Electrostatic potentials during adsorption and photochemical reactions of pyranine on bilayer lipid membranes

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Adsorption and photochemical reactions of pyranine on a bilayer lipid membrane (BLM) have been studied by measuring electrostatic potentials at the membrane–water interface. The dependence of the electrostatic potentials due to the adsorption of pyranine on its concentration in solution is described by the Gouy–Chapman theory assuming that anions with three charged groups are adsorbed on the membrane. No significant changes in the boundary potential were found when BLM with pyranine adsorbed on it was illuminated. Significant changes in the potential were observed if molecules of styryl dyes di-4-ANEPPS or RH-421 were adsorbed on BLM in addition to pyranine. The sign and magnitude of these changes correspond to the disappearance of the dipole potential created by styryl dye molecules on the BLM. The rate of potential disappearance was proportional to pyranine concentration and illumination intensity. The disappearance of the potential can be caused either by the binding of protons released from the pyranine molecule to the dye molecules with their subsequent desorption from the BLM or by their destruction. Pyranine and styryl dye molecules can form complexes at the BLM boundary. This is evidenced by experiments in which the sum of the potential changes caused by their adsorption separately differed significantly from the change in the boundary potential during their simultaneous adsorption. The kinetics of the disappearance of the dipole potential of BLM with styryl dyes upon excitation of pyranine turned out to be similar to that observed earlier with another compound, 2-methoxy-5-nitrophenyl sodium sulfate, which releases protons at the membrane boundary upon illumination (Konstantinova et al., 2021. Biochem. (Mosc.), Suppl. Series A: Membr. Cell Biol. 15 (2), 142–146). This suggests that it is associated with the desorption of dye molecules from the membrane, due to the binding of protons released from excited pyranin molecules to them.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Для изучения кинетики функционирования белков, осуществляющих транспорт протонов через мембрану, используют соединения, выделяющие протоны на поверхности мембраны при поглощении ими света (caged-H+). Адсорбцию и фотохимические реакции таких соединений можно изучать на бислойных липидных мембранах (БЛМ) с помощью методов, позволяющих измерять скачок электростатического потенциала на границе мембраны с раствором [1, 2]. Существуют два типа таких соединений. В соединениях первого типа освобождение протона при поглощении света происходит в результате необратимой реакции, в ходе которой от молекулы отрывается кислотный остаток [3–6]. Соединение этого типа – 2-метокси-5-нитрофенилсульфат натрия (MNPS), молекула которого при возбуждении необратимо высвобождает сульфат и протон, изучалось нами ранее на БЛМ методом компенсации внутримембранного поля [1, 2]. Было показано, что его молекулы адсорбируются на БЛМ как анионы, а при их возбуждении возникает скачок потенциала, вызванный частично разрушением на БЛМ этих анионов, частично – связыванием на БЛМ протонов, освободившихся в результате этой реакции. Вызванные связыванием протонов изменения потенциала определялись зависимостью поверхностного заряда БЛМ от рН, вызванной наличием титруемых групп фосфолипидов [2]. Это ограничивало чувствительность данного метода и область рН, в которой можно было проводить измерения. Более чувствительные методы используют флуоресцентные зонды, позволяющие оценить изменение концентрации протонов на поверхности мембраны с помощью оптических измерений [7–12]. Возможен также альтернативный метод оценки изменения концентрации протонов на поверхности мембраны по изменению электростатических потенциалов, вызванных стириловыми красителями – di-4-ANEPPS или RH-421. Их молекулы обладают значительным дипольным моментом, образованным отрицательно заряженной сульфогруппой на одном конце молекулы и положительно заряженным атомом азота – на другом. Из-за этого дипольного момента молекулы красителя, адсорбируясь на поверхности мембраны, создают на ней скачок потенциала [13]. Эти красители изначально использовались для регистрации электрического поля в мембране [14, 15]. Молекулы этих красителей также могут окисляться синглетным кислородом, что позволило найти им еще одно применение – для изучения фотосенсибилизаторов, причем кинетику их окисления в мембране можно регистрировать, измеряя скачок потенциала на границе мембраны с раствором [16]. Адсорбция молекул красителей на мембране зависит от рН, поэтому их можно использовать и как зонды для регистрации протонов, связанных на поверхности БЛМ. Это было продемонстрировано в экспериментах с MNPS: при фотоиндуцированном освобождении протонов из молекул MNPS происходило уменьшение потенциала, вызванного адсорбцией di-4-ANEPPS на поверхности БЛМ [17].

В фотоактивируемых соединениях другого типа освобождение протона происходит из-за диссоциации молекулы, pK которой в возбужденном состоянии оказывается значительно ниже pK в основном состоянии [18, 19]. Наиболее изученным соединением такого класса является пиранин. При возбуждении молекулы пиранина происходит диссоциация протона, который затем может присоединяться к акцептору, прежде всего к молекуле воды. Пиранин применялся и как флуоресцентный индикатор изменения рН в растворе, и как индикатор степени гидратации среды [20], и как фоточувствительный источник протонов при изучении кинетики протонного транспорта через мембраны [21]. В настоящей работе показано, что пиранин способен адсорбироваться на БЛМ и вызывать при освещении десорбцию с мембраны молекул стириловых красителей аналогично изученному нами ранее MNPS.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бислойную липидную мембрану формировали из дифитаноилфосфатидилхолина (Avanti Polar Lipids, США), растворенного в н-декане в концентрации 15 мг/мл, по методу Мюллера–Рудина [22] на отверстии диаметром 0.8 мм в перегородке тефлоновой ячейки.

Водные растворы, применявшиеся в экспериментах, содержали KCl («Реахим», Россия), лимонную кислоту («Реахим», Россия), HEPES (Sigma, США), Tris (Sigma) и были приготовлены на дважды дистиллированной воде. В экспериментах были использованы стириловые красители di-4-ANEPPS и RH-421, а также 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (пиранин) (Sigma-Aldrich, США).

Стириловые красители и пиранин добавляли в дальний (по отношению к источнику света) отсек ячейки. Растворы в обоих отсеках ячейки непрерывно перемешивались с помощью магнитной мешалки. При освещении БЛМ постоянным светом использовали ультрафиолетовый светодиод с длиной волны 375 нм и максимальной электрической мощностью 3 Вт. Мощность освещения регулировали, варьируя величину подаваемого на светодиод напряжения.

В электрических измерениях использовали хлорсеребряные электроды, контакт которых с растворами в ячейке осуществлялся через агаровые мостики, изготовленные из пластиковых носиков. Нижняя часть носика была заполнена агаром (использовался 3% агар, приготовленный в растворе 100 мМ KCl), верхняя – тем же раствором, который находился в ячейке. Электростатические потенциалы на границе мембраны с раствором измеряли методом компенсации внутримембранного поля [23, 24]. Установка для электрических измерений емкости мембраны и разности граничных потенциалов была идентична описанной нами ранее [2, 17]. Измеренное значение разности граничных потенциалов непрерывно записывалось на диск компьютера. Кинетику изменения граничного потенциала при освещении аппроксимировали экспоненциальными функциями с помощью программы, написанной авторами. Это позволило определить скорость изменения потенциала в момент начала освещения как производную соответствующей экспоненты.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При добавлении пиранина в раствор с одной стороны БЛМ наблюдалось изменение разности граничных потенциалов ∆φb, знак которой соответствовал адсорбции на мембране отрицательно заряженных молекул. Зависимость ∆φb от концентрации пиранина в растворе изображена на рис. 1. Если предположить, что скачок потенциала удовлетворяет теории Гуи–Чепмена, то наклон этой зависимости от логарифма концентрации C адсорбирующихся ионов в растворе определяется количеством их заряженных групп z [23–25]. Величина предельного наклона при увеличении концентрации ионов определяется простой формулой

φ=22z+1RTFlnC+φ0, (1)

где R – газовая постоянная, T – абсолютная температура, F – число Фарадея, φ0 – постоянная. Экспериментальная зависимость потенциала от логарифма концентрации хорошо аппроксимируется прямой, построенной при z = 3. Это свидетельствует об адсорбции на БЛМ молекул с тремя отрицательными зарядами, что согласуется со структурой пиранина, молекула которого имеет три отрицательно заряженные сульфогруппы.

 

Рис. 1. Зависимость разности граничных потенциалов БЛМ ∆φb от концентрации пиранина C в растворе с одной стороны от мембраны. БЛМ сформирована в растворе 20 мМ KCl, 2 мМ Tris, HEPES и цитрат, pH 6.0. Прямая проведена по уравнению (1) при z = 3.

 

Освещение БЛМ с адсорбированными на ней молекулами пиранина не приводило к изменению ∆φb. Это можно объяснить тем, что в возбужденное состояние переходит лишь небольшая часть молекул пиранина, и поэтому количество освободившихся из них протонов мало по сравнению с общим количеством анионов пиранина, адсорбированных на мембране, которые и создают скачок потенциала на ее границе. Если измеренное нами изменение потенциала при адсорбции пиранина составляло десятки милливольт, то его изменение при освещении должно быть на порядки меньше и составлять микровольты. Измеренное в работе [26] изменение потенциалов при возбуждении пиранина мощной короткой вспышкой лазера было порядка 100 мкВ. В экспериментах с MNPS изменение потенциала было значительно больше из-за того, что при освещении происходило необратимое разрушение этих молекул на БЛМ [1, 2]. Поэтому продукты этой реакции накапливались, и количество выделившихся протонов было значительно больше.

Если в ячейку, помимо пиранина, добавляли di-4-ANEPPS, то освещение БЛМ приводило к изменению потенциала противоположного знака по отношению к потенциалу, вызванному адсорбцией di-4-ANEPPS (рис. 2). При прекращении освещения происходило восстановление потенциала. Если освещение происходило в течение короткого времени, менее 1 мин, восстановление было почти полным. При более длительном освещении восстановление потенциала было неполным.

 

Рис. 2. Кинетика изменения разности граничных потенциалов БЛМ при добавлении в в раствор с одной стороны от мембраны di-4-ANEPPS в концентрации 6 мкМ (а) или RH-421 в концентрации 7.5 мкМ (б) и пиранина в концентрации 100 мкМ, а также при последующем включении (L) и выключении света (D). БЛМ сформирована в растворе 20 мМ KCl, 0.2 мМ Tris, HEPES и цитрат, pH 7. Моменты добавления di-4-ANEPPS, RH-421 и пиранина, а также включения и выключения света показаны стрелками.

 

Изменение потенциала при освещении происходило только тогда, когда и di-4-ANEPPS, и пиранин были добавлены в раствор с одной стороны БЛМ. В случае, когда эти соединения добавляли по разные стороны БЛМ, изменения потенциала при освещении не происходило. Аналогичная кинетика изменения потенциала при освещении с пиранином наблюдалась и с другим красителем – RH-421.

Для количественной оценки скорости реакции в работе [17] определяли наклон относительного изменения потенциала в момент начала освещения. Аналогичный параметр был использован и в настоящей работе. Он определялся как наклон зависимости от времени изменения потенциала в момент начала освещения, нормированный на величину потенциала, возникающего при адсорбции этих красителей. Этот параметр оказался пропорционален концентрации пиранина в растворе и интенсивности освещения (рис. 3).

 

Рис. 3. Зависимость скорости уменьшения дипольного потенциала, вызванного адсорбцией di-4-ANEPPS, от концентрации пиранина С (а, мощность освещения 0.4 Вт), и от мощности освещения Р (б, концентрация пиранина 10 мкM). БЛМ сформирована в растворе 20 мМ KCl, 0.2 мМ Tris, HEPES и цитрат, pH 7.0.

 

Кинетика изменения потенциала при освещении напоминает наблюдавшуюся ранее при разрушении молекул di-4-ANEPPS синглетным кислородом, образующимся при освещении в присутствии фотосенсибилизаторов [16], а также с другим соединением, освобождающим протоны на поверхности мембраны, – MNPS [17].

Уменьшение потенциала при освещении объясняется десорбцией молекул ANEPPS с мембраны, что может быть вызвано их взаимодействием с возбужденными молекулами пиранина. Возможно, с этим связана необратимость фотоэффекта. Для того чтобы проверить, не происходит ли окисление молекул ANEPPS активными формами кислорода, были проведены эксперименты в атмосфере аргона. Они показали, что в отсутствие кислорода фотоэффект на БЛМ остается таким же, каким он был в атмосфере воздуха. Дополнительным свидетельством, позволяющим исключить участие в реакции синглетного кислорода, служит отсутствие эффекта освещения, если пиранин и di-4-ANEPPS находились в растворах по разные стороны мембраны. В случае реакций с синглетным кислородом фотоэффект наблюдался, когда di-4-ANEPPS и фотосенсилизатор были с разных сторон мембраны, поскольку синглетный кислород, образующийся на противоположной стороне мембраны, способен проникать через нее [16]. Поэтому исчезновение молекул ANEPPS на поверхности мембраны не может быть связано с их окислением активными формами кислорода. Разрушение молекул ANEPPS, если и происходит, может быть вызвано прямым взаимодействием этих молекул с возбужденными молекулами пиранина.

О взаимодействии пиранина и стириловых красителей говорят эксперименты, в которых сравнивали изменения граничного потенциала БЛМ, вызванные адсорбцией этих соединений на мембране по отдельности, с изменениями потенциала, вызванными их адсорбцией вместе. После того, как в раствор с одной стороны мембраны добавляли di-4-ANEPPS и вызванное его адсорбцией изменение граничного потенциала достигало стационарной величины, в растворы с разных сторон БЛМ поочередно добавляли пиранин. В этом случае изменения потенциала, вызванные адсорбцией пиранина на разных сторонах мембраны, заметно различались. Зависимость изменения ∆φb от суммарной концентрации пиранина, добавленного в раствор с двух сторон БЛМ, показана на рис. 4. Как можно видеть на рисунке, изменение потенциала, вызванного адсорбцией пиранина с той стороны БЛМ (цис), где находится di-4-ANEPPS, значительно выше, чем с противоположной стороны (транс), где его нет. Зависимость изменения потенциала от концентрации пиранина с транс-стороны близка к зависимости, полученной в эксперименте, где пиранин добавлялся в ячейку в отсутствие di-4-ANEPPS (рис. 1). Это означает, что адсорбция пиранина на БЛМ не зависит от того, присутствует ли di-4-ANEPPS в противоположном от мембраны растворе. Однако, если пиранин и di-4-ANEPPS находятся в растворе вместе, то изменение потенциала, вызванное увеличением концентрации пиранина в этом растворе, оказывается существенно больше изменения, вызванного адсорбцией пиранина в растворе с противоположной стороны, где нет di-4-ANEPPS. Иначе говоря, измерение потенциала при одновременной адсорбции di-4-ANEPPS и пиранина не равно сумме изменений потенциала при их адсорбции по отдельности. Это можно объяснить либо тем, что пиранин подавляет адсорбцию di-4-ANEPPS, либо, наоборот, di-4-ANEPPS усиливает адсорбцию пиранина, либо на БЛМ адсорбируется комплекс di-4-ANEPPS с пиранином, вызывая изменение потенциала, отличное от суммарного изменения, вызванного этими соединениями по отдельности. Аналогичное влияние на изменение потенциала при адсорбции пиранина оказывал и другой стириловый краситель – RH-421.

 

Рис. 4. Зависимость изменения граничного потенциала БЛМ, вызванного адсорбцией пиранина, от его концентрации в растворе, в котором также присутствует 5 мкМ di-4-ANEPPS (белые кружки), и в отсутствие di-4-ANEPPS (черные кружки). БЛМ сформирована в растворе 20 мМ KCl, 2 мМ Tris, HEPES и цитрат, pH 7.0.

 

Изменение потенциала при освещении БЛМ с адсорбированными на ней молекулами di-4-ANEPPS и пиранина по знаку соответствует уходу из мембраны молекул красителей. При этом максимальное по величине изменение потенциала при освещении совпадало с потенциалом, вызванным адсорбцией di-4-ANEPPS в отсутствие пиранина. Это свидетельствует в пользу того, что дипольный потенциал, создаваемый молекулами di-4-ANEPPS на мембране, не зависит от присутствия на ней пиранина. Тогда описанные выше эксперименты с совместной адсорбцией di-4-ANEPPS и пиранина (рис. 4), скорее всего, указывают на влияние первого соединения на адсорбцию второго, а не наоборот.

Другой механизм изменения потенциала при освещении БЛМ предполагает, что уход молекул красителя из мембраны вызван связыванием с молекулами красителя протонов, вызвободившихся при возбуждении молекул пиранина. Аналогичный механизм предполагался ранее при изучении MNPS. Десорбция молекул красителя вызвана тем, что их протонирование приводит к образованию заряженной формы, которая обладает низким сродством к липидной мембране. Из-за образования заряженной формы красителя в растворе, потенциал, вызванный его адсорбцией на БЛМ, зависит от рН раствора [17]. Скорости процесса, определенные количественно как скорости относительного изменения потенциала в момент начала освещения, в случае с пиранином оказались значительно выше, чем с MNPS. Кроме того, в случае с MNPS освещение приводило к существенному изменению потенциала и в отсутствие красителей, поэтому кинетика изменения потенциала с красителями оказывалась многофазной [17]. В случае с пиранином освещение мембраны без красителей не приводило к заметному изменению потенциала. Поэтому кинетика изменения потенциала с красителями оказалась более простой (рис. 2).

Для того чтобы проверить возможность участия протонов в уходе молекул красителя из мембраны, были проведены эксперименты по влиянию концентрации буфера на этот процесс. Известно, что буфер подавляет реакцию выделения протонов из возбужденных молекул пиранина на поверхности мембраны. В экспериментах с прямым измерением переноса протонов на БЛМ при возбуждении пиранина лазерной вспышкой буфер подавлял амплитуду сигнала, но почти не влиял на кинетику восстановления его равновесия после вспышки [26]. Можно было ожидать, что при увеличении концентрации буфера уменьшится количество протонов, освобождаемых на поверхности мембраны, что приведет к уменьшению скорости ухода с нее молекул красителей. Однако эффект буфера оказался противоположным: скорость изменения потенциала при увеличении концентрации буфера в растворе незначительно возрастала (рис. 5). Это можно объяснить либо тем, что перенос протонов от молекулы пиранина к молекуле красителя происходит внутри комплекса этих молекул и поэтому от буфера не зависит, либо тем, что в данном случае самой медленной, лимитирующей процесс, является стадия диффузии протонов в неперемешиваемом слое воды около мембраны. Похожий по знаку эффект буфера наблюдался нами и с другим фоточувствительным соединением – MNPS: при увеличении концентрации буфера происходило ускорение изменения поверхностного заряда мембраны при связывании на ней протонов, выделившихся при освещении. Это объяснялось влиянием буфера на диффузию в неперемешиваемом слое [2].

 

Рис. 5. Зависимость скорости исчезновения потенциала при освещении от концентрации HEPES в растворе. БЛМ сформирована в растворе 20 мМ KCl, 0.2 мМ Tris, HEPES и цитрат, pH 7.0. Концентрация пиранина 10 мкМ, мощность освещения 0.2 Вт.

 

Таким образом, исчезновение дипольного потенциала БЛМ со стириловыми красителями наблюдалось при активации двух видов Caged-H+ c разным механизмом освобождения протонов: MNPS, у которого при возбуждении происходит необратимый отрыв сульфогруппы с одновременным освобождением протона, и пиранина, у которого протон обратимо освобождается из-за изменения pK при возбуждении молекулы. Это позволяет предположить, что вызванный освещением уход молекул красителя связан с переносом протонов в мембране от доноров – молекул Caged-H+ к акцепторам – молекулам красителей. Возможно, это происходит по поверхности мембраны. Свойства протонов на поверхности мембраны и возможность их переноса вдоль нее имеют важное значение в функционировании белков, участвующих в трансмембранном транспорте протонов [12, 27, 28]. Обнаруженный в работе перенос протонов в мембране от пиранина к стириловым красителям может быть использован для разработки новых подходов к изучению данного процесса с помощью электрических измерений.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 23-24-00571.

Соответствие принципам этики. Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

×

About the authors

V. S. Sokolov

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: sokolov.valerij@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

V. Yu. Tashkin

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: sokolov.valerij@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071

D. D. Zykova

Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences; Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University)

Email: sokolov.valerij@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119071; Dolgoprudny, Moscow oblast, 141700

L. E. Pozdeeva

Lomonosov Moscow State University

Email: sokolov.valerij@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119991

References

  1. Ташкин В.Ю., Вишнякова В.Е., Щербаков А.А., Финогенова О.А., Ермаков Ю.А., Соколов В.С. 2019. Изменение емкости и граничного потенциала бислойной липидной мембраны при быстром освобождении протонов на ее поверхности . Биол. мембраны. 36 (2), 101–108. doi: 10.1134/S0233475519020075
  2. Sokolov V.S., Tashkin V.Yu., Zykova D.F., Kharitonova Yu.V., Galimzyanov T.R., Batishchev O.V. 2023. Electrostatic Potentials Caused by the Release of Protons from Photoactivated Compound Sodium 2-Methoxy-5-nitrophenyl Sulfate at the Surface of Bilayer Lipid Membrane. Membranes. 13, 722. doi: 10.3390/membranes13080722
  3. Geissler D., Antonenko Y.N., Schmidt R., Keller S., Krylova O.O., Wiesner B., Bendig J., Pohl P., Hagen V. 2005. (Coumarin-4-yl)methyl esters as highly efficient, ultrafast phototriggers for protons and their application to acidifying membrane surfaces. Angew.Chem.Int.Ed Engl. 44(8), 1195–1198. doi: 10.1002/anie.200461567
  4. Abbruzzetti S., Sottini S., Viappiani C., Corrie J.E. 2006. Acid-induced unfolding of myoglobin triggered by a laser pH jump method. Photochem.Photobiol.Sci. 5(6), 621–628. doi: 10.1039/b516533d
  5. Fibich A., Apell H.J. 2011. Kinetics of luminal proton binding to the SR Ca-ATPase. Biophys.J. 101(8), 1896–1904. doi: 10.1016/j.bpj.2011.09.014
  6. Ташкин В.Ю., Щербаков А.А., Апель Х.-Ю., Соколов В.С. 2013. Конкурентный транспорт ионов натрия и протонов в цитоплазматическом канале Na + , K + -ATP-азы. Биол. мембраны. 30 (2), 105–114.
  7. Serowy S., Saparov S.M., Antonenko Y.N., Kozlovsky W., Hagen V., Pohl P. 2003. Structural proton diffusion along lipid bilayers. Biophys.J. 84 (2 Pt 1), 1031–1037. doi: 10.1016/S0006-3495(03)74919-4
  8. Springer A., Hagen V., Cherepanov D.A., Antonenko Y.N., Pohl P. 2011. Protons migrate along interfacial water without significant contributions from jumps between ionizable groups on the membrane surface. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (35), 14461–14466. doi: 10.1073/pnas.1107476108
  9. Weichselbaum E., Osterbauer M., Knyazev D.G., Batishchev O.V., Akimov S.A., Hai N.T., Zhang C., Knor G., Agmon N., Carloni P., Pohl P. 2017. Origin of proton affinity to membrane/water interfaces. Sci.Rep. 7, 4553. doi: 10.1038/s41598-017-04675-9
  10. Weichselbaum E., Galimzyanov T., Batishchev O.V., Akimov S.A., Pohl P. 2023. Proton Migration on Top of Charged Membranes. Biomolecules. 13 (2), 352. doi: 10.3390/biom13020352
  11. Zhang C., Knyazev D.G., Vereshaga Y.A., Ippoliti E., Nguyen T.H., Carloni P., Pohl P. 2012. Water at hydrophobic interfaces delays proton surface-to-bulk transfer and provides a pathway for lateral proton diffusion. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 109(25), 9744–9749. doi: 10.1073/pnas.1121227109
  12. Heberle J., Riesle J., Thiedemann G., Oesterhelt D., Dencher N.A. 1994. Proton migration along the membrane surface and retarded surface to bulk transfer. Nature. 370 (6488), 379–382. doi: 10.1038/370379a0
  13. Malkov D.Y., Sokolov V.S. 1996. Fluorescent styryl dyes of the RH series affect a potential drop on the membrane/solution boundary. Biochem.Biophys.Acta. 1278, 197–204. doi: 10.1016/0005-2736(95)00197-2
  14. Gross D., Loew L.M. 1989. Fluorescent indicators of membrane potential: microspectrofluorometry and imaging. Methods Cell Biol. 30, 193–218. doi: 10.1016/S0091-679X(08)60980-2
  15. Clarke R.J., Kane D.J. 1997. Optical detection of membrane dipole potential: avoidance of fluidity and dye-induced effects. Biochim.Biophys.Acta. 1323 (2), 223–239. doi: 10.1016/s0005-2736(96)00188-5
  16. Sokolov V.S., Gavrilchik A.N., Kulagina A.O., Meshkov I.N., Pohl P., Gorbunova Y.G. 2016. Voltage-sensitive styryl dyes as singlet oxygen targets on the surface of bilayer lipid membrane. J. Photochem. Photobiol.B. 161, 162–169. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2016.05.016
  17. Константинова А.Н., Харитонова Ю.В., Ташкин В.Ю., Соколов В.С. 2021. Стириловые красители di-4-ANEPPS и RH-421 как датчики протонов на поверхности липидных мембран. Биол. мембраны. 38 (2), 123–128. doi: 10.31857/S0233475521020079
  18. Gutman M. 1986. Application of the laser-induced proton pulse for measuring the protonation rate constants of specific sites on proteins and membranes. Methods Enzymol. 127, 522–538. doi: 10.1016/0076-6879(86)27042-1
  19. Gutman M. 1984. The pH jump: probing of macromolecules and solutions by a laser-induced, ultrashort proton pulse--theory and applications in biochemistry. Methods Biochem.Anal. 30, 1–103. doi: 10.1002/9780470110515.ch1
  20. Nandi R., Amdursky N.A. 2022. The dual use of the pyranine (HPTS) fluorescent probe: A ground-state pH indicator and an excited-state proton transfer probe. Acc.Chem.Res. 55, 2728–2739. doi: 10.1021/acs.accounts.2c00458
  21. Gutman M., Nachliel E., Gershon E., Giniger R. 1983. Kinetic analysis of the protonation of a surface group of a macromolecule. Eur.J.Biochem. 134 (1), 63–69. doi: 10.1111/j.1432-1033.1983.tb07531.x
  22. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. 1963. Methods for the formation of single bimolecular lipid membranes in aqueous solution. J.Phys.Chem. 67, 534–535.
  23. Ermakov Yu.A., Sokolov V.S. 2003. Planar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications.Ed. Tien H.T., Ottova-Leitmannova A. Amsterdam etc: Elsevier, p. 109–141.
  24. Sokolov V.S., Mirsky V.M. 2004. Ultrathin electrochemical chemo- and biosensors: Technology and performance. Ed. Mirsky V.M. Heidelberg: Springer-Verlag, P. 255–291.
  25. McLaughlin, S. 1977. Electrostatic potentials at membrane-solution interfaces. In: Current topics in membranes and transport. Eds. Bronner F., Kleinzeller A. New York, San Francosco, London: Acad. Press. V. 9, p. 71–144. https://doi.org/10.1016/S0070-2161(08)60677-2.
  26. Gutman M., Nachliel E., Bamberg E., Christensen B. 1987. Time-resolved protonation dynamics of a black lipid membrane monitored by capacitative currents. Biochim.Biophys. Acta. 905 (2), 390–398.
  27. Agmon N., Bakker H.J., Campen R.K., Henchman R.H., Pohl P., Roke S., Thamer M., Hassanali A. 2016. Protons and hydroxide ions in aqueous systems. Chem.Rev. 116 (13), 7642–7672. doi: 10.1021/acs.chemrev.5b00736
  28. Knyazev D.G., Silverstein T.P., Brescia S., Maznichenko A., Pohl P. 2023. A new theory about interfacial proton diffusion revisited: the commonly accepted laws of electrostatics and diffusion prevail. Biomolecules. 13 (11), 1641. doi: 10.3390/biom13111641

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Dependence of the difference in the boundary potentials of the BLM ∆φb on the concentration of pyranine C in the solution on one side of the membrane. The BLM was formed in a solution of 20 mM KCl, 2 mM Tris, HEPES and citrate, pH 6.0. The straight line is drawn according to equation (1) at z = 3.

Download (33KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Kinetics of changes in the boundary potential difference of the BLM upon addition of di-4-ANEPPS at a concentration of 6 μM (a) or RH-421 at a concentration of 7.5 μM (b) and pyranine at a concentration of 100 μM to the solution on one side of the membrane, as well as upon subsequent switching on (L) and switching off of the light (D). The BLM was formed in a solution of 20 mM KCl, 0.2 mM Tris, HEPES and citrate, pH 7. The moments of addition of di-4-ANEPPS, RH-421 and pyranine, as well as switching on and off of the light are shown by arrows.

Download (101KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Dependence of the rate of decrease of the dipole potential caused by the adsorption of di-4-ANEPPS on the concentration of pyranine C (a, illumination power 0.4 W), and on the illumination power P (b, pyranine concentration 10 μM). BLM was formed in a solution of 20 mM KCl, 0.2 mM Tris, HEPES and citrate, pH 7.0.

Download (75KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Dependence of the change in the boundary potential of BLM caused by the adsorption of pyranine on its concentration in a solution in which 5 μM di-4-ANEPPS is also present (white circles) and in the absence of di-4-ANEPPS (black circles). BLM was formed in a solution of 20 mM KCl, 2 mM Tris, HEPES and citrate, pH 7.0.

Download (37KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. Dependence of the rate of potential disappearance upon illumination on the concentration of HEPES in the solution. BLM was formed in a solution of 20 mM KCl, 0.2 mM Tris, HEPES and citrate, pH 7.0. The concentration of pyranine was 10 μM, the illumination power was 0.2 W.

Download (36KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 The Russian Academy of Sciences