Membrane-protective properties of lipid extract from marine brown alga Sargassum pallidum (Turner) C. Agardh under experimental stress conditions

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Стрессовое воздействие (психоэмоциональный фактор, переохлаждение, перегревание, тяжелая физическая нагрузка и др.) оказывает на современного человека значительное влияние. При длительном воздействии стресса в организме формируются стрессорные заболевания, или болезни адаптации (гипертоническая болезнь, атеросклероз, язвы желудочно-кишечного тракта и др.). Начало изучению влияния стресса на организм животных и человека было положено Г. Селье [1, 2], в работах которого показано стресс-индуцируемое увеличение надпочечников, инволюция тимико-лимфатической системы, изъязвления слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки (триада). Под действием различных стрессовых факторов происходит высвобождение из надпочечников в кровь «гормонов стресса» – катехоламинов, при окислении которых в печени цитохромом Р-450 увеличивается индукция свободных супероксиданионов, образуются семихинонные радикалы адреналина и возрастает концентрация гидроксил-радикалов, которые формируют свободно-радикальные реакции [3]. При длительном стрессовом воздействии происходит истощение системы антиоксидантной защиты, включается механизм перекисного окисления липидов (ПОЛ) [4] и формируется оксидативный стресс [5, 6], который сопровождается окислением белков, липидов и полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) [7]. Однако наряду с исследованиями системы «перекисное окисление липидов–антиоксидантная защита» следует обратить внимание на физиолого-биохимические нарушения структуры и функции эритроцитов [8, 9]. Ответом на ПОЛ в фосфолипидах мембран эритроцитов отмечается увеличение насыщенных и моноеновых жирных кислот, уменьшение уровня полиненасыщенных жирных кислот и индекса ненасыщенности [10]. Трансформация в соотношении жирных кислот в фосфолипидах мембран при стрессе нарушает работу мембраносвязанных ферментов, рецепцию гормонов, а также снижает лабильность эритроцитов при прохождении через микроциркулярное русло [11, 12]. При окислительном стрессе происходит нарушение липидной асимметрии мембраны (выход фосфатидилсерина в верхний монослой), что ведет к гемолизу эритроцитов [7]. В условиях умеренной гипотермии во внутреннем монослое мембран эритроцитов крыс происходит изменение в содержании фосфатидилсерина и фосфатидилинозита, а также в соотношении насыщенных, моноеновых и ПНЖК в составе фосфолипидов [13]. У крыс при изнуряющем плавании до потопления в фосфолипидах мембран эритроцитов отмечаются изменения в количественном отношении ненасыщенных жирных кислот [14]. У студентов, переживающих экзаменационный стресс, отмечалось снижение устойчивости эритроцитов к действию гемолизирующего воздействия, что связано со структурной перестройкой мембраны [15]. На основании вышеизложенного следует, что в условиях стресса возникает необходимость в профилактике возможных метаболических нарушений.

В настоящее время большое внимание уделяется исследованию морских водорослей, содержащих широкий комплекс биологически активных веществ (БАВ), которые могут использоваться в фармацевтической промышленности для профилактики и/или лечения многих заболеваний, а также как функциональные ингредиенты для инновационных продуктов [16, 17]. Сырьевая база привлекает своей доступностью и высокой самовозобновляемостью, а также большой биомассой. Отмечается невысокая сложность технологий выделения БАВ, а выделенные вещества чаще всего имеют низкую токсичность [18]. Вторичные метаболиты морских водорослей представлены не только полифенольными структурами (флоротаннины – полимеры флороглюцина), но и липидными соединениями, в частности, мембранообразующими – фосфатидилхолином и фосфатидилэтаноламином, в состав которых входят эссенциальные ПНЖК семейства n-3 [19]. В литературе представлены работы по использованию ПНЖК семейства n-3 в условиях экспериментального стресса и формирования ряда патологий на животных. Так, Ю.С. Сидоровой и соавт. [20] отмечалось, что при истощающей физической нагрузке (бег по беговой дорожке с регулируемой скоростью и наклоном) введение крысам в рацион докозагексаеновой кислоты с астаксантином способствовало увеличению фагоцитарной активности нейтрофилов и сохранению антиоксидантного статуса организма. Омега-3 ПНЖК (эйкозапентаеновая и докозагексаеновая жирные кислоты) показали свою эффективность как противовоспалительные средства при посттравматическом стрессе у крыс (принудительное плавание) [21]. Известны работы, в которых было показано, что при экспериментальной атерогенной гиперлипидемии введение в рацион крыс липосомальной формы эссенциальных ПНЖК (12.2% от общего количества жирных кислот) снижало содержание общего холестерина, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и повышало уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) до значений у интактных животных [22]. Липидный комплекс из морской красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis способствовал снятию состояния дислипидемии и гиперхолестеринемии в плазме крови крыс, а также восстанавливал фосфолипидный состав мембран эритроцитов при экспериментальном стрессе [23]. Также этот липидный комплекс показал выраженный антиоксидантный и гепатозащитный эффект, который превосходил таковой у препарата сравнения «Эссенциале», при интоксикации четыреххлористым углеродом [24]. Водно-спиртовый экстракт из морской зеленой водоросли Ulva lactuca восстанавливал размерные характеристики эритроцитов и показатели антиоксидантной защиты печени крыс на модели токсического гепатита [25]. Сульфатированный полисахарид фукоидан, выделенный из морской бурой водоросли Cystoseira myrica, обладал антикоагулянтными и антиоксидантными свойствами in vitro [26]. Рядом авторов показана эффективность приема липидных экстрактов из морских водорослей при некоторых заболеваниях у людей. Липидные комплексы из Ulva rigida и Codium tomentosum обладают профилактическими свойствами при хроническом воспалении и имеют потенциал в качестве функционального ингредиента пищевых продуктов [27]. Омега-3 ПНЖК были эффективны при дислипидемии у ВИЧ-позитивных пациентов. В плазме крови таких больных снижалось количество триацилглицеринов (ТАГ) и возрастал уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП) без изменений уровня общего холестерина, холестерина липопротеинов очень низкой и низкой плотности, а также аполипопротеинов В и А1 в сыворотке крови [28]. У людей с риском сердечно-сосудистых заболеваний Омега-3 ПНЖК из водорослей снижали в плазме крови уровень ТАГ и холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП) [29]. Из морской бурой водоросли Sargassum muticum и красной водоросли Solieria chordalis были выделены липидные экстракты, которые показали высокую антирадикальную активность [30]. На основании вышеизложенного следует, что препараты из морских водорослей имеют широкий спектр своего фармакологического действия. Однако этот сырьевой ресурс в настоящее время не имеет широкого применения.

В профилактике нарушений структурной организации мембран эритроцитов перспективным направлением является использование липидных экстрактов из морских водорослей. К таковым следует отнести липидный экстракт из морской бурой водоросли Sargassum pallidum (Turner) C. Agardh, широко распространенной в заливе Петра Великого Японского моря. Водоросль относится к отделу Phaeophyta – бурые водоросли, порядок Fucales – фукусовые, семейство Sargassaceae. Окраска таллома от оливково-желтого до темно-бурой. Цвет обусловлен присутствием пигмента фукоксантина, имеющего бурый цвет. Это многолетнее, кустистое растение до 2–2.5 м высотой [31]. Растет на каменистом, илисто-песчаном или песчано-каменистом грунте на глубине до 10 м. В составе таллома S. pallidum присутствует высокое содержание веществ липидной природы. Фосфолипидный состав представлен фосфатидилглицерином, фосфатидилэтаноламином и фосфатидилинозитом [32]. В состав гликолипидов и фосфолипидов входят ПНЖК семейств n-6 и n-3, на долю которых приходится до 40% всех жирных кислот (арахидоновая, эйкозапентаеновая, докозагексаеновая жирные кислоты) [32, 33], что обеспечивает фармакологические свойства липидного комплекса. Подробный липидный состав экстракта из таллома S. pallidum был представлен в наших ранее опубликованных работах [34, 35]. В составе общих липидов экстракта (26.0 ± 0.2 мг/г сухой ткани) присутствовали общие гликолипиды (10.8 ± 0.1 мг/г сухой ткани), общие нейтральные липиды (12.6 ± 0.1 мг/г сухой ткани), общие фосфолипиды (2.60 ± 0.02 мг/г сухой ткани). Нейтральные липиды представлены следующими классами: ТАГ, холестерин (ХС), диацилглицерины+моноацилглицерины (ДАГ+МАГ), свободные жирные кислоты (СЖК), эфиры холестерина (ЭХС). В ряду фосфолипидных классов присутствовали фосфатидилэтаноламин (ФЭ), фосфатидилглицерин (ФГ), фосфатидилинозит (ФИ). Среди жирных кислот следует отметить, что содержание насыщенных жирных кислот составляло 19.8% от суммы всех жирных кислот, моноеновых – 12.6%, ПНЖК – 67.6%, из которых сумма кислот семейства n-6 составляла 46.5%, а кислот семейства n-3 – 21.1%. Количественные характеристики липидного состава экстракта согласуются с литературными данными [32, 36]. Таким образом, липидный экстракт из таллома S. pallidum имеет широкие возможности применения в качестве препарата с мембранопротекторными свойствами, в частности, для восстановления нарушенной липидной составляющей мембран эритроцитов при стрессе. Также до сих пор многие вопросы мембраностабилизирующего действия липидного экстракта саргассума в условиях стресса остаются не изучены.

Цель работы – оценка изменений липидного состава мембран эритроцитов крыс при экспериментальном стрессе и возможность коррекции липидным экстрактом из таллома морской бурой водоросли Sargassum pallidum.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы водоросли Sargassum pallidum собирали в летний период в прибрежных водах бухты Алексеева, о-в Попова, зал. Петра Великого (Японское море). Выборка водорослей составляла 15 талломов. Водоросли тщательно очищали от эпифитов и частиц песка, промывали сначала морской, затем водопроводной водой, после чего отжимали и погружали в кипящую воду на 2 мин для инактивации ферментов. Далее таллом сушили при температуре, не превышающей 50℃, после чего измельчали с помощью лабораторной мельницы до размеров частиц 0.5–1 мм. Получение липидного экстракта осуществляли общепринятым методом для выделения липидов из растительного и животного сырья смесью хлороформ : метанол (1:2 по объему) [37]. Липидный экстракт представляет собой маслообразную массу зелено-коричневого цвета.

Эксперимент проводили на беспородных белых крысах-самцах массой тела 150 ± 3 г, полученных из питомника филиала «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России. Исследования на животных выполнены в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил лабораторной практики» и требованиями ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики». Животные были адаптированы в виварии в течение 7 сут до начала эксперимента (карантин). Во время этого периода осуществляли ежедневный осмотр внешнего состояния крыс и в эксперимент были взяты животные без признаков отклонений в состоянии здоровья. Животные получали питьевую воду без ограничений и корм ежедневно в одно и то же время в режиме свободного доступа. После прохождения карантина крыс произвольно распределяли на интактных (контроль), потреблявших на протяжении всего эксперимента сбалансированный рацион, и крыс, подвергавшихся стрессу. Острый стресс моделировали путем вертикальной фиксации животных за дорсальную шейную складку на 24 ч [38]. Препараты вводили в желудок через зонд дважды: непосредственно перед вертикальной фиксацией и через 6 ч после первого введения. Стандартизацию липидного экстракта саргассума проводили по сумме общих липидов. Липидный экстракт саргассума и препарат сравнения Омега-3 (Now Foods, США) вводили в дозе 1 г/кг массы животного [39]. Животным контрольной группы и группы «стресс» вводили в той же дозе вазелиновое масло категории «медицинское», которое является химически инертным и не оказывает влияния на результаты эксперимента [40].

В ходе исследования были выделены четыре группы по 10 животных в каждой: 1-я группа – контроль; 2-я группа – стресс (вертикальная фиксация); 3-я группа – стресс + липидный экстракт саргассума; 4-я группа стресс + Омега-3. Животных выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (European Convention, Страсбург, 1986).

Эритроциты из крови, взятой в вакуумные пробирки с зеленой крышкой Vacuette, выделяли общепринятым методом центрифугирования. Для получения мембранной массы эритроциты вносили в дистиллированную воду, где происходил их полный гемолиз. Полученную мембранную массу трижды отмывали охлажденным до +4℃ изотоническим раствором NaCl с последующим центрифугированием, каждый раз удаляя надосадочную жидкость. Для определения среднего объема и среднего диаметра эритроцитов использовали автоматический гематологический анализатор Abacus (Diatron, Австрия). Для оценки осмотической резистентности эритроцитов использовали метод определения к изменению концентрации NaCl [41]. Экстракты общих липидов из мембран эритроцитов готовили по методу Фольча [42], количество общих липидов в экстракте определяли весовым методом. Суспензию силикагеля марки «КСК» (ООО «Лабхимос», Россия) и пластинки размером 6 × 6 см для двумерной микротонкослойной хроматографии фосфолипидов и нейтральных липидов готовили по методу В.И. Светашева и В.Е. Васьковского [43]. Для разделения фосфолипидов на фракции использовали системы растворителей, описанные Роузером [44]. Для обнаружения холинсодержащих фосфолипидов (фосфатидилхолин, лизофосфатадилхолин, сфингомиелин) использовали реактив Драгендорфа [45]; липиды проявлялись в виде оранжевых пятен на желтом фоне. Для обнаружения фосфолипидов, содержащих аминогруппу (фосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин), пластинки опрыскивали 5% раствором нингидрина в ацетоне [44] с последующим нагреванием в течение 2–3 мин над парами воды до появления розовых пятен на белом фоне. Фосфолипиды, содержащие гидроксильные группы (фосфатидилинозит), обнаруживали с помощью периодатного реактива Шиффа [46], пятна липидов имели розово-сиреневый цвет. Для проявления всех фосфолипидных фракций применяли молибдатный реактив [47]. Липиды проявлялись в виде синих пятен на белом фоне. Для количественного определения каждой фракции использовали 10% раствор серной кислоты в метаноле с последующим нагреванием. Разделение нейтральных липидов для выделения фракции холестерина в липидном экстракте из мембран эритроцитов осуществляли методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле [48]. Количество отдельных фракций фосфолипидов рассчитывали по методу В.Е. Васьковского и соавт. [47] с принятым алгоритмом их количественного определения и выражали в процентах от общей суммы фосфолипидов и нейтральных липидов соответственно. Определение жирнокислотного состава липидного экстракта мембран эритроцитов проводили методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ). Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) получали при использовании метода переэтерификации липидов [49] и далее очищали с помощью ТСХ, используя систему гексан : диэтиловый эфир (95:5 по объему). МЭЖК анализировали на газовом хроматографе «ЛХМ-2000» (ОАО «Хроматограф», Россия) с пламенно-ионизационным детектором, капиллярная колонка НР-5-МS c 5% фенилметилсилоксаном (30 м × 0.25 мм, Agilent, США), газ-носитель – гелий. Температура инжектора 180℃. Идентификацию МЭЖК проводили путем сравнения времени удерживания и путем сравнения с известными стандартами [50]. Результаты выражали в процентах от суммы жирных кислот.

Количественные данные обрабатывали с использованием статистического пакета Instat 3.0 (GraphPad, Software Inc., США) со встроенной процедурой проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Данные приводили в виде среднего значения ± ошибка среднего (M ± m) при n = 10.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стресс – вертикальная фиксация крыс за дорсальную шейную складку в течение 24 ч, которая сопровождалась известными атрибутами стресса: снижение массы селезенки на 29% (0.15 ± 0.01 мг по сравнению с 0.21 ± 0.01 мг в контроле p < 0.01), увеличение массы надпочечников на 53% (3.17 ± 0.03 мг по сравнению с 2.07 ± 0.02 мг в контроле, p < 0.001), появление язвенных поражений слизистой оболочки желудка (2.6 ± 0.1 шт/животное, в контроле – 0). Отмечалось увеличение среднего диаметра (СДЭ) и среднего объема эритроцитов (СОЭр) (табл. 1). Так, СДЭ превышал контрольные значения на 12% (7.23 ± 0.05 мкм против 6.35 ± 0.02 мкм в контроле; р < 0.001), СОЭр – на 33% (76 ± 3 мкм³ против 51 ± 3 мкм³; р < 0.001). Начало гемолиза эритроцитов при внесении их в растворы NaCI от 0.8 до 0.3% происходило при концентрации 0.55 ± 0.01% NaCl, т.е. раньше, чем в контроле (0.45 ± 0.02% NaCl). Окончание гемолиза также было раньше, чем в контроле (0.45 ± 0.01% NaCl против 0.35 ± 0.01% NaCl в контроле), что указывает на пониженную устойчивость мембран эритроцитов к гемолизирующему воздействию. Содержание общих фосфолипидов (ОФЛ) в мембране эритроцитов было ниже на 20% (52 ± 2% по сравнению с 65 ± 2% в контроле, р < 0.001), тогда как уровень холестерина (ХС) вырос на 16% (25.7 ± 0.7% по сравнению с 22.1 ± 0.8% в контроле, р < 0.001). В связи с этим увеличилось значение коэффициента ХС/ОФЛ до 0.49 ± 0.02 (р < 0.001) по сравнению с 0.34 ± 0.02 в контроле.

 

Таблица 1. Физиологические и биохимические показатели эритроцитов крыс и их коррекция липидным экстрактом саргассума и Омега-3 при экспериментальном стрессе (M ± m)

Показатели	1-я группа контроль	2-я группа стресс	3-я группа стресс + саргассум	4-я группа стресс + Омега-3
Средний диаметр эритроцитов (СДЭ, мкм)	6.35 ± 0.02	7.23 ±0.053	6.6 ± 0.1в	6.6 ± 0.1
Средний объем эритроцитов (СОЭр, мкм3)	51 ± 3	76 ± 33	56 ± 2в	57 ± 2
Осмотическая резистентность (% NaCl)	0.45 ± 0.01 0.35 ± 0.01	0.55 ± 0.013 0.45 ± 0.023	0.45 ± 0.02в 0.35 ± 0.01в	0.45 ± 0.02 0.35 ± 0.01
Общие фосфолипиды (% от общих липидов)	65 ± 2	52 ± 23	66 ± 2в	66 ± 2в
Холестерин (% от общих липидов)	22.1 ± 0.8	25.7 ± 0.73	21.2 ± 0.5в	21.9 ± 0.7б
Холестерин/фосфолипиды	0.34 ± 0.02	0.49 ± 0.023	0.32 ± 0.01в	0.33 ± 0.02в

Примечание. Различия статистически достоверны при: ¹ – р < 0.05; ² – р < 0.01; ³ – р < 0.001 по сравнению с контролем; ^а – р < 0.05; ^б – р < 0.01; ^в – р < 0.001 по сравнению со 2-й группой.

 

Как видно из табл. 2, под действием стресса в мембранах эритроцитов происходят изменения в величинах фосфолипидных фракций: снижение уровня фосфатидилхолина (ФХ) на 7% (р < 0.01) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) на 15% (р < 0.01) при одновременном увеличении лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) на 17–18% (р < 0.05–0.01). Данный факт обусловлен активацией фосфолипазы А₂ при стрессе [51]. Отмечалось повышенное содержание сфингомиелина (СМ) на 13% (р < 0.05), что является компенсаторной реакцией на снижение уровня ФХ. Значение фосфатидилсерина (ФС) было ниже контроля на 16% (р < 0.01), тогда как выше контроля отмечались уровни фосфатидилинозита (ФИ) (на 19%, p < 0.01) и фосфатидной кислоты (ФК) (на 12%, р < 0.05). Изменения в соотношении метаболически активных фракций фосфолипидов (ФС, ФИ и ФК) предполагают изменение активности мембраносвязанной Na⁺,K⁺-ATP-азы [52]. При анализе жирнокислотных спектров основных структурных фосфолипидов мембран эритроцитов при стрессе отмечались достоверные отличия от контроля (табл. 3, 4). Так, в составе фосфатидилхолина (табл. 3) возросла сумма насыщенных жирных кислот до 46% (в контроле – 43%). Это обусловлено ростом значений миристиновой кислоты на 17% (р < 0.001), пальмитиновой и стеариновой кислот в среднем на 5–8% (р < 0.05). Следует отметить увеличение значения мононенасыщенной пальмитолеиновой кислоты на 16% (р < 0.001). В ряду ПНЖК семейства n-6 отмечалось снижение линолевой кислоты на 8% (р < 0.05) и арахидоновой кислоты на 15% (р < 0.01). Снижение содержания в ряду ПНЖК семейства n-3 – линоленовой кислоты на 10% (р < 0.05), эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот – в среднем на 11% (р < 0.001) явилось причиной падения суммы ненасыщенных жирных кислот до 54% (в контроле – 57%), что способствовало росту индекса насыщенности до 0.82 (в контроле – 0.75).

 

Таблица 2. Биохимические показатели мембран эритроцитов крыс и их коррекция липидным экстрактом саргассума и Омега-3 при экспериментальном стрессе (%, M ± m)

Фосфолипиды	1-я группа контроль	2-я группа стресс	3-я группа саргассум	4-я группа Омега-3
ФХ	36.0 ± 0.6	33.4 ± 0.62	36.4 ± 0.6б	35.2 ± 0.6а
ЛФХ	8.8 ± 0.1	10.4 ± 0.42	8.2 ± 0.4б	9.0 ± 0.3а
СМ	14.5 ± 0.7	16.4 ± 0.51	14.4 ± 0.4б	15.2 ± 0.3а
ФЭ	18.1 ± 0.5	15.4 ± 0.62	18.3 ± 0.6б	18.3 ± 0.6б
ЛФЭ	7.5 ± 0.4	8.8 ± 0.41	7.3 ± 0.3б	7.6 ± 0.3а
ФС	5.7 ± 0.2	4.8 ± 0.22	5.7 ± 0.2б	5.5 ± 0.1а
ФИ	5.4 ± 0.2	6.4 ± 0.22	5.6 ± 0.1в	5.0 ± 0.1в
ФК	4.03 ± 0.16	4.50 ± 0.091	4.13 ± 0.08б	4.27 ± 0.05а
ХС	20.4 ± 0.5	21.8 ± 0.33	19.3 ± 0.4в	20.1 ± 0.5в
ЛФХ/ФХ	0.24 ± 0.02	0.31 ± 0.021	0.22 ± 0.01в	0.26 ± 0.01а
ФХ/СМ	2.48 ± 0.12	2.02 ± 0.082	2.53 ± 0.11б	2.30 ± 0.07а
ФЭ+ФС ФХ+СМ	0.47 ± 0.02	0.40 ± 0.021	0.47 ± 0.02а	0.47 ± 0.02а
ФК+ФС+ФЭ+ФИ ФХ+СМ	0.66 ± 0.01	0.62 ± 0.011	0.66 ± 0.01а	0.66 ± 0.01а

Примечание. Различия статистически достоверны при: ¹ – р < 0.05; ² – р < 0.01; ³ – р < 0.001 по сравнению с контролем; ^а – р < 0.05; ^б – р < 0.01; ^в – р < 0.001 по сравнению со 2-й группой. ФХ – фосфатидилхолин, ЛФХ – лизофосфатидилхолин, СМ – сфингомиелин, ФЭ – фосфатидилэтаноламин, ФС – фосфатидилсерин, ФИ – фосфатидилинозит, ФК – фосфатидная кислота, ХС – холестерин.

 

Таблица 3. Содержание основных видов жирных кислот в фосфатидилхолине мембран эритроцитов крыс и их коррекция липидным экстрактом саргассума и Омега-3 при экспериментальном стрессе (% от суммы всех фракций, М ± m)

Жирные кислоты	1-я группа контроль	2-я группа стресс	3-я группа стресс + саргассум	4-я группа стресс + Омега-3
Миристиновая (14:0)	1.16 ± 0.02	1.36 ± 0.023	1.13 ± 0.02в	1.24 ± 0.03б
Пальмитиновая (16:0)	27.9 ± 0.5	29.2 ± 0.51	27.9 ± 0.4а	27.9 ± 0.4а
Стеариновая (18:0)	13.9 ± 0.4	15.0 ± 0.41	14.0 ± 0.2а	14.3 ± 0.2
Пальмитолеиновая (16:1)	2.16 ± 0.02	2.50 ± 0.023	2.13 ± 0.02в	2.10 ± 0.02в
Олеиновая (18:1)	18.6 ± 0.5	19.4 ± 0.4	18.3 ± 0.4	18.1 ± 0.4а
Линолевая (18:2 n-6)	19.6 ± 0.5	18.0 ± 0.41	19.2 ± 0.3а	19.2 ± 0.4а
Арахидоновая (20:4 n-6)	11.8 ± 0.4	10.0 ± 0.42	11.8 ± 0.4б	11.8 ± 0.4б
Линоленовая (18:3 n-3)	1.24 ± 0.02	1.11 ± 0.013	1.26 ± 0.02в	1.24 ± 0.02в
Эйкозапентаеновая (20:5 n-3)	1.25 ± 0.02	1.11 ± 0.013	1.28 ± 0.02в	1.28 ± 0.02в
Докозагексаеновая (22:6 n-3)	2.57 ± 0.03	2.28 ± 0.023	3.01 ± 0.02в	2.84 ± 0.02в
Сумма насыщенных	43.0 ± 0.3	46.0 ± 0.33	43.0 ± 0.3в	43.0 ± 0.3в
Сумма ненасыщенных	57.0 ± 0.2	54.0 ± 0.33	57.0 ± 0.3в	57.0 ± 0.3в
Индекс насыщенности	0.75 ± 0.02	0.82 ± 0.021	0.75 ± 0.02а	0.75 ± 0.02а
20:4 n-6 / 18:2 n-6	0.60 ± 0.02	0.55 ± 0.011	0.62 ± 0.02б	0.61 ± 0.02а
20:4 n-6 / 20:5 n-3	9.42 ± 0.08	9.00 ± 0.073	9.23 ± 0.05а	9.20 ± 0.06а

Примечание. Различия статистически достоверны при: ¹ – р < 0.05; ² – р < 0.01; ³ – р < 0.001 по сравнению с контролем; ^а – р < 0.05; ^б – р < 0.01; ^в – р < 0.001 по сравнению со 2-й группой.

 

Таблица 4. Содержание основных видов жирных кислот в фосфатидилэтаноламине мембран эритроцитов крыс и их коррекция липидным экстрактом саргассума и Омега-3 при экспериментальном стрессе (% от суммы всех фракций, М ± m)

Жирные кислоты	1-я группа контроль	2-я группа стресс	3-я группа стресс + саргассум	4-я группа стресс + Омега-3
Миристиновая (14:0)	1.27 ± 0.02	1.40 ± 0.023	1.20 ± 0.02в	1.22 ± 0.01в,1
Пальмитиновая (16:0)	29.7 ± 0.5	31.0 ± 0.41	29.6 ± 0.51	29.8 ± 0.4а
Стеариновая (18:0)	17.7 ± 0.4	18.2 ± 0.3	17.7 ± 0.4	18.0 ± 0.4
Пальмитолеиновая (16:1)	4.13 ± 0.04	4.85 ± 0.033	4.17 ± 0.02в	4.50 ± 0.02в
Олеиновая (18:1)	8.6 ± 0.3	9.5 ± 0.21	8.6 ± 0.3a	8.9 ± 0.2
Линолевая (18:2 n-6)	8.6 ± 0.3	7.8 ± 0.21	8.5 ± 0.2a	8.4 ± 0.2
Арахидоновая (20:4 n-6)	23.2 ± 0.4	22.0 ± 0.41	23.3 ± 0.4a	22.9 ± 0.4
Линоленовая (18:3 n-3)	1.46 ± 0.02	1.35 ± 0.022	1.48 ± 0.01в	1.39 ± 0.011
Эйкозапентаеновая (20:5 n-3)	1.60 ± 0.02	1.33 ± 0.013	1.63 ± 0.02в	1.57 ± 0.01в
Докозагексаеновая (22:6 n-3)	3.75 ± 0.03	2.57 ± 0.023	3.85 ± 0.02в	3.74 ± 0.02в
Сумма насыщенных	49.0 ± 0.2	51.0 ± 0.33	48.0 ± 0.2в	49.0 ± 0.3а
Сумма ненасыщенных	51.0 ± 0.3	49.0 ± 0.33	52.0 ± 0.3в	51.0 ± 0.3а
Индекс насыщенности	0.96 ± 0.01	1.00 ± 0.012	0.92 ± 0.01в	0.96 ± 0.02а
20:4 n-6 / 18:2 n-6	2.72 ± 0.03	2.82 ± 0.021	2.72 ± 0.03а	2.74 ± 0.03а
20:4 n-6 / 20:5 n-3,	14.5 ± 0.6	16.5 ± 0.71	14.3 ± 0.6а	14.6 ± 0.5а

Примечание. Различия статистически достоверны при: ¹ – р < 0.05; ² – р < 0.01; ³ – р < 0.001 по сравнению с контролем; ^а – р < 0.05; ^б – р < 0.01; ^в – р < 0.001 по сравнению со 2-й группой.

 

В составе фосфатидилэтаноламина эритроцитарных мембран (табл. 4) сумма насыщенных жирных кислот увеличилась до 51% (в контроле – 49%) за счет роста значения миристиновой кислоты на 10% (р < 0.01) и пальмитиновой кислоты – на 4% (р < 0.05). В ряду мононенасыщенных жирных кислот отмечалось увеличение пальмитолеиновой (на 17%, р < 0.001) и олеиновой (на 11%, р < 0.05) жирных кислот. В ряду ПНЖК семейства n-6 следует отметить уменьшение величины линолевой кислоты на 9% (р < 0.05), а в ряду ПНЖК семейства n-3 – эйкозапентаеновой кислоты – на 17% (р < 0.001) и докозагексаеновой кислоты – на 31% (р < 0.001). В результате отмечалось снижение суммы ненасыщенных жирных кислот до 49% (в контроле – 51%) и рост индекса насыщенности до 1.00 (в контроле – 0.96).

На основании вышеизложенного следует, что влияние стресса сопровождалось изменениями как в соотношении фосфолипидных фракций в мембране эритроцитов, так и в жирнокислотном составе ФХ и ФЭ как основных структурных единиц мембран. По нашему мнению, изменение жирнокислотного состава фосфолипидов может предполагать появление их модифицированных молекулярных видов. Возможно, это способствовало изменению размерных характеристик эритроцитов и снижению устойчивости клеток к гемолизирующему воздействию.

Было проведено сравнение размерных характеристик эритроцитов и значений ОФЛ и ХС в их мембранах в 3-й и 4-й группах с соответствующими величинами во 2-й группе «стресс» (табл. 1). Так, введение липидного экстракта саргассума (3-я группа) и препарата сравнения Омега-3 (4-я группа) в период вертикальной фиксации сопровождалось снижением среднего диаметра и среднего объема эритроцитов по сравнению с соответствующими величинами при стрессе без препаратов. При этом величина СДЭ равнозначно в обеих группах снизилась на 9% (p < 0.001), а СОЭр – на 25–26% (p < 0.001). Осмотическая резистентность эритроцитов к снижению концентрации NaCl сохранялась на уровне контрольных величин и составляла в обеих группах 0.45 ± 0.02% в начале гемолиза и 0.35 ± 0.01% при его завершении. Эти значения статистически достоверно отличались от таковых во 2-й группе в среднем на 22% (начало гемолиза, р < 0.001) и 29% (завершение гемолиза, р < 0.001). Следует отметить равнозначное увеличение ОФЛ в 3-й и 4-й группах в среднем на 32% (р < 0.001). Уровень ХС в 3-й группе снизился на 21% (р < 0.001), а в 4-й группе – на 18% (р < 0.01). Коэффициент ХС/ОФЛ снизился в обеих опытных группах на 41% (р < 0.001).

При сравнении величин фосфолипидных фракций в мембранах эритроцитов крыс в 3-й и 4-й группах с соответствующими в группе «стресс» следует отметить повышение уровня ФХ в среднем на 9% (р < 0.01) и 5% (р < 0.05) соответственно, а также ФЭ – равнозначно в среднем на 19% (р < 0.01) (табл. 2). Одновременно было выявлено снижение количества лизофракций: ЛФХ – на 11% (p < 0.01) и 14% (р < 0.05), ЛФЭ – на 17% (р < 0.01) и 13% (р < 0.05). Значение СМ снизилось на 12% (р < 0.01) и 7% (р < 0.05). В ряду метаболически активных фракций фосфолипидов следует отметить увеличение уровня ФС на 20% (р < 0.01) и 14% (р < 0.01) соответственно. Величина ФИ снизилась на 14% (р < 0.05) и 22% (р < 0.001), а ФК – на 8% (p < 0.05) и 5% (р < 0.001).

Введение липидного экстракта саргассума и Омега-3 сопровождалось общей тенденцией к восстановлению содержания жирных кислот в составе ФХ и ФЭ до контрольных величин. В то же время при сравнении со 2-й группой отмечались достоверные различия (табл. 3, 4). Так, в составе ФХ следует отметить снижение уровня миристиновой кислоты на 17% и 9% (р < 0.01–0.001), пальмитиновой кислоты на 5% (р < 0.05) и стеариновой кислоты на 5–7% (р < 0.05) (табл. 3). В ряду мононенасыщенных жирных кислот был снижен уровень пальмитолеиновой кислоты на 15–16% (р < 0.001) и олеиновой кислоты на 6% (р < 0.05). В то же время в обеих группах равнозначно возрос уровень линолевой кислоты (семейство n-6) на 6% (р < 0.05) и арахидоновой кислоты на 18% (р < 0.01). Среди ПНЖК семейства n-3 в составе ФХ было статистически достоверно увеличен уровень линоленовой кислоты в среднем на 14% (р < 0.001) при введении экстракта саргассума и на 12% (р < 0.001) при введении Омега-3. Отмечался равнозначный рост уровня эйкозапентаеновой кислоты на 15% (р < 0.001), тогда как содержание докозагексаеновой кислоты в составе ФХ возросло на 32% (р < 0.001) и 25% (р < 0.001) в 3-й и 4-й группах соответственно. Сумма насыщенных жирных кислот в обеих группах снизилась до 43%, а сумма ненасыщенных жирных кислот возросла до 57%, что обусловило снижение индекса насыщенности до 0.75.

В составе ФЭ эритроцитарных мембран крыс при введении препаратов отмечалась аналогичная направленность изменений величин жирных кислот, как и в составе ФХ (табл. 4). Сравнение полученных значений жирных кислот в составе ФЭ (3-я и 4-я группы) с таковыми величинами во 2-й группе (стресс) следует отметить снижение насыщенных жирных кислот: миристиновой – на 13–14% (р < 0.001), пальмитиновой – на 4% (р < 0.05) и стеариновой – на 2–3%. В ряду моноеновых жирных кислот значение пальмитолеиновой кислоты снизилось в обеих экспериментальных группах в среднем на 14% (р < 0.001), олеиновой кислоты – на 10% (р < 0.05) при введении экстракта саргассума и на 6% при введении Омега-3. Уровни линолевой кислоты (семейство n-6) увеличились при введении экстракта саргассума на 10% (р < 0.001), а при введении Омега-3 – на 7%. При этом содержание линоленовой кислоты в составе ФЭ достоверно выросло в 3-й группе на 10% (р < 0.001), а в 4-й группе – на 3%. При исследовании показателей жирных кислот семейства n-3 следует отметить увеличение эйкозапентаеновой кислоты на 23% (р < 0.001) в 3-й группе и на 18% (р < 0.001) в 4-й группе. Содержание докозагексаеновой кислоты наиболее значимо выросло при введении экстракта саргассума (на 50%, р < 0.001), тогда как при введении Омега-3 – на 46% (р < 0.001). Сумма насыщенных жирных кислот при введении экстракта саргассума снизилась до 48%, тогда как при введении Омега-3 – до 49%. Сумма ненасыщенных жирных кислот возросла в 3-й группе до 52%, а в 4-й группе – до 51%, в результате индекс насыщенности составил 0.92 и 0.96 соответственно. Сравнение содержания жирных кислот в составе ФЭ с соответствующими в контроле показало статистически достоверные отличия при введении Омега-3 в уровнях миристиновой кислоты (снижение на 6%, р < 0.05) и линоленовой кислоты (снижение на 5%, р < 0.05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Стрессовое воздействие (вертикальная фиксация крыс за дорсальную шейную складку) сопровождалось проявлениями основных атрибутов стресса (увеличение массы надпочечников, снижение массы селезенки, язвы на слизистой желудка), а также увеличением среднего объема и среднего диаметра эритроцитов, снижением осмотической резистентности к гемолизирующему воздействию. Эти нарушения обусловлены изменениями липидной составляющей мембран эритроцитов (перераспределение фосфолипидных фракций и жирных кислот в их составе). Известно, что при стрессе формируется дислипидемия [4], при которой повышается уровень ЛПНП в крови, что способствует встраиванию холестерина из ЛПНП в мембраны эритроцитов, приводящее к увеличению их размеров и изменению формы: происходит превращение двояковогнутых дисков в сфероциты и эхиноциты, что обусловливает их повышенный гемолиз [53].

Рост отношения ХС/ФЛ при стрессе приводит к изменению текучести липидной фазы [54]. Учитывая асимметрию структуры биомембран, мы провели расчет соотношения ФХ/СМ (наружный монослой) и обнаружили снижение этого значения, что также подтверждает увеличение микровязкости [55]. Расчет отношения величин ЛФХ/ФХ показал достоверное его увеличение в эритроцитарных мембранах этой группы животных. Данный факт можно расценить как следствие активации фосфолипазных реакций, сопровождающихся накоплением лизоформ фосфолипидов. Следует отметить модификацию фосфолипидного матрикса и во внутреннем монослое мембранного бислоя эритроцитов, что свидетельствует о разбалансировке липидной составляющей и возникновении в нем структурно-функциональных нарушений. Подтверждением является расчет коэффициента асимметрии (ФЭ+ФС) / (ФХ+СМ) (отношение суммы фосфолипидов с меньшей насыщенностью к сумме фосфолипидов с большей насыщенностью), который показал его снижение при стрессе у крыс. При расчете коэффициента окисляемости, который характеризует отношение легкоокислямых фосфолипидов к трудноокисляемым фосфолипидам (ФК+ФС+ФЭ+ФИ) / (ФХ+СМ), отмечалось его снижение, что является критерием повышения жесткости мембраны [56]. Также известно, что снижение величин метаболически активных фракций (ФЭ, ФС), необходимых для функционирования мембраносвязанных ферментов (Na⁺,K⁺-ATP-аза, ферменты дыхательной цепи митохондрий и др.), сопровождается снижением транспортной функции и энергетического обмена [56]. Повышение уровня ФК свидетельствует также об активации специфических фосфолипаз, так как эта структура является основой для синтеза ФХ и ФЭ, значения которых были снижены. При исследовании жирнокислотных спектров в составе основных структурных фосфолипидов мембран (ФХ и ФЭ) отмечалась общая закономерность: увеличение индекса насыщенности, который обусловлен снижением величин полиненасыщенных жирных кислот (семейств n-6 и n-3) и повышением суммы насыщенных жирных кислот (миристиновой, пальмитиновой и стеариновой). Эти изменения являются результатом угнетения активности ферментов элонгаз и десатураз, которое тормозит процессы синтеза полиненасыщенных жирных кислот. Данное заключение было сделано на основе расчета коэффициентов соотношения величин жирных кислот, которые могут характеризовать активность этих ферментов (табл. 3, 4). Так, соотношение величин 20:4 n-6 / 18:2 n-3 характеризует Δ6- и Δ5-десатуразу и элонгазу, а соотношение величин 20:4 n-6 / 20:5 n-3 характеризует Δ5-десатуразу [57]. Также следует отметить рост значений мононенасыщенных жирных кислот (пальмитолеиновой и олеиновой), т.е. воздействие стресса сопровождается появлением новых молекулярных видов фосфолипидов. Нарушения в структуре фосфолипидов мембран эритроцитов и их соотношение в фосфолипидной составляющей при стрессе может являться основополагающим фактором в становлении стрессовых заболеваний [58]. Полученные результаты определяют необходимость профилактики стресса с использованием БАВ природного происхождения. К ним следует отнести липидный экстракт саргассума, содержащий в своем составе широкий спектр БАВ (фосфолипидные классы, насыщенные, мононенасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты семейств n-6 и n-3) и препарат сравнения Омега-3 (моноеновые, эйкозапентаеновая и докозагексаеновая жирные кислоты), которые могут обеспечить восстановление нарушенных мембранных структур эритроцитов, т.е. входящие в его состав липидные фракции могут активно вовлекаться в процесс регуляции физиологических и биохимических реакций организма.

Известно, что ценность БАВ из морских гидробионтов обусловлена, прежде всего, свойствами входящих в них ПНЖК семейства n-3. Применение рациона с морскими липидами, по-видимому, приводит к встраиванию ПНЖК в фосфолипидные лизоформы и их восстановлению в главные структурные компоненты биомембран – ФХ и ФЭ. В результате отмечается увеличение значений этих классов фосфолипидов по сравнению с соответствующими величинами в группе «стресс» и снижение уровней ЛФХ и ЛФЭ. Кроме того, ПНЖК способны снижать активность фосфолипаз [59]. Так как ПНЖК взаимодействуют с ХС с участием фермента ЛХАТ (лецитин-холестерин-ацилтрансфераза), то происходит его утилизация из мембран в виде эфиров ХС. Также в результате активации реакций этерификации происходит преобразование ТАГ в фосфолипиды, что нормализует соотношение холестерин/фосфолипиды. В обеих группах крыс отмечалось снижение содержания СМ, в результате чего возросло соотношение ФХ/СМ. Снижение уровня ФК, по нашему мнению, обусловлено синтезом фосфолипидных классов, в частности ФХ и ФЭ. Аналогичная направленность изменений в составе фосфолипидов в мембранах эритроцитов отмечалась и при введении препарата сравнения Омега-3. Следовательно преобразования в структурной организации мембран отразились на восстановлении размерных характеристик эритроцитов и осмотической устойчивости до контрольных значений в обеих группах с применением препаратов.

Сравнивая значения исследованных физиологических параметров эритроцитов и биохимических показателей их мембран при введении липидного экстракта саргассума и препарата сравнения Омега-3 в условиях стресса отмечались наиболее значимые эффекты у липидного экстракта саргассума. Известно, что в состав препарата Омега-3, выделенного из ценных пород рыб, преимущественно входят эйкозапентаеновая и докозагексаеновая жирные кислоты, а также мононенасыщенные жирные кислоты. В составе липидного экстракта саргассума присутствует 5 фракций нейтральных липидов (МАГ, ДАГ, ТАГ, СЖК, ЭХС) как метаболитов для биохимических реакций, 3 фракции фосфолипидов (ФЭ, ФГ, ФИ), жирные кислоты семейства n-3 (α-линоленовая, стеаридоновая и эйкозапентаеновая, докозагексаеновая), n-6 (линолевая, эйкозатриеновая и арахидоновая) и мононенасыщенные жирные кислоты (пальмитолеиновая, цис-вакценовая, олеиновая). Следует отметить, что в липидном экстракте саргассума и в препарате сравнения Омега-3 содержание эссенциальных жирных кислот составляло 300 мг в 1 г общих липидов. Однако более широкий спектр липидных структур в составе экстракта саргассума, по-видимому, мог способствовать более высокой биологической активности по сравнению с таковой у препарата Омега-3.

На основании полученных результатов можно предположить, что изучение экстрактов, в состав которых входят «морские» липиды, может служить перспективным направлением для исследования морских гидробионтов с целью получения препаратов со стресс-протекторными и липид-корригирующими свойствами.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа выполнена в рамках госзадания ФГБУН ТОИ ДВО РАН по теме «Эколого-биогеохимические процессы в морских экосистемах: роль природных и антропогенных факторов» (0211-2021-0014). Регистрационный № 121-21500052-9.

Соответствие принципам этики. Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены и одобрены Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН (протокол № 20 от 15.09.2022 г.).

About the authors

N. F. Kushnerova

Il’ichev Pacific Oceanological Institute, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: natasha50@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690041

S. E. Fomenko

Il’ichev Pacific Oceanological Institute, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: natasha50@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690041

V. G. Sprygin

Il’ichev Pacific Oceanological Institute, Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: natasha50@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok, 690041

T. V. Momot

Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University)

Email: natasha50@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

References

Supplementary files