On the Feasibility of Using an Acedane-Based Fluorescent Probe to Monitor Hydrogen Sulfide in Primary Neuronal Cultures

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Эндогенный сероводород (сульфид водорода, H₂S) рассматривают в качестве третьего газообразного трансмиттера меж- и внутриклеточных сигналов наравне с оксидом азота (NO) и монооксидом углерода (CO) [1–6]. H₂S может образовываться в различных клетках, тканях, органах и системах двумя ферментами цистатионин-β-синтазой и цистатионин-γ-лиазой, использующими L-цистеин и гомоцистеин в качестве субстратов. В клетках мозга и эпителия сосудов был обнаружен третий фермент 3-меркаптопируват сульфидтрансфераза (3-mercaptopyruvate sulfurtransferase; EC2.8.1.2) [2, 7], который совместно с цистеинаминотрансферазой (производит H₂S, используя в качестве субстратов L-цистеин и α-кетоглутарат [8–11]. Нарушения сигнального пути H₂S проявляются при нейродегенеративных заболеваниях (болезнь Альцгеймера, синдром Дауна) [12, 13].

Для исследования роли H₂S во внутриклеточном сигналинге критично наличие флуоресцентных зондов, чувствительных к низким концентрациям H₂S, обладающих высокой яркостью (сочетанием большой молярной экстинкции и высокого квантового выхода флуоресценции), скоростью реагирования с H₂S, имеющих значительное смещение спектров эмиссии относительно спектров возбуждения (смещение Стокса) и низкую фототоксичность. Важно также знать, в каком компартменте клетки зонд локализуется. В нормальных условиях в клетке и внеклеточной среде H₂S существует преимущественно в форме аниона HS^–, и поэтому желательно, чтобы флуоресцентный зонд мог реагировать также с этим анионом. Разработка флуоресцентных зондов, обладающих перечисленными свойствами, продолжается [13–17], однако их комMерческая доступность пока весьма ограничена. Среди доступных можно отметить флуоресцентный зонд на H₂S и его анионную форму HS^–, созданный группой K.H. Ahn на основе производных ацедана (acedan) [1]. В указанной работе синтезировано несколько производных ацедана, названных Р1, Р2 и P3, которые образуют в присутствии H₂S карбоциклические соединения, включающие сульфгидрильную группу и имеющие яркую флуоресценцию, и большое смещение Стокса (свыше 100 нм). Наиболее удачным по спектральным характеристикам и скорости реагирования с H₂S оказалось производное P3 (csP3, аббревиатура предложена авторами настоящей работы). Производные ацедана обладают высокой чувствительностью флуоресценции к полярности микроокружения, что позволяет рассматривать их как зонды внутриклеточных структурных перестроек [18]. В этой связи возникает вопрос: в какой мере изменение флуоресценции P3, добавленного к культуре клеток, отражает образование csP3 в результате увеличения концентрации внутриклеточного H₂S, и в какой степени изменение флуоресценции отражает перераспределение P3 и csP3 между компартментами клетки с различной полярностью?

В данной работе мы проверили пригодность csP3 для регистрации изменений H₂S в растворах, имитирующих минимальный солевой состав внутриклеточный среды, а также в клетках первичной нейрональной культуры из коры головного мозга крысы. Обнаружено что продукт реакции P3 с сульфидом натрия (Na₂S), который служил донором HS^–, чувствителен к изменению солевого состава внутриклеточной среды и, по-видимому, постепенно перераспределяется между водным и более гидрофобным окружением – вероятно, внутриклеточными мембранами и белками. Эти процессы могут происходить при добавлении нейротоксических доз глутамата, что осложняет интерпретацию сигналов зонда P3 как индикатора H₂S.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Измерения спектральных характеристик и кинетики образования флуоресцирующего зонда. Измерения спектров флуоресценции P3 и кинетики образования из него флуоресцирующего карбоциклического соединения, содержащего сульфгидрильную группу (csP3), проводили на мультифункциональном плашечном ридере ClarioStar (BMG LABTECH GmbH, Германия). Использовали 96-луночные планшеты, стенки которых сделаны из черного пластика для предотвращения проникновения флуоресценции из соседних лунок (Corning, США). Измерения выполняли в растворе, состав которого соответствует внеклеточной среде, использованной для флуоресцентно-микроскопических измерений, но без глюкозы (см. ниже), либо в растворе, минимальный солевой состав которого соответствует внутриклеточной среде (мM): 130 KCl, 5 NaCl, 1 MgCl₂, 2 NaH₂PO₄, 1 Na₂HPO₄, 20 HEPES, pH 7.2. Состав солевых растворов, имитирующих внутриклеточную среду, выбран на основании работ [19, 20].

Приготовление первичных культур нейрональных клеток. Первичные культуры нейронов получали из коры головного мозга крыс линии Вистар (P1-P2), как описано ранее [21, 22]. Животных анестезировали, обезглавливали, кору удаляли и отделяли от мозговых оболочек. Извлеченные ткани промывали раствором Хенкса, не содержащим Ca²⁺ и Mg²⁺, измельчали, инкубировали в растворе папаина (12 мин, 37^оC) и диссоциировали в свежей МЕМ. Суспензию центрифугировали (200 g, 2×5 мин, 4^оC), осадок ресуспендировали до концентрации 10⁶ клеток/мл в нейробазальной среде (NBM), содержащей B-27 и пенициллин/стрептомицин. Аликвоты суспензии клеток (250 мкл) переносили в лунки со стеклянным дном (диаметр лунок 14 мM) 35-мM чашек Петри (MatTeck, США). Клетки культивировали в инкубаторе при 37^оC, в атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% CO₂, при 100% относительной влажности. Через 2–3 дня в среду добавляли цитозинарабинозид А (Ara-C, 5 мкМ) для снижения пролиферации глиальных клеток. Каждые 3–4 суток заменяли 1/3 среды на свежую. Культуры использовали в экспериментах через 9–11 дней после посева.

Флуоресцентно-микроскопические измерения. Для измерения внутриклеточной концентрации свободного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) клетки нагружали индикатором Xrhod-5F в форме ацетоксиметилового (АМ) эфира (Xrhod-5F/AM), предварительно смешав с неионным детергентом Pluronic F-127. Концентрации Xrhod-5F/AM и Pluronic F-127 в среде с клетками составляли соответственно 1 мкМ и 0.02%. Инкубацию с индикатором проводили в нейробазальной среде (37^оС, в атмосфере 5% CO₂). При выполнении флуоресцентно-микроскопических измерений нейробазальную среду замещали водно-солевым буфером, содержащим (мM) 130 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 20 HEPES, 5 глюкозы; pH 7.4.

Измерения флуоресценции в клеточных культурах выполнены на инвертированном микроскопе Nikon Ti2 (Nikon, Япония). В качестве источников возбуждающего света для P3 использовали pE-340Fura со светофильтром 387±6 нм и для Xrhod-5F – pE-300 со светофильтром 578±10 нм (CoolLED, Великобритания). Эмиссию регистрировали, используя встроенные в програмMно-управляемое фильтровое колесо светофильтры 483±16 и 520±18 нм для P3 и 641±37 нм для Xrhod-5F. Изображения получали с помощью охлаждаемой sCMOS камеры Prime BSI Express (Teledyne Photometrics, США). Регистрацию, хранение и первичную обработку данных проводили, используя програмMное обеспечение Nikon NIS-Elements (Япония).

Xrhod-5F/AM приобретен у ThermoFisher (США), Pluronic F-127 у Molecular Probes (США), зонд P3 (2-(3-(6-(2-hydroxyethylamino)naphthalen-2-yl)-3-oxoprop-1-enyl)-3,5-dimethoxybenzaldehyde) приобретен у Sigma-Aldrich. Базовые растворы Xrhod-5F/AM (1 мM) и Pluronic F-127 (20%) готовили в диметилсульфоксиде.

Статистическую обработку данных и построение графиков осуществляли, используя програмMы Microsoft Excel и Graph Pad Prizm-8.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Флуоресценция P3 и продукта его взаимодействия с Na₂S в буферных растворах. Структурные формулы P3 и его производного, включающего 5-членный цикл и боковую HS-группу (csP3), которое образуется в результате взаимодействия с сульфид-ионом или сероводородом, показаны на рисунке 1 [1].

 

Рис. 1. Структура слабо флуоресцирующего соединения P3 и сильно флуоресцирующего продукта его взаимодействия с сульфидом водорода и сульфид-ионом в водном растворе (заимствовано с изменениями из [1]).

 

Кинетика образования csP3 в результате взаимодействия P3 (10 мкМ) с сульфидом натрия (Na₂S, 100 мкМ) представлена на рис. 2. Благодаря гидролизу, Na₂S служит стандартным донором SH^–/H₂S [1, 23, 24], Реакцию проводили в солевом растворе, который мы обычно используем для флуоресцентно-микроскопических измерений клеточных культур (за исключением того, что не добавляли глюкозу; см. “Материалы и методы”). Кинетику образования csP3 отслеживали в течение 5 мин после начала реакции P3 с SH^–/H₂S (после добавления Na₂S). Измерения флуоресценции показали, что за время смешивания P3 с Na₂S, раскапывания растворов по лункам и запуска регистрации (в совокупности около 5 мин) успевало пройти около 70% реакции P3 с H₂S. Относительные изменения флуоресценции соответствуют данным работы [1] для таких же концентраций зонда и Na₂S.

 

Рис. 2. Изменения флуоресценции, вызванные добавкой сульфида натрия (Na₂S, 100 мкМ), служащего донором H₂S, к раствору P3 (10 мкМ). Состав минимального солевого раствора (мM): 130 NaCl, 5 KCl, 20 HEPES, 2 CaCl2, 1 MgCl₂, рН 7.4. Длины волн возбуждения (Ex) и регистрации флуоресценции (Em) соответственно 380 ± 8 и 510 ± 10 нм. Концентрации P3 и Na₂S соответственно 10 и 100 мкМ.

 

Химическая структура исходного соединения P3 и его карбоциклического сульфгидрильного производного csP3 указывают на значительную гидрофобность этих соединений (рис. 1) [1, 18]. Это позволяет предположить, что оба вещества, будучи добавленными к клеткам, могут перераспределяться между водным и менее полярным окружением, например, между мембранами и белками.

Перемещение молекулы в менее полярное окружение, как правило, вызывает сдвиг спектра эмиссии в более коротковолновую область и увеличение квантового выхода флуоресценции [25]. Мы убедились, что это универсальное правило действует для P3 и csP3, добавив диметилсульфоксид (DMSO, 30% по объему) (рис. 3). Это наблюдение соответствует данным [18] о значительной чувствительности флуоресценции производных ацедана к полярности/гидрофобности микроокружения.

 

Рис. 3. Спектры флуоресценции исходного P3, его карбоциклического сульфгидрильного производного (csP3), образовавшегося при добавлении Na₂S, и влияние полярности среды на флуоресценцию P3 и csP3. Спектры записаны через 20 мин после смешения P3 с Na₂S. Концентрации реагентов и состав раствора как на рис. 2. Спектры P3+DMSO и csP3+DMSO получены после добавления к соответствующим растворам DMSO (30% по объему). Длина волны возбуждения флуоресценции 380±8 нм.

 

Учитывая приведенные выше данные о чувствительности флуорофорной части молекулы csP3 к микроокружению, мы проверили, будет ли влиять смена солевого состава раствора на флуоресценцию зонда. Для этого сопоставили флуоресценцию csP3 в растворе, солевой состав которого напоминает таковой во внеклеточной среде организма млекопитающих (рис. 4а), с флуоресценцией csP3 в растворе, который по содержанию неорганических солей соответствует цитозолю (рис. 4в) (составы см. в “Материалах и методах”). Кроме того, проверили влияние NaHCO₃ на флуоресценцию csP3, поскольку внеклеточная и внутриклеточная среды организма содержат бикарбонат, который образуется в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях (рис. 4б и 4г). Мониторинг флуоресценции начинали через ~5 мин после смешения P3 (10 мкМ) с Na₂S (300 мкМ).

 

Рис. 4. Влияние солевого состава раствора на флуоресценцию H₂S-зонда csP3. Флуоресценция csP3 в растворе, приближенном по составу солей к внеклеточной среде (а) и к минимальному солевому составу цитозоля (в), и влияние бикарбоната натрия (NaHCO₃, 10 мM) на флуоресценцию csP3 во внеклеточном (б) и внутриклеточном (г) растворах. Составы растворов и рН указаны в “Материалах и методах”. Условия регистрации флуоресценции как на рис. 2.

 

Оказалось, что в растворе, приближенном по солевому составу к внутриклеточному, добавление Na₂S к P3 (рис. 4в) увеличивает флуоресценцию сильнее, чем в растворе, соответствующем внеклеточному раствору (рис. 4а). При этом со временем флуоресценция csP3 медленно снижалась. Добавление бикарбоната до концентрации, которая близка к физиологической снаружи и внутри клеток (10 мM NaHCO₃) [26], медленно увеличивало флуоресценцию в обоих растворах в отсутствие Na₂S (рис. 4б, 4г). Наличие бикарбоната практически не влияло на сигнал csP3 в присутствии Na₂S в обоих растворах (рис. 4б, 4г). Плавный рост флуоресценции в лунках, не имевших Na₂S, но содержавших NaHCO₃, обусловлен, возможно, абсорбцией газообразного H₂S, образовавшегося в соседних лунках, в которые добавляли Na₂S.

Флуоресцентная микроскопия клеток, окрашенных P3. Опираясь на молекулярные структуры P3 и csP3 (рис. 1), можно предположить способность этих веществ к перераспределению между водной и гидрофобной фазами и зависимость их флуоресценции от полярности микроокружения. Это предположение было подтверждено влиянием добавок диметилсульфоксида на спектры эмиссии флуоресценции P3 и csP3 (рис. 3, см. также [18]). Переход в более гидрофобное окружение вызывает одновременно с ростом интенсивности флуоресценции коротковолновый сдвиг полосы эмиссии [25], поэтому изображения (рис. 5а, 5б) и кинетику встраивания P3 в клетки и его превращения в csP3 (рис. 5в, 5г) регистрировали на двух длинах волн эмиссии 483±16 и 520±18 нм. Видно, что флуоресценция клеток первичной нейрональной культуры из мозга крысы, к которым добавили P3 (10 мкМ), распределена в основном в цитоплазме и значительно менее интенсивна в области ядра (рис. 5а, 5б). Такое распределение зонда указывает на то, что мембранные структуры цитоплазмы и, возможно, белки связывают больше зонда, чем водная фаза, и/или имеют гораздо более интенсивную флуоресценцию. Кинетика подъема флуоресценции была нелинейной в первые 10 мин после добавления P3, а затем практически линейно возрастала течение последующих 20 мин (рис. 5в, 5д). Отмывание раствора, содержащего P3, также имела ярко выраженный двухфазный характер. Для проверки полноты превращения P3 в csP3 дополнительно вносили Na₂S (100 мкМ), служащий донором H₂S. Ускорения прироста флуоресценции не обнаружено (рис. 5в, 5д). Отсутствие прироста флуоресценции при добавлении Na₂S может свидетельствовать о том, что (1) спустя 55 мин после добавки весь P3 уже превратился в csP3, либо (2) рост флуоресценции отражает не столько образование csP3, сколько его перераспределение между зонами клетки разной гидрофобности. Если кинетика роста флуоресценции отражает перераспределение P3 и csP3 между водным окружением и внутриклеточными структурами и компонентами (например, белками), имеющими меньшую полярность, чем вода, то отношение интенсивностей эмиссии флуоресценции при 483±16 и 520±18 нм должно непрерывно возрастать. Однако отношение интенсивностей эмиссии 483/520 оказалось постоянным на протяжении всего времени присутствия P3 в растворе, а также после удаления P3. Кроме того, отношение интенсивностей флуоресценции в цитоплазме и в ядре не зависело от длины волны регистрации излучения зонда (рис. 5г, 5е).

 

Рис. 5. Флуоресценция производного P3 в области ядра существенно ниже, чем в области цитозоля. а, б – Изображения нейронов при возбуждении при 387 нм и регистрации эмиссии при 483±16 (а) и 520±18 нм (б); получены через 23 мин после добавления P3. На изображениях выделены ROI, кинетика изменений интенсивности которых приведена на графиках в, д. Изменения в области ядра обозначены синим цветом, в области цитозоля – красным. На панелях г, е сопоставлены интенсивности (левые шкалы) и отношения интенсивностей (правые шкалы) в цитоплазме и ядре при регистрации сигналов при 483 и 520 нм (соответственно “Отношение 483 цитозоль/ядро” и “Отношение 520 цитозоль/ядро”) через 23 мин после добавления P3. Интенсивность флуоресценции на всех графиках представлена после вычета фона. Объектив 40×/NA=1.35 oil.

 

В литературе отмечены как нейропротекторные, так и нейротоксические свойства эндогенного и экзогенного H₂S [8–12]. Поэтому мы проверили на модели глутаматной эксайтотоксичности [27–34], будут ли происходить такие изменения сигналов P3, которые можно интерпретировать, как изменения концентрации эндогенного H₂S. Для этого к культивируемым нейронам из кортекса новорожденных крыс добавляли Glu (10 мкМ, 10 мкМ глицина, 0 магния), измеряя одновременно изменения [Ca²⁺]_i (флуоресценцию Xrhod-5F) и флуоресценцию P3/csP3. Glu ввели через 25 мин после добавления P3, когда увеличение флуоресцентного сигнала зонда приобрело линейный характер. 15-минутное действие Glu вызывало развитие отсроченной кальциевой дерегуляции (ОКД) [27] в 51% нейронов (286 из 560 клеток, три эксперимента). Изменения [Ca²⁺]_i в одном из трех экспериментов показаны на рисунке 6а и 6б. В нейронах, не имевших ОКД, первоначальный скачок [Ca²⁺]_i сменялся снижением [Ca²⁺]_i до более низкого стабильного уровня (рис. 6а). Удаление Glu заменой раствора на бескальциевый приводило к быстрому снижению [Ca²⁺]_i. Характерной особенностью изменений [Ca²⁺]_i в нейронах, в которых развилась ОКД, является наличие вторичного подъема [Ca²⁺]_i при продолжающемся действии Glu (рис. 6б). В таких нейронах удаление Glu приводит к снижению [Ca²⁺]_i, как правило, после значительной задержки [21, 22, 27, 28].

 

Рис. 6. Изменения [Ca²⁺]i и флуоресцентных сигналов H₂S-зонда P3 в соме клеток при действии глутамата (Glu). а, б – Изменения [Ca²⁺]i, в, г, д – изменения сигналов P3/csP3, е – изменения относительных наклонов графиков флуоресценции P3/csP3 (нормализованные углы наклона), вызванные добавлением глутамата, в нейронах имевших (+ОКД) и не имевших (–ОКД) отсроченную кальциевую дерегуляцию. На панелях а–г показаны результаты одного из трех аналогичных экспериментов. На панели е представлены данные всех трех экспериментов. Относительные наклоны (Sa/Sb) определяли как тангенсы углов наклона коротких линейных фрагментов сигналов P3 индивидуальных нейронов, полученные за 3 мин до (Sb) и в течение первых 3 мин после (Sa) добавления Glu. Измерения [Ca²⁺]i выполнены с помощью XRhod-5F (возбуждение 578±10, эмиссия 641±37 нм). Глутамат (Glu, 10 мкМ) добавляли в безмагниевом растворе, содержащем 10 мкМ глицина. Возраст культуры 9 дней.

 

Подъем флуоресценции P3/csP3 после добавления Glu происходил только в тех нейронах, в которых ОКД не развилась (рис. 6в, 6г). Это различие четко видно при совмещении усредненных графиков флуоресценции P3/csP3 (рис. 6д), а также при сопоставлении относительного прироста флуоресценции зонда в течение первых трех минут действия Glu (рис. 6е). Отметим, что начало роста флуоресценции H₂S-зонда происходило с 1.5–2-минутной задержкой относительно скачка [Ca²⁺]_i, вызванного глутаматом (см. рис. 6а и 6в).

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерес к роли H₂S в функционировании биологических систем от клетки до организма сильно возрос за последние 15 лет (число обзоров, реферируемых PubMed, увеличилось в 20 раз). В значительной мере этот интерес обусловлен возможным протекторным эффектом H₂S в условиях стресса [9], в том числе по отношению к клеткам центральной нервной системы [11–13]. Возможность измерять концентрацию этого газообразного трансмиттера или хотя бы относительные изменения его концентрации является необходимым условием исследования роли H₂S во внутриклеточном сигналинге. В этой связи критическое значение имеет наличие нетоксичных, чувствительных и ярких флуоресцентных сенсоров, дающих возможность исследовать индивидуальные клетки методом флуоресцентной микроскопии.

Недавно описан ряд соединений [1], одно из которых, P3, комMерчески доступно и удовлетворяет указанным выше критериям. Однако свойства P3 и продукта его взаимодействия с H₂S (и с анионом HS^–), csP3, во внутриклеточной среде пока недостаточно изучены. Необходимо учитывать, что на состав среды могут влиять внешние воздействия. В частности, ионный состав нейронов значительно изменяется при эксайтотоксическом действии глутамата [27, 28].

В данной работе исследовали пригодность P3 в качестве внутриклеточного H₂S-сенсора для измерения содержания этого газотрансмиттера в индивидуальных клетках нейрональной культуры методом флуоресцентной микроскопии. Проведенные эксперименты показали, что (1) в растворах, имитирующих по ионному составу внеклеточную или внутриклеточную среду, флуоресцентные характеристики P3 и продукта его взаимодействия с H₂S/HS^–, csP3 значительно различаются, и что (2) зонды P3 и csP3, по-видимому, диффундируют во внутриклеточные структуры, в которых флуорофорная часть зонда защищена от тушения полярным окружением (рис. 3, 4). Перераспределение P3 между водной и гидрофобной фазами может влиять на кинетику превращения P3 в csP3 и на флуоресцентные параметры обеих молекул.

В культивируемых нейронах H₂S способен модулировать активность ионотропных рецепторов NMDA-типа [8, 9, 11]. Эндогенным лигандом рецепторов этого типа служит глутамат, основной возбуждающий нейромедиатор ЦНС. Добавка Glu к нейрональным клеткам приводит к резкому изменению концентраций Na⁺, K⁺ и Ca²⁺ в цито- и нуклеоплазме, приближая концентрации этих ионов к концентрации внеклеточной среды [27, 29, 30]. Действие Glu вызывает сильное закисление [31–33]. Данные, представленные на рис. 3, демонстрируют, что изменения флуоресценции P3 и csP3 будут отражать не только изменения внутриклеточного содержания H₂S (и аниона HS^–), но также изменения ионного состава внутриклеточной среды и могут быть ошибочно интерпретированы как изменения содержания H₂S/HS^– при воздействии Glu на нейроны.

При добавлении Glu к первичной культуре нейронов происходит набухание сомы клеток [34]. Изменение формы сомы нейронов вызвано, вероятно, изменениями структуры клеточных мембран и, как следует из приведенных выше данных, потенциально способно повлиять на флуоресценцию P3 и/или csP3. Действительно, Glu вызывал увеличение флуоресценции P3 и/или csP3, однако только в тех нейронах, в которых ОКД не развилась (рис. 6в и 6г). Начало роста флуоресценции H₂S-зонда происходило с 1.5–2-минутной задержкой относительно индуцированного глутаматом скачка [Ca²⁺]_i (рис. 6в и 6г). Примерно такая же временная задержка 1.5–2 мин от момента добавления Glu до начала увеличения объема сомы нейронов наблюдалась при изучении процесса набухания нейронов методами атомно-силовой и флуоресцентной микроскопии [34].

Потоки ионов через NMDA-рецепторы быстро активируют Na⁺/K⁺- и Ca²⁺-ATP-азы, поддерживающие ионный гомеостаз и, соответственно, резко активируют окислительное фосфорилирование в митохондриях, снабжающих эти насосы ATP. В результате митохондрии значительно увеличивают продукцию CO₂ и НСО₃^–. Наличие бикарбоната значительно влияет на кинетику взаимодействия P3 с донором H₂S и HS^–, по крайней мере в тех случаях, когда донором служит Na₂S и солевой раствор по составу имитирует внутриклеточную среду в покоящихся нейронах (рис. 3). Можно ожидать, что внутри клеток флуоресценция P3 и csP3 также будет заметно зависеть от внутриклеточной концентрации HCO₃₋.

Окрашивание зондом P3 нейронов коры головного мозга крыс в первичной культуре показало, что P3 и/или его продукт csP3 сравнительно равномерно распределены в цитоплазме и в гораздо меньшей концентрации присутствуют в ядре (рис. 5). Это обстоятельство согласуется с тем, что P3 и csP3 преимущественно липофильные молекулы и должны предпочтительно распределяться в мембраны и гидрофобные зоны белков. Не исключено, что такое перераспределение P3 между водной и гидрофобной фазами влияет на кинетику превращения P3 в csP3 и на флуоресцентные параметры обеих молекул.

Суммируя результаты данного исследования, отметим, что синтез молекул, имеющих большую чувствительность флуоресцентных параметров к H₂S и быстрее с ним реагирующих, продолжается [15, 35]. Появляются альтернативные сенсоры H₂S, принцип действия которых основан на отделении под действием H₂S группы, тушащей флуоресценцию, от потенциального флуорофора [17], или химической модификации тушащей группы без присоединения H₂S [13, 36]. Следует, однако, учесть, что у всех этих сенсоров есть общее структурное свойство – наличие ароматической части, служащей флуорофором. Параметры флуоресценции таких зондов будут, как в случае P3 и csP3, отражать не только внутриклеточное содержание H₂S и HS^–, но и перераспределение зондов между компартментами клетки и структурами, различающимися полярностью. Это обстоятельство вынуждает с осторожностью интерпретировать рост флуоресценции описанных в литературе и рассмотренных в данной работе зондов как показатель образования внутриклеточной H₂S и/или аниона HS^–.

Авторы глубоко признательны И.А. Помыткину за предоставление зонда P3 и ценные советы при выполнении экспериментов и обсуждении результатов. Благодарим А.А. Некрасову за помощь при приготовлении культур клеток.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке Государственного задания № FGFU-2022-0012 и субсидии Минобрнауки России № 08-07-S6/2021/82930.

Соответствие принципам этики. Эксперименты с животными проводили в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth. Edition, 2010), а также в соответствии с “Good Laboratory Rules practice”, утвержденными приказом Минздрава России № 199н от 04.01.2016. Все протоколы были одобрены комитетом по этике ФГБНУ “НИИ общей патологии и патофизиологии”.

About the authors

R. R. Sharipov

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Email: surin_am@mail.ru
Russian Federation, Moscow,125315

I. A. Tarzhanov

National Medical Research Center of Children’s Health, Russian Ministry of Health; Institute of Pharmacy, The Sechenov First Moscow State Medical University, Russian Ministry of Health

Email: surin_am@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119296; Moscow, 119435

A. A. Zgodova

National Medical Research Center of Children’s Health, Russian Ministry of Health; Institute of Pharmacy, The Sechenov First Moscow State Medical University, Russian Ministry of Health

Email: surin_am@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119296; Moscow, 119435

Z. V. Bakaeva

National Medical Research Center of Children’s Health, Russian Ministry of Health; Gorodovikov Kalmyk State University

Email: surin_am@mail.ru
Russian Federation, Moscow, 119296; Elista, 358000

A. M. Surin

Institute of General Pathology and Pathophysiology

Author for correspondence.
Email: surin_am@mail.ru
Russian Federation, Moscow,125315

References

Supplementary files