Fast Transfer of Photoreleased Protons from Water to Lipid Membrane

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The transfer of protons between the surface of lipid membrane and water can be slowed down by the presence of a high potential barrier, which affects the functioning of proton-transporting proteins. To evaluate the rate of the proton transfer across the barrier, the photoactivatable compounds that can adsorb on the membrane boundary and release protons upon excitation are used. One of these compounds, which we studied earlier, sodium salt of 2-methoxy-5-nitrophenylsulfate (MNPS), was used in this work. The molecule of MNPS can adsorb on the bilayer lipid membrane (BLM) as anion and release sulfate and proton upon excitation with UV light, becoming an electroneutral product. Upon illumination of the BLM, on one side of which MNPS anions were adsorbed, changes in the electrostatic potential at the membrane–water interface were observed. The slow changes of the potential were measured by the intramembrane field compensation method and the fast changes, by the operational amplifier as an electrometer. When the light was switched on, the potential increased rapidly, and when the light was switched off, the potential slowly returned to its initial value. The rate of rapid potential increase depended on the lipid composition of BLM, buffer concentration, and pH of the medium. The dependence of this rate on pH was different for BLMs formed from phosphatidylcholine and its mixture with phosphatidylserine. With increasing buffer concentration, the rate decreased tens of times. The results obtained indicate that the reaction of proton release formed during the excitation of MNPS molecules occurs both on the membrane surface and in the water near it. The main contribution to the change in the electrostatic potential at the membrane boundary is given by protons bound at its surface from the reaction in water.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Исследования последних лет показали, что имеется особое состояние протонов на границе раздела мембраны с водой. Эти протоны отделены от водного раствора потенциальным барьером, образованным ориентированными молекулами воды [1–4]. Из-за барьера перемещение протонов в мембране между донором и акцептором может происходить вдоль ее поверхности, а не через водный раствор [5–7]. Это существенно влияет на пассивный и активный транспорт протонов мембранными белками [8]. Ключевой вопрос, ответ на который позволяет проверить подобные механизмы, состоит в оценке величины потенциального барьера для протонов между поверхностью мембраны и водой. Оценку потенциального барьера проводили с помощью теоретических моделей [8] и вычислений методами молекулярной динамики липидных мембран с прилегающими к ним ориентированными молекулами воды [9, 10]. Высоту потенциального барьера определяли и экспериментально, изучая кинетику обмена протонов между поверхностью мембраны и водой. Эти исследования проводили на границе раздела масло/вода и на бислойных липидных мембранах (БЛМ) с помощью флуоресцентных зондов [5–7]. Возникновение и затухание сигнала флуоресценции объяснялось моделью, в которой протоны диффундируют в продольном направлении как по поверхности мембраны, так и в водном объеме [5]. Высоту потенциального барьера определяли по скорости ухода протонов с поверхности раздела, и ее оценки в разных экспериментах варьировали в пределах 6–25 kT (где k – постоянная Больцмана, T – абсолютная температура) [4, 5].

Кинетику обмена протонов между мембраной и водой можно изучать и без использования зондов, измеряя скачок потенциала на границе мембраны, который должен измениться при связывании на ней протонов. Измерение граничного потенциала позволяет определить рК титруемых групп на поверхности мембраны, а в случае быстрого протонирования поверхности – изучить кинетику обмена протонов между поверхностью мембраны и водой. Для кинетических исследований использовали фотоактивируемые соединения, в молекулах которых при возбуждении светом происходит выброс протонов. Он происходит либо при изменении рК молекулы [11], либо из-за отрыва от нее и последующей диссоциации кислотной группы [12–15]. Одно из таких соединений – 2-метокси-5-нитрофенилсульфат натрия (MNPS) – изучалось нами ранее методом компенсации внутримембранного поля (КВП). Показано, что в изменение потенциала при освещении вносят вклад изменения количества связанных на поверхности БЛМ анионов MNPS и протонов. Вклад протонов уменьшался при уменьшении рН и увеличении концентрации буфера в растворе. Одновременно с изменением потенциала изменялся рН в неперемешиваемом слое воды около мембраны, причем протоны, связанные на поверхности БЛМ, оставались в равновесии с водным раствором [15, 16].

Метод КВП позволил изучать адсорбцию MNPS на мембране и медленную кинетику изменения потенциала при освещении. Однако он не позволял регистрировать быстрые изменения потенциала. Для того чтобы исследовать быструю кинетику перемещения протонов через границу раздела мембрана/вода, в настоящей работе изменения электростатического потенциала на границе мембраны регистрировались электрометром. Это позволило установить, что основной вклад в изменение электростатического потенциала на границе мембраны дают протоны, связывающиеся на ее поверхности после их освобождения из возбужденных молекул MNPS в воде.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Водные растворы, применявшиеся в экспериментах, содержали KCl («Реахим», Россия), лимонную кислоту («Реахим»), HEPES (Sigma, США), Tris (Sigma), MES (Sigma) и были приготовлены на дважды дистиллированной воде. В экспериментах были использованы фоточувствительный препарат Caged-H+ – 2-метокси-5-нитрофенилсульфат натрия (MNPS), синтезированный в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН.

Бислойная липидная мембрана формировалась по методу Мюллера–Рудина [17] из растворенных в декане липидов, суммарная концентрация которых составляла 15 мг/мл. Этими липидами были либо дифитаноилфосфатидилхолин (Avanti Polar Lipids, США), либо смесь 70% дифитаноилфосфатидилхолина и 30% дифитаноилфосфатидилсерина (Avanti Polar Lipids, США). В дальнейшем эти липиды будут обозначаться, соответственно, как PC и PC+PS. Мембрану формировали на отверстии диаметром 0.8 мм в перегородке тефлоновой ячейки. Перегородка разделяла ячейку на два равных по объему (2 мл) отсека. В ячейке имелось два оптически прозрачных окна: одно для визуального наблюдения БЛМ, другое – для освещения УФ светом. Раствор MNPS добавляли в дальний (по отношению к источнику света) отсек ячейки. Растворы в обоих отсеках ячейки непрерывно перемешивались с помощью магнитной мешалки. Освещение БЛМ проводили с помощью ультрафиолетового светодиода SUFI-3W Purple (UV) (LCFOCUS, КНР) с длиной волны 365 нм и электрической мощностью до 3 Вт. Свет на БЛМ фокусировали стеклянной линзой диаметром 7 мм с фокусным расстоянием 9.8 мм (Mayitr, КНР). Интенсивность освещения (пропорциональную ей электрическую мощность светодиода) регулировали, варьируя величину подаваемого на светодиод напряжения и измеряя протекающий ток.

В электрических измерениях использовали хлорсеребряные электроды, контактирующие с растворами в ячейке через агаровые мостики, изготовленные из пластиковых наконечников для пипеток. Нижние части наконечников были заполнены агаром (3% агар, приготовленный в растворе 100 мМ KCl), верхние – тем же раствором, который находился в ячейке. Для контроля формирования БЛМ измеряли ее емкость, проводимость и потенциал нулевого тока с помощью анализа динамических вольт-амперных характеристик БЛМ, возникающих при подаче на нее периодического переменного напряжения треугольной формы с амплитудой 10–50 мВ и частотой 2–200 Гц. Это напряжение с выхода генератора (АКИП 3409/1, Россия) подключали к одному из электродов ячейки с БЛМ. Ко второму электроду подключали вход усилителя Keithley-427 (Keithley Instruments, США), выход которого был связан с входом АЦП (плата Lcard L502, Россия).

Медленные изменения разности граничных потенциалов БЛМ измеряли методом компенсации внутримембранного поля (КВП) с помощью автоматической установки, которая определяла постоянную составляющую приложенного к мембране синусоидального напряжения, при котором вторая гармоника емкостного тока обращается в нуль [15]. Вторая гармоника измерялась с помощью усилителя SR 830 (Stanford Research Systems, США), связанного с компьютером через приборный интерфейс GPIB (ADLink, Тайвань). Этот же усилитель являлся источником синусоидального и постоянного напряжений, подаваемых на мембрану. Измерение осуществлялось с помощью программы, написанной авторами. Быстрые изменения граничного потенциала измеряли с помощью электрометрического операционного усилителя Keithley-301 (Keithley Instruments).

Изменение граничного потенциала во времени записывали на компьютер для дальнейшего анализа. Кинетику изменения граничного потенциала БЛМ при освещении аппроксимировали экспоненциальными функциями, для чего использовалась программа, написанная авторами. Скорость изменения потенциала в момент начала освещения определяли как производную экспоненты в нулевой момент времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Типичная кинетика изменения граничных потенциалов при адсорбции MNPS, а также при включении и выключении света показана на рис. 1. Если измерения проводились методом КВП, изменения потенциала при адсорбции MNPS на мембране и последующем освещении были аналогичны описанным нами в предыдущей статье [16]. Измерения методом КВП позволили изучить медленные процессы адсорбции MNPS, установления стационарного потенциала при освещении и восстановления при прекращении освещения (рис. 1а). Медленная кинетика изменения потенциала при освещении, измеряемого методом КВП, хорошо описывалась математической моделью, которая позволила определить константы скоростей реакций, а также относительный вклад в изменение потенциала протонов и анионов MNPS [16]. Однако временное разрешение метода КВП оказалось недостаточным для измерения быстрых изменений потенциала при освещении. Это демонстрирует рис. 1б, где изменяемое этим методом изменение потенциала показано в растянутой временной шкале. Для исследования быстрой кинетики, изменения граничного потенциала измеряли с помощью электрометрического усилителя. Идея метода измерения граничного потенциала электрометром состоит в том, что измерения проводятся в течение короткого периода времени, пока поле внутри мембраны не успевает измениться, в отличие от метода КВП, где внутримембранное поле поддерживается нулевым с помощью установки за счет отрицательной обратной связи. Возможность измерения быстрых изменений граничного потенциала с помощью электрометра была впервые продемонстрирована в работе [18]. Длительность времени, в течение которого можно измерять изменение граничного потенциала с помощью электрометра, определяется скоростью установления равновесного потенциала между растворами по обе стороны от мембраны. Это время, которое можно оценить как произведение емкости мембраны на ее сопротивление, составляет обычно несколько секунд [19, 20]. Измеренная электрометром быстрая кинетика изменения потенциала при освещении представлена на рис. 1в.

 

Рис. 1. Кинетика изменения граничного потенциала при адсорбции MNPS на БЛМ и последующем освещении. Измерения проводились на одной и той же мембране методом КВП (а, б) или с помощью электрометрического усилителя (в). б – Изменение потенциала при освещении, полученное из графика (a) с помощью сдвига и растяжения по шкале времени. Стрелками с соответствующими надписями показаны моменты добавления MNPS (MNPS), включения (L) и выключения (D) света. БЛМ сформирована из PC. Раствор содержал 20 мМ KCl, 0.2 мМ Tris, HEPES и цитрат, рН 8.0. MNPS добавляли в дальний по отношению к источнику света отсек ячейки в концентрации 600 мкМ, освещение проводилось светодиодом (365 нм, электрическая мощность 0.12 Вт).

 

Из-за ограничения временного интервала, в котором возможны измерения граничных потенциалов электрометрическим усилителем, получить всю кинетику изменения потенциала при освещении вплоть до достижения стационарного состояния и восстановления потенциала в темноте невозможно. Для количественной характеристики быстрой кинетики был выбран параметр R – скорость изменения потенциала в момент начала освещения. Этот параметр оказался пропорционален интенсивности освещения (рис. 2). Более того, и начальная скорость медленного изменения потенциала, измеренная методом КВП при низкой интенсивности освещения, и скорость быстрого изменения потенциала, измеренная электрометром при высокой интенсивности, остаются пропорциональными этой интенсивности, причем точки, полученные обоими методами, лежат на графике на одной прямой. Это означает, что значение параметра скорости R не зависит от метода измерения граничных потенциалов, и применение электрометрического усилителя позволило всего лишь увеличить временное разрешение и исследовать более быструю кинетику изменения потенциала при увеличении интенсивности освещения, что ускорило саму реакцию.

 

Рис. 2. Зависимость скорости изменения граничного потенциала в момент начала освещения от электрической мощности освещения. Условия эксперимента аналогичны указанным в подписи к рис. 1. a – Кинетики измеренного электрометром изменения потенциала при включении (L) и выключении (D) света с различной мощностью, указанной в надписях на рисунке. Пунктирная прямая демонстрирует способ определения параметра R для мощности освещения 0,34 Вт как наклона касательной к синей кривой в точке, соответствующей нулевому моменту времени. б – Зависимость параметра R от мощности освещения Р. Измерения проведены методом КВП (черные кружки) и электрометром (пустые кружки).

 

Значение R зависело от рН и концентрации буфера. Зависимость R от pH приведена на рис. 3a. В случае, когда измерения проводились на БЛМ из PC, при уменьшении рН значение R уменьшалось, что согласуется с результатами, полученными ранее методом КВП, и объясняется зависимостью поверхностного заряда липидной мембраны от рН [16]. Если эксперименты проводить на БЛМ с другим липидным составом – из смеси PC и PS, то зависимость R от pH оказывается другой. Как будет показано, эта зависимость R от pH коррелирует с зависимостью поверхностного потенциала от рН, которая отличается от зависимости, измеренной на БЛМ из PC.

Значение R уменьшалось также при увеличении концентрации буфера (рис. 3б). Эффект буфера был тем сильнее, чем больше было значение R на рис. 3a. В условиях максимального эффекта увеличение концентрации буфера в диапазоне 0.2–40 мМ приводило к уменьшению параметра R на порядки величины. Для БЛМ из PS эффект буфера оказался значительно сильнее, чем для БЛМ из PC.

 

Рис. 3. Зависимость скорости изменения граничного потенциала R, измеренного электрометром, в момент начала освещения от рН раствора (a) и концентрации буфера C (б). Раствор содержал 20 мМ KCl, 0.2 мМ Tris, MES и цитрат. MNPS добавляли в дальний по отношению к источнику света отсек ячейки в концентрации 600 мкМ. Освещение проводилось с мощностью 0.03–0.4 Вт. Концентрацию буфера при рН 8 варьировали, добавляя в растворы по обе стороны от мембраны Tris, при рН 6 – MES. Значения R на графике a нормировали на мощность освещения, на графике б – на величину R, измеренную до увеличения концентрации буфера в растворе.

 

Как было показано нами ранее, изменение потенциала при освещении происходит из-за уменьшения количества связанных с мембраной анионов MNPS и увеличения количества связанных с мембраной протонов [16]. Представляется естественным предположить, что буфер ослабляет вклад в изменение потенциала протонов, но не влияет на вклад анионов. Тогда уменьшение R в десятки раз при увеличении концентрации буфера говорит о том, что вклад анионов в изменение потенциала значительно меньше вклада протонов. Поскольку эффект буфера зависел от рН, достигая максимума при рН, соответствующих максимальному значению R (рис. 3a), то и вклад протонов в изменение потенциала в этих областях рН максимален.

Поскольку количество протонов и анионов сульфата, образующихся при распаде возбужденных молекул MNPS, одинаково, различие протонного и анионного вклада в изменение потенциала можно объяснить тем, что реакция, где происходит разрушение MNPS, и плоскость на границе мембраны с водой, где связываются протоны, разнесены в пространстве. Это может иметь место, если вызванные освещением реакции с MNPS происходят не только на мембране, но и в растворе около нее. Тогда количество анионов, ушедших с мембраны, и протонов, пришедших на нее, будет разным. Если потенциал изменяется только благодаря реакциям с молекулами MNPS в водном растворе, вклад анионов в это изменение может вообще отсутствовать. В пользу того, что на изменение потенциала при освещении могут влиять реакции в растворе, говорят эксперименты, в которых БЛМ формировали из смеси PC+PS. Мембрана из этих липидов обладает значительным поверхностным зарядом отрицательного знака. Величину заряда можно оценить, измеряя зависимость поверхностного потенциала от ионной силы раствора [21, 22]. Зависимость изменения граничного потенциала от концентрации KCl в растворе с одной стороны БЛМ изображена на рис. 4a.

 

Рис. 3. Зависимость скорости изменения граничного потенциала R, измеренного электрометром, в момент начала освещения от рН раствора (a) и концентрации буфера C (б). Раствор содержал 20 мМ KCl, 0.2 мМ Tris, MES и цитрат. MNPS добавляли в дальний по отношению к источнику света отсек ячейки в концентрации 600 мкМ. Освещение проводилось с мощностью 0.03–0.4 Вт. Концентрацию буфера при рН 8 варьировали, добавляя в растворы по обе стороны от мембраны Tris, при рН 6 – MES. Значения R на графике a нормировали на мощность освещения, на графике б – на величину R, измеренную до увеличения концентрации буфера в растворе.

 

Аппроксимация этой зависимости кривой, построенной по уравнению Гуи–Чепмена, позволила определить поверхностный заряд БЛМ, значение которого составило –58 мкКл/см2, и поверхностный потенциал, составивший около –62 мВ. Из-за того, что БЛМ из PC+PS обладает значительным по величине отрицательным поверхностным зарядом, количество адсорбировавшихся на ней анионов MNPS меньше, чем на БЛМ из PC при той же концентрации MNPS в водном растворе. Это показывает рис. 4б: изменение граничного потенциала при адсорбции MNPS на заряженной БЛМ, содержащей PS, оказалось значительно меньше по величине, чем при адсорбции на нейтральной мембране из PC. Несмотря на то что количество анионов MNPS, адсорбировавшихся на заряженной мембране, меньше, вызванное освещением изменение потенциала при рН 6 оказывается значительно больше, чем на нейтральной мембране (рис. 3a). Эффект буфера на заряженных БЛМ при рН 6 оказывается тоже сильнее (рис. 3б). Это можно объяснить, если предположить, что протоны попадают на БЛМ при возбуждении молекул MNPS, расположенных в воде, концентрация которых на расстоянии от БЛМ, большем дебаевской длины экранирования (около 1 нм), не зависит от поверхностного заряда мембраны и одинакова в экспериментах с заряженной и нейтральной БЛМ. Различие зависимостей R от рН на рис. 3a для БЛМ, содержащих и не содержащих PS, объясняется различием равновесной зависимости заряда и поверхностного потенциала от рН.

Для БЛМ из PC (рис. 5) при изменении рН от 4 до 8 отрицательный поверхностный заряд растет по величине, и наибольший наклон зависимости поверхностного потенциала от рН имеет место в щелочной области выше pH 7 [16]. БЛМ из смеси PC+PS при высоких рН отрицательно заряжены, но при уменьшении рН ниже 6 заряд PS уменьшается из-за нейтрализации карбоксильной группы. В области рН от 6 до 8 поверхностный потенциал почти не меняется, за исключением небольшого сдвига при изменении рН около 8 (рис. 5), но начинает значительно изменяться при уменьшении рН ниже 6 [23–25]. Изменение потенциала при освещении коррелирует с наклоном этой зависимости: при увеличении рН от 6 до 8 для БЛМ из PC оно возрастает, а для БЛМ из смеси PC+ PS – убывает (рис. 3а). Чтобы оценить, насколько большой вклад в связывании протонов на границе БЛМ могут давать молекулы MNPS, расположенные в растворе около БЛМ, оценим толщину слоя воды, в котором количество молекул MNPS совпадает с их количеством на поверхности мембраны. Если БЛМ сформирована из PC, при концентрации MNPS в растворе 1 мМ поверхностный потенциал равен около –15 мВ (рис. 4б). При ионной силе раствора 20 мМ это соответствует поверхностному заряду 5×10–7 C/см2 или поверхностной плотности молекул на поверхности мембраны около 3×1012 молекул/см2. При концентрации в растворе 1 мМ эта же поверхностная плотность создается слоем раствора толщиной около 50 нм. Диффузия протонов к поверхности мембраны на такое расстояние может происходить за время порядка микросекунд, что достаточно быстро, чтобы вызывать изменения потенциала в интервале времени (секунды), в котором проводятся измерения.

 

Рис. 4. a – Зависимость разности граничных потенциалов БЛМ, сформированной из PC+PS, от концентрации KCl с одной стороны БЛМ. Исходный раствор содержал 10 мМ KCl и 1 мМ HEPES, pH 7.0. Кривая проведена по уравнению Гуи–Чепмена для поверхностного заряда –58 мкКл/см2. б – Зависимость изменения граничного потенциала БЛМ, вызванного адсорбцией MNPS, добавленного в раствор с одной стороны БЛМ, от его концентрации в этом растворе. Раствор содержал 20 мМ KCl, 2 мМ HEPES, pH 7.0. БЛМ сформирована либо из PC (пустые кружки, данные взяты из [15]), либо из PС+PS (черные кружки).

 

Рис. 5. Зависимость изменения граничного потенциала от рН в растворе с одной стороны БЛМ, сформированной из PC или из PC+PS. Мембрана сформирована в растворе 20 мМ KCl, 2 мМ цитрат, HEPES и Tris. Значение рН в растворе с обратной стороны от мембраны было 7 для БЛМ из PC и 8.5 для БЛМ из PC+PS. Значения потенциала для БЛМ из PC смещены на величину z-потенциала, значение которого при pH 7 составляли около –10 мВ, а для БЛМ из PC+PS – на величину поверхностного потенциала (–62 мВ), рассчитанного из зависимости изменения граничного потенциала от концентрации KCl в растворе с одной стороны от мембраны на рис. 3a. Данные для БЛМ из PC взяты из [16].

 

Полученные результаты позволяют уточнить механизм реакций, рассмотренный ранее в теоретической модели [16]. Реакция разрушения MNPS при освещении происходит как на мембране, так и в водном растворе около нее (рис. 6). Образующиеся в результате реакции на мембране анионы сульфата имеют низкое сродство к мембране и уходят в раствор, изменяя граничный потенциал в положительную сторону. Знак изменения потенциала, вызванного изменением количества протонов на поверхности БЛМ, зависит от направления потока протонов между этой поверхностью и раствором. Это зависит от того, в какую сторону отклоняется распределение протонов между поверхностью мембраны и раствором от равновесия. То, что в эксперименте вызванное протонами изменение потенциала всегда положительного знака, говорит о том, что поток протонов направлен из раствора в мембрану. Образующиеся из-за реакции в растворе анионы сульфата остаются в воде, а протоны могут остаться в растворе и связаться с молекулами буфера, а могут связаться на поверхности мембраны. Таким образом, изменение потенциала в положительную сторону при освещении вызвано как потоком в мембрану протонов, образовавшихся в растворе, так и потоком анионов сульфата из мембраны в раствор. Соотношение протонного и анионного вкладов зависит от заряда БЛМ, рН раствора и концентрации в нем буфера. Зависимость эффекта буфера от рН раствора и наличия в БЛМ заряженных липидов вызвана двумя причинами. Во-первых, заряд БЛМ влияет на количество адсорбированных на ней анионов MNPS, что определяет вклад анионов в изменение потенциала. Во-вторых, связывание протонов на поверхности БЛМ происходит с участием титруемых групп фосфолипидов, и поэтому наибольший вклад в изменение потенциала наблюдается в области рН, близких к значениям рК этих групп.

 

Рис. 6. Схема фотохимических процессов при возбуждении MNPS на поверхности мембраны и в растворе около нее. Серый прямоугольник в центре – БЛМ, в круге и овалах указаны участвующие в реакциях протоны и анионы MNPS. Красная линия показывает сдвиг граничного потенциала при освещении.

 

Рассмотренный механизм подтверждается экспериментами в [16], где показано, что при освещении БЛМ с MNPS происходит изменение не только электростатического потенциала на границе мембраны с раствором, но и рН в неперемешиваемом слое около мембраны. В этих экспериментах изменение потенциала, измеряемое методом КВП, происходило за время порядка минуты. За такое время успевала разрушиться большая часть анионов MNPS, адсорбированных на поверхности БЛМ, что приводило к значительному по величине относительному вкладу анионов в изменение потенциала. При этом сохранялось равновесие протонов, связанных на поверхности БЛМ, и в растворе. Быстрые изменения потенциала, изученные в настоящей работе, происходили за времена порядка секунд. Параметр, характеризующий кинетику процесса, определяли по скорости изменения потенциала в момент начала освещения, которое происходило за десятые доли секунды. Мы показали, что эти изменения потенциала вызваны в основном связыванием протонов на БЛМ, а вклад анионов в эти изменения мал. Возможно, в этом случае распределение протонов между мембраной и раствором далеко от равновесия, и тогда изученная нами кинетика быстрых изменений потенциала, вызванная связыванием протонов на поверхности мембраны, может определяться как прохождением протонов через потенциальный барьер на границе мембраны с водой, так и диффузией протонов (вместе с молекулами буфера) в воде.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источники финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке проекта РНФ № 23-24-00571.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

×

About the authors

V. Yu. Tashkin

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: sokolovvs@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119071

D. D. Zykova

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences; Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)

Email: sokolovvs@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119071; Dolgoprudny, 141700

L. E. Pozdeeva

Lomonosov Moscow State University

Email: sokolovvs@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

V. S. Sokolov

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: sokolovvs@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119071

References

  1. Cherepanov D.A., Feniouk B.A., Junge W., Mulkidjanian A.Y. 2003. Low dielectric permittivity of water at the membrane interface: Effect on the energy coupling mechanism in biological membranes. Biophys. J. 85 (2), 1307–1316. doi: 10.1016/S0006-3495(03)74565-2.
  2. Georgievskii Yu., Medvedev E.S., Stuchebrukhov A.A. 2002. Proton transport via the membrane surface. Biophys. J. 82, 2833–2846. doi: 10.1016/S0006-3495(02)75626-9.
  3. Agmon N., Bakker H.J., Campen R.K., Henchman R.H., Pohl P., Roke S., Thamer M., Hassanali A. 2016. Protons and hydroxide ions in aqueous systems. Chem. Rev. 116 (13), 7642–7672. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00736.
  4. Zhang C., Knyazev D.G., Vereshaga Y.A., Ippoliti E., Nguyen T.H., Carloni P., Pohl P. 2012. Water at hydrophobic interfaces delays proton surface-to-bulk transfer and provides a pathway for lateral proton diffusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (25), 9744–9749. doi: 10.1073/pnas.1121227109
  5. Weichselbaum E., Osterbauer M., Knyazev D.G., Batishchev O.V., Akimov S.A., Hai N.T., Zhang C., Knor G., Agmon N., Carloni P. 2017. Origin of proton affinity to membrane/water interfaces. Sci. Rep. 7, 4553. doi: 10.1038/s41598-017-04675-9
  6. Serowy S., Saparov S.M., Antonenko Y.N., Kozlovsky W., Hagen V., Pohl P. 2003. Structural proton diffusion along lipid bilayers. Biophys. J. 84 (2 Pt 1), 1031–1037. doi: 10.1016/S0006-3495(03)74919-4
  7. Springer A., Hagen V., Cherepanov D.A., Antonenko Y.N., Pohl P. 2011. Protons migrate along interfacial water without significant contributions from jumps between ionizable groups on the membrane surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (35), 14461–14466. doi: 10.1073/pnas.1107476108
  8. Cherepanov D.A., Junge W., Mulkidjanian A.Y. 2004. Proton transfer dynamics at the membrane/water interface: Dependence on the fixed and mobile pH buffers, on the size and form of membrane particles, and on the interfacial potential barrier. Biophys. J. 86 (2), 665–680. doi: 10.1016/S0006-3495(04)74146-6
  9. Yamashita T., Voth G.A. 2010. Properties of hydrated excess protons near phospholipid bilayers. J. Phys. Chem. B. 114 (1), 592–603. doi: 10.1021/jp908768c
  10. Nguyen T.H., Zhang C., Weichselbaum E., Knyazev D.G., Pohl P., Carloni P. 2018. Interfacial water molecules at biological membranes: Structural features and role for lateral proton diffusion. PLoS. One. 13 (2), e0193454. doi: 10.1371/journal.pone.0193454
  11. Gutman M., Nachliel E., Bamberg E., Christensen B. 1987. Time-resolved protonation dynamics of a black lipid membrane monitored by capacitative currents. Biochim. Biophys. Acta. 905 (2), 390–398. doi: 10.1016/0005-2736(87)90468-8
  12. Fibich A., Janko K., Apell H.J. 2007. Kinetics of proton binding to the sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase in the E1 state. Biophys. J. 93 (9), 3092–3104. doi: 10.1529/biophysj.107.110791
  13. Geissler D., Antonenko Y.N., Schmidt R., Keller S., Krylova O.O., Wiesner B., Bendig J., Pohl P., Hagen V. 2005. (Coumarin-4-yl)methyl esters as highly efficient, ultrafast phototriggers for protons and their application to acidifying membrane surfaces. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44 (8), 1195–1198. doi: 10.1002/anie.200461567
  14. Вишнякова В.Е., Ташкин В.Ю., Терентьев А.О., Апель Х.-Ю., Соколов В.С. 2018. Связывание ионов калия в канале доступа с цитоплазматической стороны Na,K,ATP-азы. Биол. мембраны. 35 (5), 376–383. doi: 10.1134/S0233475518040199
  15. Ташкин В.Ю., Вишнякова В.Е., Щербаков А.А., Финогенова О.А., Ермаков Ю.А., Соколов В.С. 2019. Изменение емкости и граничного потенциала бислойной липидной мембраны при быстром освобождении протонов на ее поверхности . Биол. мембраны. 36 (2), 101–108. doi: 10.1134/S0233475519020075
  16. Sokolov V.S., Tashkin V.Yu., Zykova D.D., Kharitonova Yu.V., Galimzyanov T.R., Batishchev O.V. 2023. Electrostatic potentials caused by the release of protons from photoactivated compound sodium 2-methoxy-5-nitrophenyl sulfate at the surface of bilayer lipid membrane. Membranes. 13 (8), 722. doi: 10.3390/membranes13080722
  17. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. 1963. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution. J. Phys. Chem. 67, 534–535. doi: 10.1021/j100796a529
  18. MacDonald R.C., Bangham A.D. 1972. Comparison of double layer potentials in lipid monolayers and lipid bilayers membranes. J. Membrane Biol. 7, 29–53. doi: 10.1007/BF01867908
  19. Ermakov Yu.A., Sokolov V.S. Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications. Eds. H.T.Tien, A.Ottova-Leitmannova. Amsterdam. Boston, London, New York, Oxford, Paris, Dan Diego, San Francisco, Singapore, Sidney, Tokio: Elsevier, 2003. p. 109–141.
  20. Sokolov V.S., Mirsky V.M. Ultrathin Electrochemical Chemo- and Biosensors: Technology and Performance. Ed. Mirsky V.M. Heidelberg: Springer-Verlag, 2004. p. 255–291.
  21. Cherny V.V., Sokolov V.S., Abidor I.G. 1980. Determination of surface charge of bilayer lipid membranes. Bioelectrochem. Bioenerg. 7, 413–420. doi: 10.1016/0302-4598(80)80002-X
  22. Denieva Z.G., Sokolov V.S., Batishchev O.V. 2024. HIV-1 Gag polyprotein affinity to the lipid membrane is independent of its surface charge. Biomolecules. 14 (9), 1086. doi: 10.3390/biom14091086
  23. Bangham A.D. 1968. Membrane models with phospholipids. Prog. Biophys. Mol. Biol. 18, 29–95. doi: 10.1016/0079-6107(68)90019-9
  24. Ермаков Ю.А., Авербах А.З., Арбузова А.Б., Сухарев С.И. 1998. Липидные и клеточные мембраны в присутствии гадолиния и других ионов с высоким сродством к липидам. 2. Дипольная компонента граничного потенциала мембран с разным поверхностным зарядом. Биол. мембраны. 15 (3), 330–341.
  25. Mitkova D., Marukovich N., Ermakov Yu.A., Vitkova V. 2014. Bending rigidity of phosphatidylserine-containing lipid bilayers inacidic aqueous solutions. Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects. 460, 71–78. doi: 10.1016/j.colsurfa.2013.12.059

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Kinetics of the boundary potential change during MNPS adsorption on BLM and subsequent illumination. Measurements were performed on the same membrane by the FWC method (a, b) or with an electrometric amplifier (c). b - Change in potential upon illumination obtained from the graph (a) by shifting and stretching the time scale. Arrows with corresponding labels show the moments of MNPS addition (MNPS), light on (L) and light off (D). BLM was formed from PC. The solution contained 20 mM KCl, 0.2 mM Tris, HEPES, and citrate, pH 8.0. MNPS was added to the far compartment of the cell relative to the light source at a concentration of 600 μM, and illumination was performed with an LED (365 nm, electrical power 0.12 W).

Download (95KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Dependence of the rate of change of the boundary potential at the moment of illumination on the electric power of illumination. The experimental conditions are similar to those indicated in the caption to Fig. 1. a - Kinetics of the potential change measured by electrometer at switching on (L) and switching off (D) the light with different power indicated in the caption to the figure. The dotted line demonstrates the method of determining the parameter R for the illumination power of 0.34 W as the slope of the tangent to the blue curve at the point corresponding to the zero moment of time. b - Dependence of the parameter R on the illumination power P. The measurements were carried out by the FIR method (black circles) and by electrometer (empty circles).

Download (157KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Dependence of the rate of change of the boundary potential R measured by electrometer at the moment of illumination on the solution pH (a) and buffer C concentration (b). The solution contained 20 mM KCl, 0.2 mM Tris, MES, and citrate. MNPS was added to the cell compartment farthest away from the light source at a concentration of 600 μM. Illumination was conducted at 0.03-0.4 W. Buffer concentration was varied at pH 8 by adding Tris to the solutions on either side of the membrane, and at pH 6 by adding MES. The R values in graph a were normalized to the illumination power, in graph b - to the R value measured before increasing the buffer concentration in the solution.

Download (150KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. a - Dependence of the boundary potential difference of BLM formed from PC+PS on the concentration of KCl on one side of the BLM. The initial solution contained 10 mM KCl and 1 mM HEPES, pH 7.0. The curve was drawn using the Gui-Chapman equation for a surface charge of -58 μCl/cm2. b - Dependence of the change in the BLM boundary potential caused by adsorption of MNPS added to the solution on one side of the BLM on its concentration in this solution. The solution contained 20 mM KCl, 2 mM HEPES, pH 7.0. BLM was formed from either PC (empty circles, data taken from [15]) or PC+PS (black circles).

Download (101KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Dependence of the variation of the boundary potential on pH in solution on one side of the BLM formed from PC or from PC+PS. The membrane was formed in a solution of 20 mM KCl, 2 mM citrate, HEPES and Tris. The pH value in the solution back of the membrane was 7 for BLM from PC and 8.5 for BLM from PC+PS. The potential values for the BLMs from PC were shifted by the z-potential, whose value at pH 7 was about -10 mV, and for the BLMs from PC+PS by the surface potential (-62 mV), calculated from the dependence of the change in the boundary potential on the KCl concentration in the solution on one side of the membrane in Fig. 3a. The data for BLM from PC are taken from [16].

Download (69KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. Scheme of photochemical processes under MNPS excitation on the membrane surface and in the solution near it. The gray rectangle in the center is BLM, the circle and ovals indicate the protons and anions of MNPS involved in the reactions. The red line shows the shift of the boundary potential under illumination.

Download (140KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 The Russian Academy of Sciences