Non-invasive recording of electroretinogram from both compound eyes in the cockroach Periplaneta americana L. in response to light stimuli

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The paper presents an original method of non-invasive registration of electroretinogram from both compound eyes of an insect. The method demonstrated high reliability and repeatability of the results. Using this method, it was shown that the magnitude of the light responses obtained from mutant cockroaches devoid of screening pigment, pearl, was about 4 times greater than those of wild-type insects. The time to peak of the response decreased with increasing light intensity, both for short-wavelength and long-wavelength stimuli. The pearl cockroaches exhibited a faster time to peak response than wild-type cockroaches; the results of covariance analysis indicate that these differences cannot be fully explained by an increase in the number of photons reaching the photoreceptor membranes and suggest additional differences in the compound eye physiology of mutant and wild-type insects. The positive voltage wave after the end of light stimulation depends on light intensity and reflects hyperpolarization of receptor cells. The photovoltaic effect, which distorts the amplitude and the shape of the response can be eliminated by using a gold wire as a recording electrode.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Свет, попадающий в глаз насекомого, запускает в фоторецепторных клетках каскад фототрансдукции, приводящий к изменению мембранного потенциала.

Суммарная реакция многих фоторецепторов, а иногда и постсинаптических нейронов, может быть зарегистрирована с поверхности глаза в виде внеклеточного сигнала — электроретинограммы (ЭРГ) (Schirmer at al., 2014; Dolph et al., 2011; Wu et al., 2022). Основной орган зрения насекомых — сложные (фасеточные) глаза, состоящие из множества омматидиев, включающих несколько фоторецепторных клеток разных спектральных классов, фоторецепторные мембраны которых образуют рабдом, и вспомогательных клеток (Грибакин, 1981). В большинстве работ применялись инвазивные методики отведения ЭРГ, при которых регистрирующий электрод вводится внутрь глаза через отверстие, вырезанное в кутикуле (Kugel, 1977; Gribakin, 1988; French et al., 2015; Crook et al., 2014; 2022; Schirmer at al., 2014). Глаз таракана имеет сложную форму, нерегулярные ряды фасеток и разную длину фоторецепторов в разных участках глаза (Butler, 1973 a, b), что приводит к регистрации крайне вариабельной по амплитуде и кинетике ЭРГ (French et al., 2015) в зависимости от местоположения электрода. Кроме того, используя инвазивные методы, сложно или вовсе невозможно выполнять длительную или повторную регистрацию электрической активности глаз одного и того же животного, что существенно ограничивает решаемые с помощью этого метода задачи.

Количество фотонов, попадающих на фоторецепторные мембраны, зависит от присутствия и распределения экранирующего пигмента, оптически изолирующего рабдомы друг от друга (Грибакин, 1981). Показано, что амплитуда ЭРГ у белоглазых пчел с мутацией snow была примерно в 10 раз больше, чем у пчел дикого типа (Gribakin, 1988), а у синей мясной мухи Calliphora vicina (erythrocephala) — в 2—5 раз (Chen et al., 1999). Белоглазые мутанты с отсутствующим экранирующим пигментом демонстрируют более узкие пики спектральной чувствительности, чем особи дикого типа (Gribakin, Ukhanov, 1990; Gribakin,1988; Gribakin et al., 1996). Ранее было показано, что белоглазые тараканы более чувствительны к свету, избегая его при существенно меньших интенсивностях (Kelly, Mote, 1990). Однако чувствительность отдельных фоторецепторов, измеренная в электрофизиологических экспериментах, оказалась сниженной, предположительно вследствие уменьшения общей площади поверхности фоторецепторных мембран (Saari et al., 2018).

Другая проблема, с которой сталкиваются исследователи при отведении электрических ответов на свет серебряными и, особенно, хлорсеребряными электродами, — фотоэффект, появляющийся при взаимодействии коротковолнового освещения большой интенсивности с материалом электрода. Чтобы минимизировать не связанные с физиологическими ответами артефакты световой стимуляции, предлагались разные решения — от использования ватных фитилей для регистрации биопотенциалов до использования искусственного интеллекта для вычитания артефактов (Sieving et al., 1978; Mikulovic et al., 2016; Fabetti et al., 2021). Однако ватные фитили подсыхают, в результате чего не подходят для длительной и/или многократной регистрации ЭРГ от глаз насекомого, а искусственный интеллект нуждается в большом количестве хорошо определенных примеров для машинного обучения, которые сложно получить из-за вариабельности фотоэффекта и ответов глаза.

Мы предлагаем новый неинвазивный метод отведения ЭРГ от сложных глаз таракана Periplaneta americana L. и применяем его для записи длительного протокола с предъявлением световых стимулов с максимумами излучения 525 и 365 нм, соответствующим максимумам чувствительности зрительных пигментов этого вида (Mote, Goldsmith, 1970). Для оценки влияния экранирующего пигмента на параметры ЭРГ были использованы белоглазые мутанты pearl, у которых такой пигмент отсутствует (Ross et al., 1964). В задачи работы также входило сравнение наиболее часто используемого неполяризуемого хлорсеребряного электрода с поляризуемым золотым электродом, особенно в области высокоинтенсивной УФ-стимуляции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Насекомые. Нимф последнего возраста мужского пола таракана Periplaneta americana L. (Insecta: Blattodea: Blattidae) отсаживали от основной колонии и содержали в климатической камере Sanyo MLR-352H при инвертированном фоторежиме 12L:12D, температуре 24–28 °C (ночь–день) и относительной влажности 60%. Камера была оборудована люминесцентными лампами с максимальным излучением при 450, 540, 610 нм, цветовая температура 5 200°К. Пластиковые садки (45 л) с насекомыми были снабжены картонными укрытиями, кормом и водой. Белоглазые тараканы с мутацией pearl (Ross et al., 1964) и тараканы дикого типа содержались в одинаковых условиях. В экспериментах использовали имаго возрастом от двух недель.

Электроретинография. Непосредственно перед началом скотофазы таракана фиксировали в плексигласовом боксе, закрепив шею в вырезе передней стороны бокса, чтобы голова оставалась свободной, аналогично описанному ранее способу (Zhukovskaya, 2012), и оставляли в светонепроницаемой коробке на час для темновой адаптации. Индифферентный электрод из нержавеющей стали был вмонтирован в шейный вырез и контактировал с шеей насекомого через ватный тампон, смоченный в растворе Рингера (Zhukovskaya, 2012). Регистрирующий электрод изготавливали из серебряной проволоки толщиной 0.5 мм и хлорировали в течение 1 мин непосредственно перед экспериментом в растворе следующего состава: CuSO4 × 5H2O – 10 г; NaCl – 10 г.; H2SO4 (концентрированная) — 2.5 мл.; вода — до 100 мл, а затем накладывали на поверхности обоих сложных глаз и фиксировали концы пластилином к боксу. В части экспериментов использовали золотой электрод, изготовленный из проволоки Зл 99.99 диаметром 0.5 мм (SilverSalt, ГОСТ 7222–2014). Ротовые органы и антенны также фиксировали пластилином для уменьшения помех. Для улучшения контакта щель между поверхностью глаза и электродом заполняли электропроводящим гелем Vidisic® Gel (Bausch and Lomb, Сингапур) или Uniagel (Гельтек, Россия). Все манипуляции проводили при темно-красном свете налобного фонаря. Подготовленный препарат оставляли в темноте на 10 мин, а затем начинали отведения.

Система световой стимуляции состояла из двух независимых каналов на основе мощных светодиодов с пиками излучения с λmax = 525 нм (зеленый) и 365 нм (ультрафиолетовый, УФ). Свет от зеленого светодиода к глазам таракана подавался через программно-переключаемые нейтральные светофильтры (с оптической плотностью (ND – 1, 2, 3.5)) по световоду, интенсивность света дополнительно регулировалась током светодиода. УФ стимул на глаза таракана подавался с УФ-светодиода, расположенного в непосредственной близости от головы животного. Интенсивность УФ-света регулировалась током светодиода и добавлением/удалением одного нейтрального фильтра (ND3.0). Интенсивность света обоих длин волн контролировали с помощью измерителя мощности света 843-R/843-R-USB (Newport, optoelectronic technologies Wuxi Co Ltd, China), помещаемого для измерения на место головы таракана.

Регистрируемый электрический сигнал, проходя через дифференциальный усилитель (модель 3000, A-M Systems, США, входное сопротивление 1 015 Ом), пропускалась через аналоговый фильтр низких частот (3 кГц) и регистрировалась с частотой дискретизации 10 мс/точку. Сбор данных, а также интенсивность, время и длительность стимуляции контролировали с использованием аналого-цифрового преобразователя и программного обеспечения, написанного в среде LabView (National Instruments, Austin, TX) (Goriachenkov et al., 2021).

Протоколы экспериментов. Световые стимулы предъявлялись последовательно с возрастающей интенсивностью, начиная с зеленого света, после чего аналогичным образом выполняли УФ-стимуляцию (чтобы избежать адаптации зеленочувствительных (широкополосных) рецепторов ультрафиолетом (Frolov et al., 2022)) (табл. 1).

 

Таблица 1. Интенсивности световой стимуляции глаз таракана монохроматическим светом при регистрации ЭРГ

№ п/п

525 нм

365 нм

Фотоны/мм2/мс

Стимул, мс

Фотоны/мм2/мс

Стимул, мс

1

1.7 × 104

10

2.8 × 106

1

2

4.3 × 104

5

3

1.1 × 105

10

4

2.7 × 105

7.1 × 106

5

2.1 × 106

1.8 × 107

6

5.3 × 106

4.5 × 107

7

1.3 × 107

1.1 × 108

8

3.2 × 107

2.9 × 109

9

8.2 × 107

7.2 × 109

10

2.1 × 108

1.8 × 1010

11

4.2 × 108

4.5 × 1010

12

8.2 × 108

1.1 × 1011

13

50

50

14

100

100

15

500

500

 

Длительность стимула составляла 10 мс для большинства случаев, 1 или 5 мс для УФ-света низкой интенсивности и 50, 100 и 500 мс для максимальной интенсивности. В случае низкой и средней интенсивности стимулы предъявлялись по 10 раз для последующего усреднения, чтобы улучшить соотношение “сигнал–шум”. Стимулы высокой интенсивности предъявлялись меньшее количество раз для снижения влияния световой адаптации на результаты. Интервал между стимулами составлял не менее 15 с.

Обработка данных и статистика. С использованием специализированной программы, написанной в среде LabView, корректировали нулевую линию и выполняли низкочастотную фильтрацию с применением 8-полюсного фильтра Бесселя на частоте 20 Гц. Амплитуда ЭРГ рассчитывалась как минимальное значение потенциала в период 0–0.2 c после начала действия стимула. Время до пика определяли как абсциссу минимального значения потенциала. Выборки проверяли на нормальность распределения c помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Поскольку большая часть выборок была распределена нормально, использовали параметрическую статистику. Уровень шума рассчитывали на участке от начала записи до начала стимуляции как два стандартных отклонения. Статистические сравнения выполняли в программе IBM SPSS Statistics 22 и онлайн-калькулятора (http://vassarstats.net/) с использованием следующих методов: Т-критерия Стьюдента, однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа (one-way and two-way ANOVA) и ковариационного анализа (ANCOVA).

Всего использовано 20 тараканов дикого типа и 15 белоглазых мутантов pearl.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Предлагаемый метод регистрации ЭРГ имеет ряд преимуществ перед широко используемым отведением электродом, вводимым в глаз. Стабильная регистрация в течение нескольких часов позволила предъявлять большое количество световых стимулов, варьирующих по интенсивности и длительности, с длинными интервалами между ними, предотвращающими существенную адаптацию фоторецепторов у каждого насекомого. Удалось преодолеть основную проблему классического метода записи ЭРГ (French et al., 2015) — зависимость амплитуды и формы ЭРГ от положения регистрирующего электрода.

Все регистрируемые в ответ на свет ЭРГ были сходной формы, с выраженным отрицательным пиком (рис. 1, а).

 

Рис. 1. Оригинальная запись ЭРГ интактного таракана дикого типа. а — таракан № 2 (26.05.2021), ответ на 10 мс вспышку зеленого (525 нм) света средней интенсивности (2.1×108 фотонов/мм2/мс); б — таракан № 8 (19.05.2022), ответ на 100 мс вспышку УФ (365 нм) света высокой интенсивности (1.1×1011 фотонов/мм2/мс). Отметка стимула показана над кривыми. Смещение минимального значения напряжения к концу стимуляции свидетельствует о существенном вкладе фотоэффекта.

 

При предъявлении УФ-вспышки высокой интенсивности на ответ глаза накладывался фотоэффект на электроде, о котором можно судить по сдвигу пика к концу стимуляции (рис. 1, б). При замене таракана ватным тампоном, смоченным раствором Рингера, можно было наблюдать характерный электрический сигнал, вызванный фотоэффектом, подробно описываемый далее.

Тараканы дикого типа. Амплитуды ответов интактных тараканов на зеленый свет были достоверно выше уровня шума, начиная с 5.3 × 106 фотонов/мм2/мс, а на УФ-излучение — с 2.8 × 106 фотонов/мм2/мс (Т-тест Стьюдента, p < 0.05). Достигнуть насыщения амплитуды ответов не удалось ни для зеленого, ни для УФ-стимулов. Удлинение стимуляции приводило к стабилизации амплитуды ответов (рис. 2).

 

Рис. 2. Амплитуды ответов на короткие (1–10 мс) вспышки возрастающей интенсивности зеленого (а, б) и УФ (в, г) света. Амплитуды ответов на стимулы длительностью 10–500 мс (б, г). Показаны средние и ошибки среднего.

 

При увеличении длительности стимуляции до 50 мс росла амплитуда, до 100 мс и более на максимальных интенсивностях рост амплитуды уменьшался или прекращался, после пика ответа следовало плато. После выключения светового стимула у некоторых препаратов наблюдался овершут — переход потенциала через нулевую линию в область положительных значений (рис. 3).

 

Рис. 3. Оригинальная запись ЭРГ интактного таракана дикого типа в ответ на 10 мс вспышку УФ (365 нм) света средней интенсивности (4.5×1010 фотонов/мм2/мс). а — таракан № 9 (19.05.2022), овершута нет; б — таракан № 12 (06.06.2022), овершут есть. Отметка стимула показана над кривыми.

 

Частота встречаемости овершутов не зависела от длины волны предъявляемого света, но росла с увеличением интенсивности сигнала (рис. 4, а). При увеличении длительности стимула максимальной интенсивности, 8.4×108 фотонов/мм2/мс для зеленого света и 1.1×1011 фотонов/мм2/мс для УФ (см. табл. 1), частота овершутов снижалась (рис. 4, б). Однако при оценке регистрируемого сигнала через 1 с после начала стимуляции ответы на зеленый, но не УФ-свет увеличивающейся длительности не показывали снижения частоты овершутов с удлинением стимула (рис. 4, в).

 

Рис. 4. Доля тараканов с положительным значением напряжения в точке 0.5 (а, б) и 1 (в) секунд после стимуляции (частота встречаемости овершутов). Для максимальной интенсивности света, использованного для стимуляции (б, в) приведены величины в ответ на вспышки длительностью 10–500 мс. Логарифмическая аппроксимация.

 

Поскольку амплитуду овершута сложно оценить из-за того, что в некоторых случаях максимум не наблюдался до конца записи, измеряли величину напряжения в точке 1 с от начала стимуляции. Эти величины показывают монотонное возрастание с ростом интенсивности световых стимулов обеих длин волн (рис. 5).

 

Рис. 5. Зарегистрированное напряжение через 1 с после начала стимуляции для 10 мс стимулов увеличивающейся интенсивности (а, в) и стимулов максимальной интенсивности при увеличении длительности (б, г). Стимуляция зеленым (а, б) и УФ (в, г) светом. Показаны средние и ошибки среднего.

 

При увеличении длительности ярких стимулов 8.4 × 108 фотонов/мм2/мс для зеленого света и 1.1 × 1011 фотонов/мм2/мс для УФ повышенное значение потенциала сохраняется для зеленого света, но уменьшается для УФ, снижаясь до отрицательных значений для вспышек длительностью 500 мс (см. рис. 5).

Время достижения пика ответа (минимум) было наибольшим в ответ на слабый световой стимул и сокращалось при увеличении интенсивности света в пределах стимулов обеих длин волн, не вызывающих существенного фотоэффекта (зеленый one-way ANOVA, F8/149 = 5.31, p < 0.001; УФ, F11/198 = 14.71, p < 0.001 (рис. 6). При ярком УФ-свете время до пика хотя бы отчасти росло, по-видимому, вследствие фотоэффекта.

 

Рис. 6. Время до пика ЭРГ тараканов в ответ на короткие вспышки (1—10 мс) зеленого (а, б) и УФ (в, г) света возрастающей интенсивности. Для максимальной интенсивности света приведены времена для стимулов возрастающей длительности (б, г). Показаны средние и ошибки среднего.

 

Основным недостатком хлорсеребряного электрода был фотоэффект, который искажал форму ответов на УФ-световые стимулы высокой интенсивности, начиная с 50 мс вспышек интенсивностью 1.1 × 1011 фотон/мм2/мс, поэтому были выполнены эксперименты по оценке фотоэффекта на ватном препарате с хлорсеребряным и золотым электродами.

При замене таракана на ватный тампон, смоченный раствором Рингера, наблюдалось характерное отклонение потенциала, нарастающего к концу стимуляции и спадающего после выключения света (рис. 7).

 

Рис. 7. Фотоэффект. Таракан заменен на ватный тампон, смоченный раствором Рингера. а, б — хлорсеребряный электрод; в-золотой электрод; а — зеленый, б, в — УФ световой стимул.

 

Стимулы зеленого света высокой интенсивности и длительностью 500 мс иногда также вызывали сходные электрические сигналы, но их величина была пренебрежимо мала (даже на ватном препарате не превышала 30 мкВ, см. рис. 7). К сожалению, особенно на живых препаратах, величина фотоэффекта, оцениваемая по смещению пика, была крайне вариабельной, что делает невозможным его вычитание из записей ЭРГ. Оказалось, что форма регистрируемого электрического сигнала в ответ на свет отличается от динамики ЭРГ, что становится особенно заметным с увеличением длительности стимула, а именно максимальное отклонение наблюдается в конце стимуляции. Зеленый свет вызывал небольшой фотоэффект на хлорсеребряном электроде даже при максимальных стимулах, а на золотом электроде не выделялся из шума (данные не показаны). УФ приводил к заметному фотоэффекту порядка 0.1 мВ уже на интенсивности 4.5 × 1010 фотон/мм2/мс для 10 мс стимулов и далее достигал нескольких милливольт. Фотоэффект, зарегистрированный с золотого электрода, не достигал 0.1 мВ даже при максимальной засветке (см. рис. 7).

Мутанты pearl. Белоглазые тараканы демонстрировали большую чувствительность к свету, чем насекомые дикого типа (см. рис. 2). Ответы на зеленый и УФ-свет у мутантов pearl появляются на стимулы меньшей интенсивности, чем у дикого типа, а соотношение амплитуд ответов достигает четырех для обеих длин волн (для зеленого света p < 0.001; two-way ANOVA, F1/275 = 31.79; для УФ p < 0.01, F1/368 = 7.02). Использованные нами максимальные интенсивности зеленого света не позволили достичь насыщения ответов, однако при ответах на УФ белоглазые тараканы демонстрировали насыщение ответа, начиная с интенсивности 1.8 × 1010 фотон/мм2/мс (см. рис. 2). Таким образом, кривые зависимости амплитуды ответа от интенсивности у белоглазых мутантов оказываются сдвинуты влево по отношению к тараканам дикого типа.

Время до пика у белоглазых тараканов было существенно короче, чем у черноглазых, при ответах как на зеленый, так и УФ-свет во всем диапазоне интенсивностей, вызывающих ответы, превышающие уровень шума (зеленый two way ANOVA, F1/275 = 54.38, p < 0.001; УФ, F1/366 = 170.40, p < 0.001; см. рис. 6).

Величина положительного отклонения потенциала после выключения стимуляции зависела от интенсивности света как для тараканов дикого типа, так и для мутантов, при этом величина овершута у белоглазых особей была существенно выше (см. рис. 5). Интересно отметить, что величина овершута, регистрируемого при удлиняющихся ярких УФ-стимулах, уменьшалась у тараканов дикого типа, но не менялась у белоглазых мутантов для стимулов 50–500 мс.

ОБСУЖДЕНИЕ

Предложенный в нашей работе неинвазивный метод отведения ЭРГ показал значительные преимущества перед традиционно используемым инвазивным методом с введением микроэлектрода внутрь глаза (French et al., 2015). Форма ответа была одинаковой у всех препаратов, в отличие от экспериментов с электродами, вводимыми в глаз, что позволило обнаружить связь параметров ЭРГ с характеристиками стимулов и состоянием глаза. Отрицательный пик ЭРГ характеризует суммарный ответ (деполяризацию) фоторецепторных клеток на свет, его амплитуда растет, а время до пика падает с увеличением интенсивности стимуляции. При использовании хлорсеребряного электрода ответы на УФ-свет высокой интенсивности искажаются артефактом, вызванным фотоэффектом, однако эта проблема может быть решена заменой хлорсеребряного электрода на золотой (см. рис. 7). Небольшой фотоэффект, наблюдаемый на искусственном препарате (ватный тампон, смоченный раствором Рингера), с золотым электродом был примерно на два порядка меньше, чем с хлорсеребряным и, по-видимому, вызван небольшим количеством серебра, содержащимся в золотой проволоке (ГОСТ 6835–2002). Отведение от обоих глаз таракана оказалось удобным, поскольку позволяет легко закрепить электрод на голове насекомого.

Белоглазые тараканы демонстрировали существенно более высокую чувствительность к свету, а именно ответы, превышающие уровень шума, обнаруживались в ответ на меньшие интенсивности света обеих длин волн, при этом амплитуды ответов были в несколько раз больше, чем у особей дикого типа. Таким образом, полученные данные подтверждают ранее наблюдавшееся кратное увеличение амплитуды ЭРГ у белоглазых мутантов (Gribakin, 1988; Chen et al., 1999). Кажущееся противоречие с данными, полученными при внутриклеточных отведениях (Saari et al., 2018), которые демонстрируют более низкие ответы на свет фоторецепторов из глаз мутантов pearl по сравнению с диким типом, объясняется увеличением потока света, достигающего фоторецепторных мембран и, соответственно, вкладом большего числа фоторецепторов в суммарный электрический ответ глаза.

Вследствие технических ограничений по яркости предъявляемых вспышек, увеличения числа фотонов в стимуле достигали увеличением его длительности (см. табл. 1). Удлинение стимуляции позволяет увеличить ответ фоторецептора с сохранением его динамики только в очень небольшом временно́м диапазоне, пока не заработали механизмы выключения в каскаде фототрансдукции. Это время задержки перед фотоответом и первые 10–15 мс ответа, далее часть падающих фотонов возбуждает каскад в уже адаптирующейся к свету клетке, в которой усиление в каскаде снижено. Как следствие, искажается форма переднего фронта — он оказывается более пологим, а время до пика не меняется или удлиняется с увеличением числа фотонов в стимуле. Тем не менее временно́е окно для стимула, который будет приводить к увеличению амплитуды, несколько шире — до момента, когда клетка полностью адаптируется к текущей плотности потока фотонов (несколько десятков миллисекунд). Еще более длительная стимуляция будет поддерживать клетку в некоем стационарном состоянии, так как механизмы активации и выключения будут в равновесии. Наши данные демонстрируют, что стимулы зеленого света 8.4 × 108 фотон/мм2/мс при увеличении их длительности воспринимаются глазом таракана не как одномоментные вспышки, а как светлые периоды. Мы не можем с уверенностью утверждать, что это же верно и для УФ-света из-за фотоэффекта.

Особый интерес представляет положительная волна потенциала (овершут), наблюдавшийся у части препаратов. Поскольку выраженность овершута растет с интенсивностью световых стимулов обеих длин волн, можно предположить, что он связан с гиперполяризацией фоторецепторных клеток. Это предположение не противоречит данным, полученными на белоглазых тараканах pearl (более выраженные овершуты), у которых фоторецепторы получают больше света из-за отсутствия экранирующего пигмента.

Положительные овершуты, наблюдаемые после окончания стимуляции, были описаны у некоторых видов ночных и дневных насекомых. Так, для богомолов Tenodera aridifolia sinensis, Sphodromantis lineola и Popa spurca описана медленная положительная волна, которую авторы трактуют как гиперполяризацию фоторецепторов (Popkiewicz, Prete, 2013) и связывают с работой электрогенного катионного насоса (Jansonius, 1990; Schirmer et al., 2014). Внутриклеточные отведения от фоторецепторов мясной мухи Calliphora vicina (erythrocephala) и светляка Photinus pyralis демонстрируют волну медленной гиперполяризации после выключения стимула, величина которой растет с интенсивностью стимула (Hochstrate, 1989; Cronin et al., 2000).

Для длительных УФ-стимулов овершуты исчезали, вероятно, вследствие медленного восстановления мембранного потенциала фоторецепторов.

Время до пика снижалось при увеличении интенсивности стимулирующего света для обеих длин волн. Такая же зависимость наблюдалась для белоглазых мутантов. Однако полученные значения времени до пика были меньше, чем для черноглазых тараканов дикого типа. Дополнительный ковариационный анализ (ANCOVA) для амплитуд ответов и времени достижения пиков ответов показал достоверные различия между белоглазыми мутантами и черноглазыми особями дикого типа (для зеленого света F = 4.35, df = 1, p = 0.05; для УФ F = 65.28; df = 1, p < 0.0001, рис. 8).

 

Рис. 8. Зависимость времени до пика от амплитуды ответа: а — зеленый, б — УФ свет. Приведены средние значения для ответов на 10 мс вспышки света и логарифмическая аппроксимация.

 

Таким образом, уменьшение времени до пика у белоглазых мутантов связано не только с увеличением количества света, достигающего фоторецепторов, но и с каким-то дополнительным фактором, возможно, более короткими фоторецепторными клетками (Saari et al., 2018), но это предположение требует дальнейшей проверки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанный нами метод отведения ЭРГ от поверхности обоих сложных глаз насекомого показал высокую надежность и позволяет регистрировать ответы глаза в течение длительного времени.

Амплитуда ЭРГ белоглазых тараканов в несколько раз превышала значения, полученные для черноглазых, как для зеленого, так и для УФ-стимулов средних интенсивностей динамического диапазона.

Время до пика было меньше у белоглазых тараканов, и эти различия невозможно полностью объяснить увеличением света, достигающего фоторецепторов. Это, по-видимому, связано с изменениями свойств фоторецепторных клеток при потере экранирующего пигмента.

Волна положительного потенциала, наблюдаемая после выключения стимула, увеличивается с интенсивностью стимуляции и, по-видимому, отражает гиперполяризацию рецепторных клеток.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 22-24-00806.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят чл.- корр. М. Л. Фирсова за предоставленную возможность использования созданной им установки и программного обеспечения.

УЧАСТИЕ АВТОРОВ

Содержание и подготовка насекомых, проведение экспериментов, обработка данных, подготовка таблицы и рисунков выполнено Е. С. Новиковой; отработка протоколов экспериментов, калибровка источников света и светофильтров — А. Ю. Ротовым и Л. А. Астаховой. Идея метода регистрации ЭРГ, обработка данных, написание статьи реализованы М. И. Жуковской. Все авторы участвовали в обсуждении и редактировании текста статьи.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.

×

About the authors

E. S. Novikova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: mzhukovskaya@rambler.ru
Russian Federation, 104223, St. Petersburg, Thorez Ave, 44

L. A. Astakhova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: mzhukovskaya@rambler.ru
Russian Federation, 104223, St. Petersburg, Thorez Ave, 44

A. Y. Rotov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: mzhukovskaya@rambler.ru
Russian Federation, 104223, St. Petersburg, Thorez Ave, 44

M. I. Zhukovskaya

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: mzhukovskaya@rambler.ru
Russian Federation, 104223, St. Petersburg, Thorez Ave, 44

References

  1. Gribakin F. G. Mehanizmy fotorecepcii nasekomyh [Mechanisms of photoreception in insects]. Leningrad. Nauka, 1981. 213 p. (in Russian).
  2. Butler R. The anatomy of the compound eye of Periplaneta americana L. 1. General features J. Comp. Physiol. 1973a. V. 83. P. 223–238. https://doi.org/10.1007/BF00693676.
  3. Butler R. The anatomy of the compound eye of Periplaneta americana L. 2. Fine structure. J. Comp. Physiol. 1973b. V. 83. P. 239–262. https://doi.org/10.1007/BF00693677.
  4. Chen B., Meinertzhagen I. A., Shaw S. R. Circadian rhythms in light-evoked responses of the fly’s compound eye, and the effects of neuromodulators 5-HT and the peptide PDF. J. Comp. Physiol. A. 1999. V. 185. P. 393–404. https://doi.org/10.1007/s003590050400
  5. Cronin T. W., Järvilehto M., Weckström M., Lall A. B. Tuning of photoreceptor spectral sensitivity in fireflies (Coleoptera: Lampyridae). J. Comp. Physiol. A. 2000. V. 186. P. 1–12. https://doi.org/10.1007/s003590050001.
  6. Crook D. J., Hull-Sanders H.M., Hibbard E. L., Mastro V. C. A comparison of electrophysiologically determined spectral responses in six subspecies of Lymantria. J. Econ. Entomol. 2014. V. 107. P. 667–674. https://doi.org/10.1603/EC13464.
  7. Crook D. J., Chiesa S. G., Warden M. L., Nadel H., Ioriatti C., Furtado M. Electrophysiologically determined spectral responses in Lobesia botrana (Lepidoptera: Tortricidae). J. Econ. Entomol. 2022. V. 115(5). P. 1499–1504. https://doi.org/10.1093/jee/toac124
  8. Dolph P., Nair A., Raghu P. Electroretinogram recordings of Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2011. V. 2011(1). P. pdb-prot5549. https://doi.org/10.1101/pdb.prot5549
  9. Fabietti M., Mahmud M., Lotfi A., Kaiser M. S., Averna A., Guggenmos D. J., Nudo R. J., Chiappalone M., Chen J. SANTIA: a MATLAB-based open-source toolbox for artifact detection and removal from extracellular neuronal signals. Brain Informatics. 2021. V. 8. P. 1–19. https://doi.org/10.1186/s40708-021-00135-3.
  10. French A. S., Meisner S., Liu H., Weckström M., Torkkeli P. H. Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels. Frontiers in physiology. 2015. V. 6. P. 207. https://doi.org/10.3389/fphys.2015.00207.
  11. Frolov R. V., Severina I., Novikova E., Ignatova I. I., Liu H., Zhukovskaya M., Torkkeli P. H., French A. S. Opsin knockdown specifically slows phototransduction in broadband and UV-sensitive photoreceptors in Periplaneta americana. J. Comp. Physiol. A. 2022. V. 208(5–6). P. 591–604. https://doi.org/10.1007/s00359-022-01580-z
  12. Goriachenkov A. A., Rotov A. Y., Firsov M. L. Developmental dynamics of the functional state of the retina in mice with inherited photoreceptor degeneration. Neuroscience and Behavioral Physiology. 2021. V. 51. P. 807–815. https://doi.org/10.1007/s11055-021-01137-8
  13. Gribakin F. G. Photoreceptor optics of the honeybee and its eye colour mutants: the effect of screening pigments on the long-wave subsystem of colour vision. J. Comp. Physiol. A. 1988. V. 164. P. 123–140. doi: 10.1007/BF00612726.
  14. Gribakin F. G., Ukhanov K. Y. Is the white eye of insect eye-color mutants really white? J. Comp. Physiol. A. 1990. V. 167. P. 715–721. https://doi.org/10.1007/BF00192666.
  15. Gribakin F. G., Alekseyev Y. N., Ukhanov K. Y. Spectral sensitivity of white-eyed insect mutants in the UV, blue and green. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 1996. V. 35(1–2). P. 13–18. https://doi.org/10.1016/1011-1344(96)07313-7
  16. Hochstrate P. Lanthanum mimicks the TRP photoreceptor mutant of Drosophila in the blowfly Calliphora. J. Comp. Physiol. A. 1989. V. 166. P. 179–187. https://doi.org/10.1007/BF00193462
  17. Jansonius N. M. Properties of the sodium pump in the blowfly photoreceptor cell. J. Comp. Physiol. 1990. V. 167. P. 461–467. https://doi.org/10.1007/BF00190816
  18. Kelly K. M., Mote M. I. Avoidance of monochromatic light by the cockroach Periplaneta americana. Journal of insect physiology. 1990. V. 36(4). P. 287–291. https://doi.org/10.1016/0022-1910(90)90113-T.
  19. Kugel M. The time course of the electroretinogram of compound eyes in insects and its dependence on special recording conditions. Journal of Experimental Biology. 1977. V. 71(1). P. 1–6. https://doi.org/10.1242/jeb.71.1.1
  20. Mikulovic S., Pupe S., Peixoto H. M., Do Nascimento G. C., Kullander K., Tort A. B., Leão R. N. On the photovoltaic effect in local field potential recordings. Neurophotonics. 2016. V. 3(1). P. 015002. https://doi.org/10.1117/1.NPh.3.1.015002
  21. Mote M. I., Goldsmith T. H. Spectral sensitivities of color receptors in the compound eye of the cockroach Periplaneta. J. Exp. Zool. 1970. V. 173. P. 137–145. https://doi.org/10.1002/jez.1401730203
  22. Popkiewicz B., Prete F. R. Macroscopic characteristics of the praying mantis electroretinogram. Journal of insect physiology. 2013. V. 59(8), P. 812–823. https://doi.org/10.1016/j.jinsphys.2013.05.002
  23. Ross M. H., Cochran G., Smyth D. T. Eye-color mutations in the American cockroach, Periplaneta americana. Ann. Entomol. Soc. Am. 1964. V. 57. P. 790–792. https://doi.org/10.1093/aesa/57.6.790
  24. Saari P., Immonen E. V., Kemppainen J., Heimonen K., Zhukovskaya M., Novikova E., French A. S., Torkkeli P. H., Liu H., Frolov R. V. Changes in electrophysiological properties of photoreceptors in Periplaneta americana associated with the loss of screening pigment. J. Comp. Physiol. A. 2018. V. 204. P. 915–928. https://doi.org/10.1007/s00359—018—1290—0
  25. Schirmer A. E., Prete F. R., Mantes E. S., Urdiales A. F., Bogue W. Circadian rhythms affect electroretinogram, compound eye color, striking behavior and locomotion of the praying mantis Hierodula patellifera. Journal of Experimental Biology. 2014. V. 217(21). P. 3853–3861. https://doi.org/10.1242/jeb.102947
  26. Sieving P. A., Fishman G. A., Maggiano J. M. Corneal wick electrode for recording bright flash electroretinograms and early receptor potentials. Archives of Ophthalmology. 1978. V. 96(5). P. 899–900. https://doi.org/10.1001/archopht.1978.03910050501024
  27. Wu J., Tian Y., Dong W., Han J. Protocol for electroretinogram recording of the Drosophila compound eye. STAR protocols. 2022. V. 3(2). P. 101286. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2022.101286
  28. Zhukovskaya M. I. Modulation by octopamine of olfactory responses to nonpheromone odorants in the cockroach, Periplaneta americana L. Chemical senses. 2012. 37(5). P. 421–429. https://doi.org/10.1093/chemse/bjr121

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Original ERG recording of an intact wild-type cockroach. a — cockroach No. 2 (05/26/2021), response to a 10 ms flash of green (525 nm) light of medium intensity (2.1  108 photons/mm2/ms); b — cockroach No. 8 (05/19/2022), response to a 100 ms flash of UV (365 nm) high-intensity light (1.1  1011 photons/mm2/ms). The stimulus mark is shown above the traces. The shift in the minimum voltage value towards the end of stimulation indicates a significant contribution of the photoelectric effect.

Download (157KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Amplitudes of responses to short (1–10 ms) flashes of increasing intensity of green (a, b) and UV (c, d) light. Amplitudes of responses to stimuli lasting 10–500 ms (b, d). Means and errors of the mean are shown.

Download (321KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Original ERG recording of an intact wild-type cockroach in response to a 10 ms flash of UV (365 nm) light of medium intensity (4.5  1010 photons/mm2/ms). a — cockroach No. 9 (05/19/2022), no overshoot; b — cockroach No. 12 (06/06/2022), there is an overshoot. The stimulus mark is shown above the traces.

Download (120KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. The proportion of cockroaches with a positive voltage value at the point 0.5 (a, b) and 1 (c) seconds after stimulation (overshoot frequency). For the maximum intensity of light used for stimulation (b, c), values are given in response to flashes lasting 10–500 ms. Logarithmic approximation.

Download (274KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Recorded voltage 1 s after the start of stimulation for 10 ms stimuli of increasing intensity (a, c) and stimuli of maximum intensity with increasing duration (b, d). Stimulation with green (a, b) and UV (c, d) light. Means and errors of the mean are shown.

Download (256KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. Time to peak ERG of cockroaches in response to short flashes (1-10 ms) of green (a, b) and UV (c, d) light of increasing intensity. For maximum light intensity, times are shown for stimuli of increasing duration (b, d). Means and errors of the mean are shown.

Download (258KB)
Indexing metadata
8. Fig. 7. Photo effect. The cockroach was replaced with a cotton swab soaked in Ringer's solution. a, b - silver chloride electrode; b-gold electrode; a — green, b, c — UV light stimulus.

Download (364KB)
Indexing metadata
9. Fig. 8. Dependence of time to peak on response amplitude: a - green, b - UV light. Mean values for responses to 10 ms light flashes and logarithmic fits are shown.

Download (166KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».