментативная кинетика полноразмерного RelMsm в данных литературы [15] соответствовала уравнению Хилла. Уравнение Хилла обычно используется для описания кинетики кооперативных ферментов с аллостерической регуляцией. Отсутствие кооперации у изолированного N-терминального домена RelMsm указывает на ключевую роль C-терминального регуляторного домена для аллостерической регуляции активности RelMsm, так как RelNTD демонстрирует неспособность к олигомеризации в отличие от полноразмерного RelMsm [21].

Алармоны связывают RelMsm в аллостерическом сайте в C-терминальном домене, для которого показана способность взаимодействовать с pppGpp [36]. Для RelMsm продемонстрирован механизм отрицательной обратной связи, когда pppGpp, ppGpp или pGpp подавляют его синтетическую активность [25]. Кроме того, недавние исследования обнаружили наличие аллостерического сайта связывания pppGpp между гидролазной и синтетазной областями N-терминального домена RelA из E. coli и Rel из Bacillus subtilis, который также участвует в положительной регуляции синтетазной активности [37].

Малая алармонсинтетаза RelZ продемонстрировала сигмоидальную кинетику (рис. 2, д) с h = 1,8 ± 0,2 (табл. 2, б). В растворе этот фермент существует в гексамерной форме, которая является необходимой для его активности [38]. Олигомерная структура RelZ может служить основой для кооперативного связывания. Ранее сигмоидальная кинетика наблюдалась также для малой алармонсинтетазы RelQ из S. aureus с коэффициентом Хилла в диапазоне от 1,2 ± 0,3 до 2,1 ± 0,4 в зависимости от субстрата и добавленного алармона [39]. Для RelZ описано ингибирование активности посредством продукта pppGpp, но не ppGpp, который образуется при конверсии субстрата GDP [25]. Кроме того, для малой алармонсинтетазы SAS1 B. subtilis показана положительная регуляция посредством связывания pppGpp в аллостерическом сайте [40].

Исследования ферментативной кинетики белков RelMsm и RelZ при воздействии ингибитора ДМНП в диапазоне концентраций субстрата позволили установить его тип ингибирования в отношении данных белков (рис. 2, б, д). ДМНП характеризуется неконкурентным типом ингибирования в отношении обеих алармонсинтетаз, то есть не конкурирует с субстратами GDP и GTP за активный сайт синтетазного домена (табл. 2). Описанные в литературе ингибиторы алармонсинтетаз, для которых проводились исследования ферментативной кинетики, обладают отличным от ДМНП типом ингибирования: конкурентный тип у аналога релацина AC [15], смешанный тип у витамина С [17] и аналога релацина AB [15].

В экспериментах по дозозависимому ингибированию in vitro установлена способность ДМНП подавлять активность синтеза pppGpp фермента RelMtb из M. tuberculosis. Соединение GSK-X9, для которого также установлена активность in vitro в отношении N-терминальной области белка RelMtb, демонстрирует способность снижать вызываемую голоданием толерантность M. tuberculosis к антибиотику изониазиду [10]. Хотя ДМНП характеризуется менее эффективным значением концентрации полумаксимального ингибирования [I]50 в 362 мкМ в сравнении с мощным ингибитором X9 ([I]50 = 16 мкМ), полученным в результате высокопроизводительного скрининга, ДМНП обладает более широким спектром установленных мишеней (p)ppGpp-синтетаз микобактерий и имеет потенциал применения при разработке соединений, воздействующих на персистенцию бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По результатам проведённых исследований можно сделать вывод о том, что механизм действия аналога эрогоргиаена ДМНП заключается в неконкурентном связывании (p)ppGpp-синтетаз микобактерий. ДМНП проявляет активность в отношении длинных RSH-белков M. smegmatis RelMsm и M. tuberculosis RelMtb, а также короткого RSH-белка малой алармонсинтетазы M. smegmatis RelZ, подавляя их (p)ppGpp-синтезирующую активность. Таким образом, ДМНП является представителем класса ингибиторов алармонсинтетаз. Данный класс потенциально может иметь клиническое значение для борьбы с рецидивирующими бактериальными инфекциями, сложность лечения которых обусловлена, среди прочего, механизмами, ассоциированными с алармонами (p)ppGpp: персистенцией бактерий, толерантностью к антибиотикам и способностью к образованию биоплёнок.

Вклад авторов. Р.Ю. Сидоров – конструирование плазмид, наработка и выделение белков, проведение экспериментов, обсуждение результатов исследования, написание текста; А.Г. Ткаченко – концепция и руководство работой, редактирование текста статьи.

Финансирование. Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (госзадание 124020500028-4).

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам лаборатории органического синтеза Пермского государственного национального исследовательского университета за работу по химическому синтезу ДМНП.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

×

About the authors

R. Yu. Sidorov

Perm Federal Research Center, the Ural Branch of Russian Academy of Sciences; Perm State University

Author for correspondence.
Email: sidorov.r@iegm.ru
Russian Federation, Perm; Perm

A. G. Tkachenko

Perm Federal Research Center, the Ural Branch of Russian Academy of Sciences; Perm State University

Email: sidorov.r@iegm.ru
Russian Federation, Perm; Perm

References

  1. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., and Balaban, N. Q. (2016) Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment, Nat. Rev. Microbiol., 14, 320-330, https://doi.org/10.1038/nrmicro.2016.34.
  2. Shao, Y., Song, H., Li, G., Li, Y., Li, Y., Zhu, L., Lu, W., and Chen, C. (2021) Relapse or re-infection, the situation of recurrent tuberculosis in Eastern China, Front. Cell. Infect., 11, 638990, https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.638990.
  3. Rosser, A., Marx, F. M., and Pareek, M. (2018) Recurrent tuberculosis in the pre-elimination era, Int. J. Tuberc. Lung Dis., 22, 139-150, https://doi.org/10.5588/ijtld.17.0590.
  4. Mandal, S., Njikan, S., Kumar, A., Early, J. V., and Parish, T. (2019) The relevance of persisters in tuberculosis drug discovery, Microbiology (Reading), 165, 492-499, https://doi.org/10.1099/mic.0.000760.
  5. Grace, A. G., Mittal, A., Jain, S., Tripathy, J. P., Satyanarayana, S., Tharyan, P., and Kirubakaran, R. (2019) Shortened treatment regimens versus the standard regimen for drug-sensitive pulmonary tuberculosis, Cochrane Database Syst. Rev., 12, CD012918, https://doi.org/10.1002/14651858.CD012918.pub2.
  6. Niño-Padilla, E. I., Velazquez, C., and Garibay-Escobar, A. (2021) Mycobacterial biofilms as players in human infections: a review, Biofouling, 37, 410-432, https://doi.org/10.1080/08927014.2021.1925886.
  7. Nguyen, D., Joshi-Datar, A., Lepine, F., Bauerle, E., Olakanmi, O., Beer, K., McKay, G., Siehnel, R., Schafhauser, J., Wang, Y., Britigan, B. E., and Singh, P. K. (2011) Active starvation responses mediate antibiotic tolerance in biofilms and nutrient-limited bacteria, Science, 334, 982-986, https://doi.org/10.1126/science.1211037.
  8. Gupta, K. R., Arora, G., Mattoo, A., and Sajid, A. (2021) Stringent response in Mycobacteria: from biology to therapeutic potential, Pathogens (Basel, Switzerland), 10, 1417, https://doi.org/10.3390/pathogens10111417.
  9. Hobbs, J. K., and Boraston, A. B. (2019) (p)ppGpp and the stringent response: an emerging threat to antibiotic therapy, ACS Infect. Dis., 5, 1505-1517, https://doi.org/10.1021/acsinfecdis.9b00204.
  10. Dutta, N. K., Klinkenberg, L. G., Vazquez, M. J., Segura-Carro, D., Colmenarejo, G., Ramon, F., Rodriguez-Miquel, B., Mata-Cantero, L., Porras-De Francisco, E., Chuang, Y.-M., Rubin, H., Lee, J. J., Eoh, H., Bader, J. S., Perez-Herran, E., Mendoza-Losana, A., and Karakousis, P. C. (2019) Inhibiting the stringent response blocks Mycobacterium tuberculosis entry into quiescence and reduces persistence, Sci. Adv., 5, eaav2104, https://doi.org/10.1126/sciadv.aav2104.
  11. Weiss, L. A., and Stallings, C. L. (2013) Essential roles for Mycobacterium tuberculosis Rel beyond the production of (p)ppGpp, J. Bacteriol., 195, 5629-5638, https://doi.org/10.1128/JB.00759-13.
  12. Atkinson, G. C., Tenson, T., and Hauryliuk, V. (2011) The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life, PLoS One, 6, e23479, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0023479.
  13. Wexselblatt, E., Oppenheimer-Shaanan, Y., Kaspy, I., London, N., Schueler-Furman, O., Yavin, E., Glaser, G., Katzhendler, J., and Ben-Yehuda, S. (2012) Relacin, a novel antibacterial agent targeting the stringent response, PLoS Pathog., 8, e1002925, https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002925.
  14. Wexselblatt, E., Kaspy, I., Glaser, G., Katzhendler, J., and Yavin, E. (2013) Design, synthesis and structure-activity relationship of novel Relacin analogs as inhibitors of Rel proteins, Eur. J. Med. Chem., 70, 497-504, https:// doi.org/10.1016/j.ejmech.2013.10.036.
  15. Syal, K., Flentie, K., Bhardwaj, N., Maiti, K., Jayaraman, N., Stallings, C. L., and Chatterji, D. (2017) Synthetic (p)ppGpp analogue is an inhibitor of stringent response in mycobacteria, Antimicrob. Agents Chemother., 61, e00443-17, https://doi.org/10.1128/AAC.00443-17.
  16. Beljantseva, J., Kudrin, P., Jimmy, S., Ehn, M., Pohl, R., Varik, V., Tozawa, Y., Shingler, V., Tenson, T., Rejman, D., and Hauryliuk, V. (2017) Molecular mutagenesis of ppGpp: turning a RelA activator into an inhibitor, Sci. Rep., 7, 41839, https://doi.org/10.1038/srep41839.
  17. Syal, K., Bhardwaj, N., and Chatterji, D. (2017) Vitamin C targets (p)ppGpp synthesis leading to stalling of long-term survival and biofilm formation in Mycobacterium smegmatis, FEMS Microbiol. Lett., 364, fnw282, https:// doi.org/10.1093/femsle/fnw282.
  18. Tkachenko, A. G., Kashevarova, N. M., Sidorov, R. Y., Nesterova, L. Y., Akhova, A. V., Tsyganov, I. V., Vaganov, V. Yu., Shipilovskikh, S. A., Rubtsov, A. E., and Malkov, A. V. (2021) A synthetic diterpene analogue inhibits mycobacterial persistence and biofilm formation by targeting (p)ppGpp synthetases, Cell Chem. Biol., 28, 1420-1432.e9, https:// doi.org/10.1016/j.chembiol.2021.01.018.
  19. Sidorov, R. Yu., and Tkachenko, A. G. (2023) DMNP, a synthetic analog of erogorgiaene, inhibits the ppGpp synthetase activity of the small alarmone synthetase RelZ, BIO Web Conf., 57, 08002, https://doi.org/10.1051/ bioconf/20235708002.
  20. Danchik, C., Wang, S., and Karakousis, P. C. (2021) Targeting the Mycobacterium tuberculosis stringent response as a strategy for shortening tuberculosis treatment, Front. Microbiol., 12, 744167, https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.744167.
  21. Jain, V., Saleem-Batcha, R., China, A., and Chatterji, D. (2006) Molecular dissection of the mycobacterial stringent response protein Rel, Protein Sci., 15, 1449-1464, https://doi.org/10.1110/ps.062117006.
  22. Murdeshwar, M. S., and Chatterji, D. (2012) MS_RHII-RSD, a dual-function RNase HII-(p)ppGpp synthetase from Mycobacterium smegmatis, J. Bacteriol., 194, 4003-4014, https://doi.org/10.1128/JB.00258-12.
  23. Singal, B., Balakrishna, A. M., Nartey, W., Manimekalai, M. S. S., Jeyakanthan, J., and Grüber, G. (2017) Crystallographic and solution structure of the N-terminal domain of the Rel protein from Mycobacterium tuberculosis, FEBS Lett., 591, 2323-2337, https://doi.org/10.1002/1873-3468.12739.
  24. Akhova, A. V., and Tkachenko, A. G. (2019) HPLC-UV method for simultaneous determination of adenosine triphosphate and its metabolites in Mycobacterium smegmatis, Acta Chromatogr., 31, 45-48, https:// doi.org/10.1556/1326.2017.00344.
  25. Petchiappan, A., Naik, S. Y., and Chatterji, D. (2020) RelZ-mediated stress response in Mycobacterium smegmatis: pGpp synthesis and its regulation, J. Bacteriol., 202, e00444-19, https://doi.org/10.1128/JB.00444-19.
  26. Bag, S., Das, B., Dasgupta, S., and Bhadra, R. K. (2014) Mutational analysis of the (p)ppGpp synthetase activity of the Rel enzyme of Mycobacterium tuberculosis, Arch. Microbiol., 196, 575-588, https://doi.org/10.1007/s00203-014-0996-9.
  27. Pedersen, F. S., and Kjeldgaard, N. O. (1977) Analysis of the relA gene product of Escherichia coli, Eur. J. Biochem., 76, 91-97, https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1977.tb11573.x.
  28. Wong, F., Krishnan, A., Zheng, E. J., Stärk, H., Manson, A. L., Earl, A. M., Jaakkola, T., and Collins, J. J. (2022) Benchmarking AlphaFold-enabled molecular docking predictions for antibiotic discovery, Mol. Syst. Biol., 18, e11081, https://doi.org/10.15252/msb.202211081.
  29. Varadi, M., Anyango, S., Deshpande, M., Nair, S., Natassia, C., Yordanova, G., Yuan, D., Stroe, O., Wood, G., Laydon, A., Žídek, A., Green, T., Tunyasuvunakool, K., Petersen, S., Jumper, J., Clancy, E., Green, R., Vora, A., Lutfi, M., Figurnov, M., Cowie, A., Hobbs, N., Kohli, P., Kleywegt, G., Birney, E., Hassabis, D., and Velankar, S. (2022) AlphaFold Protein Structure Database: massively expanding the structural coverage of protein-sequence space with high-accuracy models, Nucleic Acids Res., 50, D439-D444, https://doi.org/10.1093/nar/gkab1061.
  30. Steinchen, W., and Bange, G. (2016) The magic dance of the alarmones (p)ppGpp, Mol. Microbiol., 101, 531-544, https://doi.org/10.1111/mmi.13412.
  31. Sánchez-Linares, I., Pérez-Sánchez, H., Cecilia, J. M., and García, J. M. (2012) High-throughput parallel blind virtual screening using BINDSURF, BMC Bioinformatics, 13, S13, https://doi.org/10.1186/1471-2105-13-S14-S13.
  32. Nanamiya, H., Kasai, K., Nozawa, A., Yun, C. S., Narisawa, T., Murakami, K., Natori, Y., Kawamura, F., and Tozawa, Y. (2008) Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis, Mol. Microbiol., 67, 291-304, https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.06018.x.
  33. Salzer, A., Keinhörster, D., Kästle, C., Kästle, B., and Wolz, C. (2020) Small alarmone synthetases RelP and RelQ of Staphylococcus aureus are involved in biofilm formation and maintenance under cell wall stress conditions, Front. Microbiol., 11, 575882, https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.575882.
  34. Dasgupta, S., Basu, P., Pal, R. R., Bag, S., and Bhadra, R. K. (2014) Genetic and mutational characterization of the small alarmone synthetase gene relV of Vibrio cholerae, Microbiology (Reading), 160, 1855-1866, https://doi.org/ 10.1099/mic.0.079319-0.
  35. Gaca, A. O., Kudrin, P., Colomer-Winter, C., Beljantseva, J., Liu, K., Anderson, B., Wang, J. D., Rejman, D., Potrykus, K., Cashel, M., Hauryliuk, V., and Lemos, J. A. (2015) From (p)ppGpp to (pp)pGpp: characterization of regulatory effects of pGpp synthesized by the small alarmone synthetase of Enterococcus faecalis, J. Bacteriol., 197, 2908-2919, https://doi.org/10.1128/JB.00324-15.
  36. Syal, K., Joshi, H., Chatterji, D., and Jain, V. (2015) Novel pppGpp binding site at the C-terminal region of the Rel enzyme from Mycobacterium smegmatis, FEBS J., 282, 3773-3785, https://doi.org/10.1111/febs.13373.
  37. Roghanian, M., Van Nerom, K., Takada, H., Caballero-Montes, J., Tamman, H., Kudrin, P., Talavera, A., Dzhygyr, I., Ekström, S., Atkinson, G. C., Garcia-Pino, A., and Hauryliuk, V. (2021) (p)ppGpp controls stringent factors by exploiting antagonistic allosteric coupling between catalytic domains, Mol. Cell, 81, 3310-3322.e6, https://doi.org/ 10.1016/j.molcel.2021.07.026.
  38. Krishnan, S., Petchiappan, A., Singh, A., Bhatt, A., and Chatterji, D. (2016) R-loop induced stress response by second (p)ppGpp synthetase in Mycobacterium smegmatis: functional and domain interdependence, Mol. Microbiol., 102, 168-182, https://doi.org/10.1111/mmi.13453.
  39. Yang, N., Xie, S., Tang, N. Y., Choi, M. Y., Wang, Y., and Watt, R. M. (2019) The Ps and Qs of alarmone synthesis in Staphylococcus aureus, PLoS One, 14, e0213630, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213630.
  40. Steinchen, W., Schuhmacher, J. S., Altegoer, F., Fage, C. D., Srinivasan, V., Linne, U., Marahiel, M. A., and Bange, G. (2015) Catalytic mechanism and allosteric regulation of an oligomeric (p)ppGpp synthetase by an alarmone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 13348-13353, https://doi.org/10.1073/pnas.1505271112.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Domain composition of RSH superfamily enzymes catalysing the synthesis and hydrolysis of alarmones (p)ppGpp. Bifunctional long RSHs, such as RelMsm from M. smegmatis and RelMtb from M. tuberculosis, include hydrolase (HYD) and synthetase (SYN) domains in the catalytic domain, as well as a C-terminal regulatory domain (REG). Monofunctional short RSHs contain either a hydrolase or synthetase domain. RelZ from M. smegmatis is an unusual small alarmonsynthetase because it also contains an HII RNase (HII) domain

Download (107KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Effect of DMNP inhibitor on the enzymatic kinetics of (p)ppGpp-synthetases of M. smegmatis. a - Chromatographic analysis of nucleotides in samples taken from the enzymatic reaction with RelNTD after: 1 - 0 h or 2 - 0.5 h (detection at 254 nM, 1 mM GTP, 4 mM ATP). b - Analysis of the enzymatic kinetics of the N-terminal domain of the RelMsm protein from M. smegmatis. The curves of reaction rate dependence (calculated per 1 μmol of protein) on the concentration of substrate GTP are given: 1 - in the absence of inhibitor addition; 2 - when 600 μM DMNP was added. c - Ds-Na-PAAG electrophoresis of purified RelNTD enzyme. d - Chromatographic analysis of nucleotides in samples taken from the enzymatic reaction with RelZ after 1 - 0 h or 2 - 0.5 h (detection at 254 nM, 1 mM GDP, 4 mM ATP). e - Enzymatic kinetics analysis of the small RelZ alarmonsynthetase from M. smegmatis. The curves of reaction rate dependence (calculated per 1 μmol of protein) on the substrate concentration GDP are shown: 1 - in the absence of inhibitor addition; 2 - when 600 μM DMNP was added. f - Ds-Na-PAAG electrophoresis of purified RelZ enzyme. g - Hill plot for the reaction with RelZ: 1 - in the absence of inhibitor addition; 2 - when 600 μM DMNP was added

Download (384KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. pppGpp-Synthesising activity of the long RSH protein RelMtb from M. tuberculosis over a range of DMNP concentrations (0-600 μM) in 5% methanol. The reaction rate is estimated by the change in the concentration of the substrate GTP. MetOH- - reaction without methanol and DMNP addition

Download (94KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Spatial alignment and molecular docking results of three-dimensional structures of M. tuberculosis RelMtb (blue), M. smegmatis RelMsm (purple) and RelZ (yellow) target proteins predicted by AlphaFold. SYN, synthetase domain; HYD, hydrolase domain; CTD, regulatory C-terminal domain; TGS, TGS domain; HII, HII RNase domain. DMNP binding clusters (green): 1 - corresponding to the active site of the synthetase domain, 2 - located near the active site of the synthetase domain

Download (756KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».