Sensors of Intracellular Nucleic Acids Activating STING-Dependent Production of Interferons in Immunocompetent Cells

Full Text

Список сокращений: а.о. – аминокислотные остатки; а.п. – аминокислотная последовательность; дцДНК – двухцепочечная ДНК; мтДНК – митохондриальная ДНК; оцДНК – одноцепочечная ДНК; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; AIM2 (absent in melanoma 2) – белок 2, отсутствующий при меланоме; cGAMP – циклический гуанозинмонофосфат-аденозинмонофосфат; cGAS – циклическая гуанозинмонофосфат-аденозинмонофосфат синтаза; СС – двойные спирали; CDN – циклические динуклеотиды; CTT – С-концевой фрагмент; DAI (DNA-dependent activator of IFN regulatory factors) – ДНК-зависимый активатор интерферон-регулируемых факторов; DDX41 (DEAD-box helicase 41) – DEAD-бокс-хеликаза 41; DM – димеризующий мотив; DNA-PK (DNA-dependent serine/threonine protein kinase) – ДНК-зависимая серин/треониновая протеинкиназа; HELIC – хеликазный домен; HIV – вирус иммунодефицита человека; HSV1, HSV2 – вирус простого герпеса 1 и 2 типа; IFI16 (IFN γ-inducible protein 16) – индуцируемый гамма-интерфероном белок 16; IFN – интерферон; IL – интерлейкин; IRF3 (IFN regulatory factor 3) – регуляторный фактор интерферона 3; ISGs – интерферон-стимулируемые гены; LBD – лиганд-связывающий домен; MEFs – мышиные эмбриональные фибробласты; MRE-11 (meiotic recombination 11 homolog A) – гомолог A белка мейотической рекомбинации 11; NBD – нуклеотид-связывающий домен; non-CDN – малые молекулы, не относящиеся к циклическим динуклеотидам; OB – олигонуклеотид/олигосахарид связывающие складки; PAMPs – патоген-ассоциированные молекулярные паттерны; PM – фосфорилируемый мотив; Poly I:C – полиинозиновая-полицитидиловая кислота; PPII – полипролиновый домен; PRRs – рецепторы опознавания паттерна; PYD – пириновый домен; RAD50 (DNA repair protein RAD50) – белок репарации дцДНК; RNAi – РНК-интерференция; SIV – вирус иммунодефицита африканских обезьян; STING (stimulator of interferon genes) – стимулятор генов интерферона; TBK1 (TANK-binding kinase 1) – TANK-связывающая киназа 1; TBM – мотив для связывания протеинкиназы TBK1; TNF – фактор некроза опухолей; TREX1 (three prime repair exonuclease 1) – 3’-концевая репаративная экзонуклеаза 1; VSV – вирус везикулярного стоматита; ZBDs (Zα и Zβ) – Z-ДНК-связывающие домены; ZBP1 (Z-DNA-binding protein 1) – Z-ДНК связывающий белок 1.

ВВЕДЕНИЕ

В клетках нашего организма заложены механизмы защиты от присутствия в цитоплазме чужеродной патогенной ДНК или РНК, или собственной ДНК, активирующие системы врожденного иммунитета. Появление в цитоплазме одноцепочечной и двуцепочечной ДНК (оцДНК и дцДНК) и РНК может происходить по ряду причин: инфицирование ДНК вирусами; инфицирование РНК-содержащими ретровирусами, которые активируют собственное воспроизведение посредством ретротранскриптазы; выход бактерий из эндосом; активация сигнального пути регулируемой клеточной смерти, что приводит к разрушению митохондрий и выходу в цитоплазму митохондриальной ДНК (мтДНК); реактивация эндогенных ретровирусных последовательностей; генетические мутации, приводящие к активации нуклеаз; образование микроядер в результате митотических дефектов; повреждение ДНК при лучевой терапии; аккумуляция ДНК в результате фагоцитоза, микропиноцитоза или поглощение ДНК-обогащенных экзосом [1]. Удаление чужеродной ДНК/РНК из клеток требуется для эффективного функционирования клеток и поддержания их нормальной жизнедеятельности. Активация защитных механизмов в присутствии патогенов реализуется с участием рецепторов опознавания паттерна (pattern-recognition receptors, PRRs), к которым относятся мембранные и цитоплазматические белки. У млекопитающих определены несколько классов PRRs, которые направлены на узнавание внеклеточных патогенов (мембранные — Toll-подобные рецепторы (TLRs) и лектиновые рецепторы С-типа (CLRs)) и внутриклеточных патогенов (цитоплазматические — RIG-I-подобные рецепторы (RLRs), Nod-подобные рецепторы (NLRs), AIM2-подобные рецепторы (ALRs)).

При участии PRRs, выступающих в качестве сенсоров не изолированных в ядре нуклеиновых кислот, активируются внутриклеточные сигнальные механизмы для локализации и устранения опасных сигналов. PRRs в ходе эволюции были отобраны по специфичности к бактериальным липополисахаридам, гликопротеинам, содержащим остатки маннозы, пептидам, липотейхоевым кислотам, липопротеинам. Кроме этой специфичности PRRs распознают нуклеиновые кислоты вирусов, бактерий, грибов и нуклеиновые кислоты собственных поврежденных клеток. Нуклеиновые кислоты патогенов включают короткие консервативные молекулярные мотивы, узнаваемые PRRs и называемые патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs). Отличие патогенной ДНК от собственной ДНК происходит, как предполагается, на основании таких факторов как длина, 3D-структура и последовательность ДНК, внутриклеточная локализация ДНК, статус метилирования ДНК, ассоциация ДНК с гистонами или негистоновыми хроматин-связывающими белками (см. подробные механизмы отличия патогенной от собственной ДНК в обзоре [2]).

Одноцепочечные/двуцепочечные ДНК и РНК патогенов активируют в клетках млекопитающих сигнальные каскады сGAS–STING и RLR–MAVS, изучению которых посвящено много работ в последние десятилетия [3]. Ответом на активацию этих сигнальных путей является продукция клетками провоспалительных цитокинов, следствием чего является воспаление, а также антиген-специфичный адаптивный иммунный ответ. В нашем обзоре мы опишем функционирование цитоплазматических белков-сенсоров нуклеиновых кислот, таких как cGAS, STING, IFI16, AIM2, DAI, DDX41, DNA-PK, MRE-11, TREX1, ассоциированных с сигнальным каскадом cGAS–STING и продукцией провоспалительных цитокинов, в частности интерферонов (IFN) I типа (рис. 1).

 

Рис. 1. Цитоплазматические сенсоры нуклеиновых кислот, участвующие в активации STING сигнального пути и вызывающие продукцию интерферонов I типа.

cGAS — cyclic GMP-AMP synthase, DAI — DNA-dependent activator of IRFs, IFI16 — IFN γ-inducible protein 16, AIM2 — absent in melanoma 2, DDX41 — DEAD-box helicase 41, DNA-PK — DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit, TREX1 — three prime repair exonuclease 1, STING — stimulator of interferon genes, TBK1 — TANK-binding kinase 1, IRF3 — IFN regulatory factor 3, ЭПР — эндоплазматический ретикулум.

 

Существование разнообразных цитоплазматических белков-сенсоров, активирующих защитные механизмы с участием cGAS–STING сигнального пути, позволяет клеткам эффективно реагировать на проникновение различных патогенов (бактерий, вирусов), а использование агонистов этих сенсоров является в настоящее время одной из стратегий терапии злокачественных новообразований.

Сигнальный путь cGAS–STING включает несколько этапов межбелковых взаимодействий. Первоначально при появлении в клетке оц/дцДНК или РНК фермент циклическая гуанозинмонофосфат-аденозинмонофосфат синтаза (cGAS) взаимодействует с нуклеиновыми кислотами (независимо от типа последовательности), что приводит к каталитической реакции образования вторичного мессенджера — циклического динуклеотида гуанозинмонофосфат-аденозинмонофосфат (cGAMP) из ATP и GTP. Вторичный мессенджер cGAMP является высокоаффинным лигандом белка эндоплазматического ретикулума (ЭПР) STING (stimulator of interferon genes), способен при связывании со STING вызывать его конформационные перестройки, образование гомодимеров и самоактивацию. Активный STING при участии TRAP-транслокон комплекса, а также белков COPII (cytoplasmic coat protein complex-II) и TRAPβ (translocon-associated protein β) переходит из ЭПР в аппарат Гольджи [4]. При переходе из ЭПР в аппарат Гольджи происходит высвобождение С-концевого фрагмента STING, где расположен сайт фосфорилирования (Ser366). Фосфорилирование по этому сайту осуществляется протеинкиназой TBK1 (TANK-binding kinase 1) и приводит к устойчивой активации STING. Кроме фосфорилирования STING подвергается пальмитированию, что способствует образованию агрегатов STING с TBK1 и формированию STING–TBK1-сигналосомы [5]. Далее TBK1 в составе STING-сигналосомы фосфорилирует транскрипционный фактор IRF3 (IFN regulatory factor 3), что приводит к его димеризации и транслокации в ядро, где он связывается с промотерами интерфероновых генов I типа. Кроме индукции интерферонов I типа STING–TBK1-сигналосома также может быть вовлечена в экспрессию других провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (IL-6) и фактор некроза опухолей (TNF) за счет фосфорилирования IκBα, ингибитора транскрипционного фактора NF-κB, и дальнейшего его полиубиквитилирования и деградации. Деградация IκBα способствует активации и переходу в ядро NF-κB, регулирующего экспрессию разных цитокинов [6].

Известно, что активация сигнального пути cGAS–STING и продукция цитокинов может снижать темпы прогрессии опухолей [7], оказывая влияние на специфический противоопухолевый иммунитет, что делает его привлекательной мишенью для разработки STING-таргетированной терапии рака. Следует, однако, отметить, что гиперпродукция цитокинов (в частности интерферонов I типа) может быть причиной развития аутоиммунных заболеваний, а также длительного воспаления при разных заболеваниях, что следует учитывать при применении STING-направленных препаратов. Таким образом, поиск и изучение не только агонистов (активаторов), но и антагонистов (ингибиторов) STING может стать актуальным направлением современных исследований. Кроме того, недавно было показано, что STING также принимает участие в регуляции Cap-зависимой трансляции мРНК путем прямого связывания с протеинкиназой PERK в ЭПР при фиброзе легких и почек, что расширяет перечень заболеваний для лечения которых могут быть применены STING-таргетированные препараты [8].

cGAS

Белок cGAS впервые был обнаружен как сенсор ДНК в цитоплазме клеток L929 и THP-1 [9]. сGAS имеет молекулярную массу 60 кДа и представляет собой циклическую GMP–AMP-синтазу из семейства нуклеотидилтрансфераз, преимущественно локализуется в цитоплазме, а также может находится в ядре. cGAS состоит из неструктурированного N-конца (1–160 а. о.) и высококонсервативного C-конца (161–522 а. о.) (рис. 2). Предполагается, что остатки лизина и аргинина, входящие в сос-тав N-концевого фрагмента, участвуют в связывании ДНК. Кроме этого, N-конец служит для присоединения cGAS к плазматической мембране. C-конец cGAS содержит два сильно консервативных домена — нуклеотидилтрансферазный домен (160–330 а. о.), необходимый для ферментативной активности, и Mab21-домен (213–513 а. о.), включающий мотив «цинковая лента», который участвует в связывании ДНК и димеризации cGAS, и остаток лейцина, регулирующий синтез циклических динуклеотидов [12]. В отсутствие ДНК сGAS находится в автоингибированном состоянии. При нахождении нуклеиновых кислот в цитоплазме сGAS димеризуется и формируется комплекс cGAS–ДНК (2:2).

 

Рис. 2. Схема доменной организации cGAS человека (а) и модель комплекса cGAS–ДНК (2:2) (б), в составе которого каждый мономер cGAS взаимодействуют с ДНК (адаптировано из [10, 11], используется с разрешения издательства).  а — N-конец обозначен черным цветом, C-конец состоит из нуклеотидилтрансферазного домена (NTase core) (зеленый цвет) и Mab21-домена (красный цвет), включающего структуру «цинковая лента» (H(X5) CC(X6) C). Красными звездочками отмечены аминокислотные остатки (G212, S213, E225, D227 домена).

 

Внутри комплекса cGAS–ДНК происходят конформационные изменения, и осуществляется переход cGAS в активное состояние и каталитический синтез циклического гуанозинмонофосфата–аденозинмонофосфата 2’,3’-cGAMP из ATP и GTP. 2’,3’-cGAMP является смешанным фосфодиэфиром с уникальной связью между 2'-OH группой GMP и 5'-фосфатным остатком AMP и 3'-OH группой AMP с 5'-фосфатными остатком GMP (см. формулу на рис. 1). 2’,3’-cGAMP выступает в роли вторичного мессенджера и связывается с белком ЭПР STING, вызывая его активацию и последующую продукцию интерферонов I типа [13]. Взаимодействие между нуклеиновыми кислотами и ДНК-связывающими доменами сGAS происходит посредством формирования связи между положительно заряженными аминокислотными остатками (а. о.) и отрицательно заряженным сахарофосфатным остовом ДНК, что позволяет связывать дцДНК в независимости от ее последовательности. cGAS может активироваться и при взаимодействии с оцДНК, способной сформировать внутренние дуплексные структуры, а также при взаимодействии с оцДНК в Y-форме [14]. дцРНК может связываться с белком cGAS, но в отличие от дцДНК, это не приводит к его активации, что позволяет предположить, что для активации требуются специфические структурные перестройки в молекуле фермента, вызываемые дцДНК, а не дцРНК [15]. Предполагается, что В-форма ДНК связывается с активационной петлей cGAS и сдвигает ее, что приводит к перегруппировке активного сайта и активации cGAS, в то время как А-форма дцРНК не способна сдвинуть активационную петлю и не может активировать cGAS [16]. Для активации cGAS in vitro достаточно коротких дцДНК (примерно 15 п. о.), но для активации cGAS в клетках необходимы более длинные фрагменты ДНК (свыше 20 п. о.). Длинные фрагменты ДНК формируют с сGAS более стабильные структуры димеров с более высокой ферментативной активностью [17]. Для оцДНК связывающая способность составляет Kd ~ 1.5 мкМ, а для дцДНК Kd ~ 87.6 нМ [18]. сGAS узнает такие ДНК-содержащие вирусы: вирус коровьей оспы, вирус простого герпеса 1 и 2 типа (HSV1 и HSV2), цитомегаловирус, аденовирусы, вирус папилломы человека и мышиный гаммагерпесвирус 68, а также РНК-содержащие вирусы: вирус мышиного лейкоза, вирус иммунодефицита африканских обезьян (SIV), вирус иммунодефицита человека (HIV), вирус лихорадки Западного Нила, вирус везикулярного стоматита (VSV), вирус денге, а также грамположительные и грамотрицательные бактерии [19]. Интересно отметить, что при инфицировании дендритных клеток РНК-содержащим вирусом HIV-1 cGAS функционирует не самостоятельно, а в комплексе с белком PQBP1, что, по всей видимости, требуется для усиления узнаваемости обратно транскрибируемой ДНК ретровируса [20]. Известно, что активность cGAS регулируется за счет посттрансляционных модификаций, таких как, например, фосфорилирование по Ser305 (у человека) и по Ser291 (у мышей) протеинкиназой Akt [21], а также глутамилирование TTLL4 и TTLL6 [22], приводящих к ингибированию активности cGAS. Белок сGAS может присутствовать в ядре, однако автореактивность к собственной ДНК подавлена из-за взаимодействия с хроматином [23]. сGAS связан с гистонами 2A-2B, что предотвращает формирование димеров сGAS [24].

Sun и соавторы показали, что фермент cGAS, катализируя образование вторичного мессенджера 2’,3’-cGAMP, участвует в продукции интерферона через белок STING [9]. Инфицирование клеток с нокаутом cGAS ДНК вирусами не вызывало активацию IRF3 и продукцию интерферона β (IFN-β), а в клетках с оверэкспрессией сGAS ДНК-вирусы активировали IRF3 и индуцировали STING-зависимую продукция IFN-β.

В настоящее время предпринимаются попытки синтезировать агонисты cGAS — циклические нуклеотиды, олигонуклеотиды, которые бы имели высокую биостабильность, фармокинетику, безопасность и высокий потенциал в стимуляции иммунного ответа в опухолевом микроокружении и невысокую стоимость при комбинированной иммунотерапии [25].

STING

Белок STING считается одной из ключевых молекул, участвующих в реакции на патогены и активирующий провоспалительные цитокины при адаптивном иммунном ответе. Впервые STING был обнаружен в экспериментах с применением скрининговой системы экспрессии, в которой примерно 5500 человеческих и 9000 мышиных полноразмерных комплементарных кДНК, содержащих репортерный ген люциферазы под промотором IFN-β-Luc, были трансфецированы в клетки HEK293Т, для того чтобы определить участников альтернативного TRL-независимого сигнального пути врожденного иммунитета, сопровождающегося продукцией интерферонов [26]. В результате этой работы был идентифицирован белок STING (молекулярный вес 42 кДа, 379 а. о.), который преимущественно располагался в ЭПР. STING заякорен в ЭПР N-концевым фрагментом, включающим четыре трансмембранных домена (TM1–TM4). В структуре STING присутствует лиганд-связывающий домен (LBD), содержащий участок для взаимодействия (Connector) и димеризующий мотив (DM), и С-концевой фрагмент (CTT), включающий фосфорилируемый мотив (PM) и мотив для связывания протеинкиназы TBK1 (TBM) (рис. 3).

 

Рис. 3. Схема доменной организации белка человека STING (а) и модель комплекса лиганд–STING (б) (адаптировано из [27], используется с разрешения издательства).  а — N-концевой участок выделен голубым цветом, LBD (лиганд-связывающий домен) выделен зеленым цветом, CTT (С-концевой фрагмент) выделен оранжевым цветом; б — взаимодействие между лигандом 2’,3’-cGAMP и лиганд-связывающим доменом белка свиньи STING происходит в частично открытой конформации.

 

Лиганд-связывающий домен подвергается конформационным изменениям при связывании с эндогенным вторичным мессенджером 2’,3’-cGAMP. Связывание STING с 2’,3’-cGAMP в отличие от других изомеров, таких как, например, 3’,2’-cGAMP и 2’,2’-cGAMP, происходит в наиболее предпочтительной конформации, которая позволяет с наименьшей энтропией и высокой аффинностью реализовать их взаимодействие. Константа связывания со STING для 2’,3’-cGAMP ~ 4 нМ и в 300 раз ниже, чем для 3’,2’-cGAMP и 3’,3’-cGAMP, и в 75 раз ниже, чем для 2’2’-cGAMP [28]. Показано, что STING может напрямую связываться с ДНК без участия других белков, но аффинность такого связывания (Kd ~ 200–300 мкМ) ниже, чем у сGAS (Kd ~ 88 нМ) [29]. Мономеры STING формирует гомодимеры в клетках. При связывании лигандов с мономерами STING происходит образование тетрамеров и олигомеров высшего порядка [30]. После образования тетрамеров происходит перемещение STING из ЭПР в ЭПР–Гольджи промежуточный компартмент и аппарат Гольджи. В аппарате Гольджи происходит присоединение пальмитиновой кислоты к цистеиновым остаткам STING (Cys88 и Cys91), что оказывает влияние на активацию STING [31]. Для активации STING также необходимо фосфорилирование С-концевого домена протеинкиназой TBK1 [32]. Далее TBK1, предположительно находясь в составе STING–TBK1-сигналосомы, фосфорилирует транскрипционный фактор IRF3. В состоянии фосфорилирования IRF3 образует гомодимеры, которые транслоцируются в ядро и регулируют транскрипцию IFN-β [33].

Активность STING регулируется путем убиквитилирования. Присоединение убиквитина по разным сайтам STING (Lys63 — E3-лигазы TRIM56 и TRIM32; Lys27 — Gp78/AMFR и INSIG1) либо вызывает продукцию интерферона [34, 35], либо ингибирует продукцию интерферона и вызывает деградацию STING (Lys48 — RNF5 и TRIM30a) [36, 37].

Участие STING в активации продукции интерферонов было исследовано на нокаутных по STING^–/– мышах [38]. В клетках MEFs (мышиные эмбриональные фибробласты), выделенных из STING^–/– мышей, при заражении вирусом везикулярного стоматита наблюдалось образование большего вирусного потомства по сравнению с клетками дикого типа. В STING^–/– MEFs индуцированная оверэкспрессия STING после трансфекции плазмиды pcDNA mSTING приводила к увеличению уровня мРНК Ifnb и белка IFN-β. В макрофагах STING^–/–, полученных из костного мозга, действие полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly I: C), но не инфицирование грамотрицательными бактериями F.tularensis, вызывало повышение экспрессии мРНК Ifnb. У нокаутных STING^–/– мышей некоторые виды бактерий (L. monocytogenes), вирусов (HSV1) и ДНК, не содержащих CpG, не вызывали продукцию интерферонов, а приводили к продукции интерлейкинов (IL-1β). Это указывает на специфичность врожденного ответа на разные типы патогенов у разных типов клеток, в которых активируются либо STING-зависимые, либо TLR-зависимые сигнальные пути [39]. Участие TBK1 в STING-зависимом сигнальном пути также было показано на TBK1^–/– мышах. В клетках MEFs, полученных от TBK1^–/– мышей, сигнальный путь с участием STING не активировался [38]. Роль STING, как вышестоящего звена в сигнальном пути STING–TBK1–IRF3, была показана в экспериментах с оверэкспрессией STING в клетках HEK293T. Повышение экспрессии STING приводило к димеризации IRF3 и стимулировало продукцию интерферонов и других генов первичного иммунного ответа (Ifnb1, Ifna4, Ifna6, Isgf3g, Irf2, Irf6) [40].

В опухолевом микроокружении эндотелиальные клетки, наряду с дендритными клетками и фибробластами, являются основным источником STING-зависимой продукции IFN-β [41]. IFN-β является эффективным антиангиогенным цитокином, который может подавлять пролиферацию или выживаемость эндотелиальных клеток, а также формирование капиллярной сети в опухолевом микроокружении, и вовлекается в противоопухолевый иммунитет. Показано влияние интерферонов (IFN-α и IFN-β) в противоопухолевом иммунитете и на другие типы иммунных клеток. Так, например, при связывании с клетками, несущими рецепторы к интерферону, интерферон снижает уровень кислотности в эндосомально-лизосомальном компартменте дендритных клеток, усиливает презентацию антигенов дендритными клетками, повышает продукцию хемокинов (CXCL9 и CXCL10) антигенпрезентирующими клетками, усиливает миграцию CD8⁺ T-клеток и натуральных киллеров [42].

Активация STING-зависимого сигнального пути, приводящего к продукции интерферонов, в опухолевом микроокружении потенциально может способствовать эффективной противоопухолевой терапии при использовании агонистов STING циклических динуклеотидов (CDN, cyclic dinucleotide) или других малых молекул, не относящихся к циклическим динуклеотидам (non-CDN). Одним из первых агонистов STING, примененных в клинических испытаниях для иммунотерапии рака, был циклический динуклеотид ADU-S100 (MIW815). Этот агонист эффективно активировал STING in vitro и in vivo у мышей и при локальном введении инициировал CD8⁺ Т-клеточный ответ, что приводило к острой продукции цитокинов и локальному сосудистому коллапсу, и регрессии опухолей [43, 44]. Клинические испытания I фазы показали, что при монотерапии данный агонист хорошо переносится пациентами с солидными опухолями и лимфомами, и у пациентов наблюдается системная иммунная активация (повышение уровня воспалительных цитокинов, клональная экспансия Т-клеток периферической крови) [45]. Предполагается, что комбинация ADU-S100 с ингибиторами контрольных точек может привести к повышению эффективности иммунотерапии, но для подтверждения этой гипотезы требуются дальнейшие клинические испытания. Другим перспективным агонистом STING, дошедшим до клинических испытаний, был DMXAA (ASA404 или Vadimezan), аналог ксантенона. DMXAA действует двунаправленно и способен вызывать апоптоз эндотелиальных опухолевых клеток, что приводит к разрушению сосудов в опухоли и прекращению снабжения кровью опухолевых узлов, и активации продукции провоспалительных цитокинов посредством STING. Успешные I и II фазы клинических испытания привели к III фазе, которая показала отрицательный результат из-за того что изоформы STING у мышей и у человека имеют структурные различия в сайте связывания с DMXAA. Эти различия не позволяют STING связываться с DMXAA в клетках человека. Дальнейшие перспективы использования данного соединения или его модификаций при терапии рака связывают с его применением в комбинированной терапии с препаратами анти-ангиогенеза, радиотерапией и другими подходами [46]. В настоящее время к перспективным агонистам STING относится соединение diABZI (non-CDN), показавшее хороший эффект при терапии опухоли толстой кишки. Так, у мышей с сингенной опухолью толстой кишки при внутривенном введении наблюдается полная и длительная регрессия опухоли [47]. Интересно отметить, что в литературе описан еще один эффективный non-CDN агонист STING, MSA-2, показавший эффективность не только при внутриопухолевом и подкожном введении мышам, но и при пероральном введении. MSA-2 имеет высокую клеточную проницаемость и аффинность к STING. В кислой среде в опухолевых клетках MSA-2 формирует нековалентно связанные димеры, которые взаимодействуют со STING. Комбинированная терапия MSA-2 с анти-PD1 показала большую эффективность [48].

Таким образом, исследование механизмов действия агонистов STING–TBK1–IRF3 сигнального пути с целью выявления наиболее перспективных соединений для терапии разных типов рака является крайне актуальной задачей и, как описано выше, в наши дни некоторые соединения уже дошли до клинических испытаний, но поиск новых эффективных агонистов для терапии рака продолжается.

IFI16 и AIM2

Белки IFI16 и AIM2, относящиеся к семейству PYHIN (также известные как р200 или HIN200), другие важные сенсоры нуклеиновых кислот, которые встают на защиту клеток при вторжении вирусов, бактерий и других патогенов, или собственной аберрантной цитоплазматической ДНК. У большинства белков этого семейства в структуре N-концевого фрагмента находится пириновый домен (PYD), обеспечивающий белок-белковые взаимодействия, а С-концевой фрагмент включает один или два HIN200-домена, участвующие в связывании ДНК.

Белок IFI16 был одним из первых обнаруженных цитоплазматических сенсоров ДНК (IFN γ-inducible protein 16), который реагирует на присутствие в цитоплазме оцДНК и дцДНК [49]. IFI16 локализуется преимущественно в ядре и в небольшом количестве в цитоплазме [50]. Структура доменной организации IFI16 представлена на рис. 4. В состав IFI16 входит N-концевой PYD-домен и два тандемных домена: HINa и HINb, содержащие олигонуклеотид/олигосахарид связывающие складки (OB).

 

Рис. 4. Схема доменной организации белка IFI16 мыши (а) и модель комплекса дцДНК с HINa- и HINb-доменами, связанными между собой линкером (красный цвет) (б) (адаптировано из [51], используется с разрешения издательства).

 

Показано, что связывание дцДНК с HIN-доменами происходит по механизму кооперативного связывания и зависит от длины ДНК [52, 53]. Связывание с оцДНК или с дцДНК происходит в основном за счет электростатического взаимодействия. IFI16 способен узнавать разную топологию ДНК [54]. Оба домена HINa и HINb связывают ДНК, но аффинность связывания различается [55]. HINa связывает ДНК быстрее, чем HINb. HINb связывает GC-богатые ДНК сильнее, чем HINa. Домен HINb взаимодействует с двумя цепочками ДНК, в то время как HINa взаимодействует с одной цепочкой ДНК. Предполагается два способа связывания ДНК с HIN-доменами. Первый способ — линкер, соединяющий две олигонуклеотид/олигосахарид связывающие складки внутри домена, используется в качестве троса для связывания с ДНК, второй способ — петли внутри двух олигонуклеотид/олигосахарид связывающих складок HIN-домена используются для связывания ДНК [56, 57]. Предполагается, что разные способы взаимодействия с ДНК, а также связь ДНК с разными доменами (взаимодействие с HINa ослабляет экспрессию IFN-β, а взаимодействие с HINb усиливает IFN-β [58]), могут приводить к двум разным иммунным ответам, а также в зависимости от типа вирусов, проникающих в клетку, IFI16 активирует различные способы борьбы с вирусами. При попадании генетического материала вирусов в ядро IFI16 перемещается к периферии ядра, ближе к ядерным порам, где связывает проникшую в ядро вирусную ДНК через HIN-домены и олигомеризуется через PYD-домен [59]. Известны следующие реакции в клетках в ответ на проникновение разных вирусов с участием IFI16: активация STING-зависимого интерферонового ответа (при инфекции HSV-1); формирование провоспалительного олигомерного комплекса белков — инфламмасомы (при KSHV-инфекции); активация каспазы-1, инициирующей пироптоз (при HI-инфекции) [50, 60]. В макрофагах при подавлении экспрессии IFI16 при стимуляции синтетической ДНК нарушалась продукция cGAMP, а при оверэкспрессии IFI16 усиливалась продукция cGAMP, что дало основание предполагать, что IFI16 функционирует как кофактор cGAS, оказывая влияние на продукцию cGAMP и дальнейший STING-зависимый сигнальный каскад [61].

AIM2 (absent in melanoma 2) — другой белок из этого семейства, преимущественно экспрессируется в эпителиальных клетках кишечника, кератиноцитах и моноцитарных линиях, способен распознавать ДНК из разных источников (собственную ДНК, бактериальную и вирусную ДНК). Показано, что AIM2 узнает вирус коровьей оспы и мышиный цитомегаловирус [62]. Структурно AIM2 включает два домена: N-концевой пириновый домен (PYD) и C-концевой HIN200-домен, соединенных длинным линкером (рис. 5). HIN200-домен, заряжен положительно и связывает отрицательно заряженную ДНК [64].

 

Рис. 5. Схема доменной организации AIM2 (а) и модель структуры PYD-домена (лимонный цвет) и комплекса дцДНК–AIM2 (б) (адаптировано из [63], используется с разрешения издательства). OB1, OB2 — олигонуклеотид/олигосахарид связывающие складки в составе HIN200-домена.

 

Предполагается, что PYD-домен в состоянии покоя блокирует HIN-домен посредством межмолекулярных взаимодействий, что предотвращает олигомеризацию PYD-доменов. В случае связывания дцДНК PYD-домен вытесняется из взаимодействия с HIN-доменом и может взаимодействовать с адаптерным белком инфламмасомы ASC, также имеющим в своем составе PYD-домен [56]. Sohn и соавторы предложили другую модель взаимодействия ДНК с AIM2. Они предполагают, что PYD-домен не вовлечен в автоингибирование AIM2, а, наоборот, участвует в связывании с ДНК и последующей олигомеризации PYD-доменов для формирования AIM2-инфламмасомы [65]. Исследование структуры HIN-домена AIM2 со связанной ДНК показало, что ДНК взаимодействует с AIM2 через сахарофосфатный остов, то есть независимо от последовательности ДНК [56]. Сахарофосфатные остатки обеих цепочек ДНК (В-форма) взаимодействуют с аргинином и лизином HIN-домена через электростатическую связь. Например, для стимуляции продукции цитокинов (IL-1β) при связывании ДНК с AIM2 требуется минимальная длина ДНК ~ 80 п. о. Результаты криоэлектронных исследований показали, что одну молекулу ДНК связывает множество молекул AIM2, которые способны взаимодействовать друг с другом через PYD-домены и формировать длинные спиральные нити с полой правосторонне закрученной структурой. Внутренний диаметр такой нити составляет ~ 20 Å, а наружный диаметр ~ 90 Å [66]. Нити, сформированные белком AIM2, являются инициирующим фактором для дальнейшей сборки инфламмасомы — супрамолекулярного мультибелкового комплекса, включающего адаптерный белок ASC, способный взаимодействовать с CARD-доменом прокаспазы-1. После сборки инфламмасомы происходит автокаталитическое расщепление прокаспазы-1 до каспазы-1, которая конвертирует про-IL-18 и про-IL-1β в их активные формы, что приводит к воспалительному ответу и пироптозу [67].

Участие AIM2 в сигнальном каскаде STING пока остается плохо изученным. В ряде работ продукция интерферонов наблюдалась в AIM2-дефицитных моделях. В спленоцитах AIM2-дефицитных мышей наблюдается повышенная экспрессия IFN-β и других IFN-индуцируемых генов [68]. В антигенпрезентирующих клетках (мышиные макрофаги и дендритные клетки) при стимуляции ДНК in vitro наблюдалась активация AIM2-инфламмасомы, каспазы-1 и снижение продукции IFN-β [69]. Предполагается, что эффективным дополнением стратегии повышения Т-клеточного ответа при терапии рака за счет активации сигнального каскада STING, приводящего к продукции IFN-β в опухолевом микроокружении, может стать ингибирование индукции AIM2-инфламмасомы. Действительно было показано, что, например, продукция цитокина IL-1R ингибирует продукцию IFN-β, а ингибирование AIM2-зависимой продукции интерлейкинов может повысить продукцию интерферонов [70].

DAI (ZBP1)

Поиск цитоплазматических сенсоров ДНК, которые способны активировать сигнальный путь TBK1–IRF3, привел к идентификации DAI (DNA-dependent activator of IRFs), известного также как ZBP1 [71]. ZBP1 локализуется в цитоплазме и ассоциирован со стрессовыми гранулами и тельцами, участвующими в обороте мРНК [72]. Структура ZBP1 включает три ДНК-связывающих домена, расположенных на N-конце, и домены, участвующие в связывании TBK1 и IRF3, расположенные на С-конце [73]. N-конец состоит из 2 тандемных Z-ДНК-связывающих доменов (Zα и Zβ, ZBDs) и третьего ДНК-связывающего региона (D3), способного связывать правозакрученную B-форму ДНК [71] (рис. 6).

 

Рис. 6. Схема доменной организации ZBP1 (а) и модель структуры комплекса Z-ДНК c двумя молекулами ZBP1 (б) (адаптировано из [71, 74], используется с разрешения издательства). а — Розовым показаны Zα- и Zβ-домены, связывающие Z-форму ДНК; желтым показан D3-регион, участвующий в связывании правозакрученной В-формы ДНК. б — дцДНК (коричневый цвет), молекулы ZBP1 (фиолетовый цвет).

 

Структура ZBDs состоит из трех α-спиралей и трех β-складок, в составе которых находятся консервативные аминокислотные остатки, вовлеченные в связывание с Z-конформацией ДНК. Показано, что в узнавании доменами ZBDs зигзаг формы ДНК принимает участие α3-спираль и β-складки (β2 и β3) [74–76]. Важную роль играют положительно заряженные или полярные аминокислотные остатки, а также прямые ионные взаимодействия, водородные связи, образуемые фосфатными остатками остова ДНК и гидрофобные взаимодействия (Trp, Thr, Pro) [77]. Исследования показали, что оба домена Zα и Zβ одновременно связываются с Z-формой ДНК. При исследовании Zβ-домена белка человека была показана уникальная кристаллическая структура домена, формируемая для узнавания Z-формы ДНК, а также способность этого домена осуществлять конвертацию В-формы в Z-форму [74]. Предполагается, что с одной молекулой дцДНК могут связаться 2 молекулы DAI, что приводит к димеризации DAI и усилению иммунного ответа. Для активации сильного иммунного ответа в ответ на ДНК необходимо наличие всех трех доменов в составе DAI [78].

Takaoka и соавторы продемонстрировали индукцию генов интерферонов I типа в ответ на дцДНК в мышиных фибробластах L929 с повышенным уровнем экспрессии DAI, а в клетках со сниженной экспрессией DAI ингибирование их индукции [71]. После связывания дцДНК с DAI, DAI копреципитирует одновременно с протеинкиназой TBK1 и с транскрипционным фактором IRF3, что указывает на его прямую или непрямую ассоциацию с этими белками. Предполагается, что формирование данного комплекса ZBP1(DAI)–TBK1–IRF3 активирует IRF3 и вызывает транслокацию IRF3 в ядро.

Дальнейшие исследования на DAI-дефицитных мышах и эмбриональных фибробластах показали нормальный уровень продукции интерферонов в ответ на вирусную ДНК [79]. Снижение экспрессии ZBP1 не оказывало влияние на активацию IRF3–TBK1 сигнального пути и продукцию IFN-β в клетках A549 и HepG2 [80, 81]. В разных типах клеток экспрессия ZBP1 варьирует, а регуляция ZBP1 сигнальных каскадов представляется довольно сложной, поскольку наряду с активацией IRF3 в клетках активируется NF-kB за счет присутствия в составе ZBP1 RHIMs-мотивов, вовлеченных в активацию протеинкиназ RIPK1 и RIPK3 [82]. Так, например, в кардиомиоцитах при действии доксорубицина происходит выход мтДНК в цитоплазму, что вызывает повышение экспрессии Zbp1, интерферонов I типа и других интерферон-стимулируемых генов (interferon-stimulating genes, ISGs). При снижении экспрессии Ifnar^–/–, Sting^–/–, и Zbp1^–/– в кардиомиоцитах эффект доксорубицина на экспрессию ISGs отсутствует. Выход мтДНК в цитоплазму кардиомиоцитов приводит к формированию комплекса ZBP1–cGAS–RIPK1–RIPK3, фосфорилированию STAT1 и интерфероновому ответу. Формирование комплекса ZBP1–cGAS происходит за счет связывания N-концевого RHIM-домена ZBP1 с ДНК-связывающим доменом cGAS. Предполагается, что этот комплекс задействован в поддержании интерферонового ответа клетками при митохондриальной дисфункции [83]. Это дает основание полагать, что сигнальная ось ZBP1–cGAS–STING вовлечена в интерфероновый ответ в клетках сердца, а влияние на этот путь может снизить доксорубицин-индуцированную кардиотоксичность. Происходит ли формирование подобного комплекса между ZBP1 и cGAS в иммунокомпетентных клетках еще предстоит выяснить. Таким образом, ZBP1 (DAI) может быть крайне необходимым сенсором ДНК для активации интерферонового ответа, но активироваться в клетках в зависимости от их типа.

DDX41

DDX41 (DEAD-box helicase 4) РНК-хеликаза — цитоплазматический сенсор нуклеиновых кислот, который участвует в узнавании вирусов, например, вируса HSV-1 и аденовируса, в разных типах клеток: в миелоидных дендритных клетках и мышиных дендритных клетках из костного мозга и других. DDX41 относится к семейству DExD/H-box РНК-хеликаз, вовлеченных в продукцию интерферонов I типа [84]. В структуре белка DDX41 присутствуют хеликазный домен (HELIC) и домен DEAD/H-box, имеющие разные функциональные мотивы (рис. 7).

 

Рис. 7. Схема доменной организации DDX41 (а), модель структуры закрытой конформации DEAD-домена (б) и докинг модель комплекса DEAD-домена, связанного с дцДНК (в) (адаптировано из [85, 86], используется с разрешения издательства).

 

Домен HELIC содержит консервативные I- и Q-мотивы, которые участвуют в связывании и гидролизе ATP, а DEAD-домен содержит такие мотивы, как Q-мотив, P-петлю, Ia-мотив, Ib-мотив, мотив II, мотив III. Считается, что P-петля в составе DEAD-домена связывает дцДНК и циклические динуклеотиды, а также согласно модели молекулярного моделирования (докинг модель) предполагается, что в формирование сайта связывания ДНК вовлечены аминокислотные остатки: Arg267, Lys304, Tyr364, Lys381, расположенные на C-конце. Домен HELIC, вероятнее всего, способен ингибировать связывание между DEAD/H-box-доменом и его лигандами [87]. Предполагается прямое взаимодействие DDX41 со STING, которое приводит к повышению продукции интерферона I типа. Zhang и соавторы выявили, что из большего числа членов семейства DExD/H-box-хеликаз только при нокауте DDX41 в миелоидных дендритных клетках и моноцитах человека значительно снижается продукция IFN-β в ответ на трансфекцию poly(dA-dT). Интересно, что при заражении клеток РНК-вирусами, такой эффект не был обнаружен. DDX41 является сенсором бактериальных вторичных мессенджеров cGMP и cAMP, появление которых в цитоплазме приводит к активации интерферон-зависимого иммунного ответа [88]. В моноцитах и макрофагоподобных клетках с нокаутом DDX41 нарушалась активация cGAS и STING [89]. На основании этих данных было сделано заключение о том, что DDX41 является STING-зависимым сенсором ДНК. Однако в зависимости от типа клеток и типа вируса, вовлечение DDX41 в те или иные сигнальные пути может отличаться. Так, например, было показано, что подавление экспрессии DDX41 с помощью РНК-интерференции (RNAi) в клетках hTERT не сильно влияло на продукцию IFN-β при заражении клеток вирусной ДНК (HSV1 или бакуловирус) [90].

DNA-PK и MRE-11

Белок ДНК-зависимая протеинкиназа DNA-PK (DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit) вовлечен в репарацию разрывов и повреждений ДНК. При нахождении в ядре DNA-PK участвует в репарации разрывов дцДНК [91], а при нахождении в цитоплазме участвует в иммунном ответе при проникновении патогенов [92]. DNA-PK относится к семейству Ser/Thr PIKK-протеинкиназ, способных к автофосфорилированию и фосфорилированию других эффекторов репарации [93]. DNA-PK представляет собой гетеротримерный белковый комплекс (460 кДа), который включает три субъединицы: Ku70 (70 кДа), Ku80 (86 кДа) и каталитическую субъединицу DNA-PKcs.

Субъединица DNA-PKcs состоит из нескольких доменов: N-концевого участка, включающего руку (красный цвет), мост (темно-фиолетовый цвет) и круговую секцию (сине-фиолетовый цвет); головки, включающей FAT (FRAP–ATM–TRRAP) (зеленый цвет), FRB (FKBP12-rapamycin-binding) (оранжевый цвет), киназный (желтый цвет) и FATC (FAT C-terminal) (темно-зеленый цвет) домены (рис. 8а). Сайты связывания с Ku-субъединицами располагаются в разных доменах на участках 102–210, 2178–2248 и 2374–2394 аминокислотной последовательности (а. п.). Участки 892–1289 и 1503–1538 а. п., расположенные в круговой секции, связывают ДНК [97]. Субъединицы Ku70 и Ku80 имеют схожую доменную структуру: N-концевой α/β-домен; центральный домен, состоящий из β-бочонков; и специфический C-концевой домен «рука», состоящий из спиралей (рис. 8б). N-концевой α/β-домен относится к семейству vWA (Willebrand factor A) доменов, включающих 6-цепочечные β-листы в складке Россмана, и участвует в ДНК репарации, но не принимает участие в прямом связывании ДНК, а также участвует в белок-белковых взаимодействиях. Центральный домен состоит из 7-цепочечных антипараллельных β-бочонков и участвует в связывании ДНК и гетеродимеризации. Связывание с ДНК не зависит от последовательности и имеет более высокую аффинность к дцДНК по сравнению к оцДНК. С-концевой домен участвует в узнавании ДНК и взаимодействии с DNA-PKcs и структурно различается у субъединиц Ku70 и Ku80. На С-конце субъединицы Ku70 присутствует ДНК-связывающий домен SAP (SAF-A/B, Acinus, and PIAS) (5 кДа). Предположительно этот домен стабилизирует взаимодействие Ku70 с ДНК [96] (рис. 8в). С-концевой домен субъединицы Ku80 (CTD) (19 кДа) вовлечен во взаимодействие с DNA-PKcs. Субъединицы Ku70 и Ku80 формируют гетеродимер, который совместно с третьей субъединицей DNA-PKcs образуют тройной комплекс, связывающий ДНК (рис. 8г, DNA-PKcs на рисунке не представлена). Аффинность связывания с ДНК падает в отсутствие гетеродимера Ku70/Ku80 [98].

 

Рис. 8. Схема доменной организации DNA-PKcs (а) и субъединиц Ku70, Ku80 человека (б), модель вторичной структуры димерного комплекса субъединиц Ku80 (фиолетовый цвет) и Ku70 (красный цвет) (в) и комплекса ДНК (желто-оранжевый цвет) с гетеродимером Ku70–Ku80 (г) (адаптировано из [94–96], используется с разрешения издательства). Аминокислота, после которой начинается специфичная для субъединицы Ku70 аминокислотная последовательность, отмечена голубой заполненной точкой.

 

Участие субъединиц Ku70, Ku80 и DNA-PKcs в активации сигнального пути cGAS–STING и продукции интерферонов малоизучены. Ferguson и соавторы показали, что в цитоплазме фибробластов, являющихся первичной мишенью вирусов, наблюдается высокая базовая экспрессия белка DNA-PK, и при проникновении чужой ДНК он выступает как PRRs, связывая ДНК, запускает транскрипцию генов интерферонов I типа, цитокинов и хемокинов с участием IRF3, TBK1 и STING [92]. Известно, что субъединица Ku70 вовлечена в процесс репарации ДНК и играет роль в связывании ДНК длиной свыше 500 п. о. и активации продукции интерферонов III типа посредством IRF1 и IRF7 [99]. При исследовании, выполненном на клетках с дефицитом STING, было показано, что DNA-PK реагирует на ДНК и активирует независимый от STING сигнальный путь SIDSP. У мышей с недостаточной экспрессией DNA-PKcs наблюдаются нарушения в продукции цитокинов в условиях стимуляции вирусной ДНK, но не вирусной РНК [100]. Таким образом, какие механизмы активации cGAS–STING сигнального пути приводят к продукции провоспалительных цитокинов с участием DNA-PK, еще предстоит выяснить.

Белок MRE-11 участвует в репарации разрывов дцДНК, гомологичной рекомбинации и поддержании длины теломеров. Данный белок обладает 3’–5’ экзонуклеазной и эндонуклеазной активностью и взаимодействует с белком репарации ДНК RAD50 [101]. MRE-11 состоит из нуклеазного домена, включающего четыре высококонсервативных фосфодиэстеразных мотива, и двух ДНК-связывающих доменов: ДНК-связывающий сайт А (407–421 а. о.) с кластером положительно заряженных а. о. и ДНК-связывающий сайт В (644–692 а. о.) с кластером отрицательно-заряженных а.о (рис. 9а).

На рис. 9б представлена модель комплекса димеров RAD50 (оранжевый/желтый цвета) и MRE-11 (голубой/синий цвета) в покоящемся состоянии. В мономерах RAD50 показаны нуклеотид-связывающие домены (NBD) и двойные спирали (СС). В мономере MRE-11 обозначены несколько доменов: нуклеазный домен с автоингибированными активными сайтами, кэппинг-домен, линкер и C-концевой HLH (helix-loop-helix, спираль-петля-спираль) домен, связывающий RAD50. Криоэлектронная структура показывала, что в состоянии покоя ATP–RAD50 блокирует нуклеазный домен MRE-11. В условиях связывания ДНК нуклеазный домен освобождается и образуется канал, где проходит нуклеазная реакция на концах ДНК [103] (рис. 9в).

 

Рис. 9. Схема доменной организации MRE-11 (а) и модель комплекса E. coli MRE11–RAD50 в состоянии покоя (б) и в связанном с ДНК состоянии (в) (адаптировано из [102, 103], используется с разрешения издательства). Связывание ДНК вызывает сдвиг в нуклеотид-связывающих доменах (NBD) и перестройки в MRE-11, что приводит к формированию канала в области активных центров и зажиму концов ДНК. HLH — спираль-петля-спираль, CC — двойная спираль.

 

Известно, что белок MRE-11, являясь сенсором ДНК, способен активировать STING [104]. Показано, что при мутациях в нуклеазном домене MRE-11 стимуляция клеток ДНК вызывает более сильный иммунный ответ. Это дает основание полагать, что MRE-11 может функционировать не только как сенсор ДНК, но и как регулятор, запускающий или подавляющий иммунный ответ. В свою очередь, RAD в составе комплекса RAD50–MRE-11 также может связывать CARD9, что приводит к вовлечению в сигнальный каскад Bcl-10 и активации NF-kB, а также к продукции IL-1β в ответ на связывание с ДНК [105]. Для установления детального механизма участия комплекса RAD50–MRE-11 в STING-зависимом сигнальном пути, вызывающем продукцию цитокинов, необходимы дальнейшие исследования.

TREX1

Многие сенсоры нуклеиновых кислот расположены в цитоплазме, где появление ДНК является неблагоприятным сигналом. Так, появление в цитоплазме собственной ДНК в результате дефектов различных механизмов удаления ДНК из цитоплазмы, может вызывать активацию провоспалительных сигнальных каскадов. В устранении нуклеиновых кислот, накапливающихся в цитоплазме и вызывающих активацию сигнальных каскадов врожденного иммунитета, принимает участие экзонуклеаза TREX1 (three prime repair exonuclease 1).

Белок TREX1 относится к семейству DEDD-экзонуклеаз, имеющих в составе консервативный Asp–Glu–Asp–Asp-мотив и обладающих 3’-экзонуклеазной активностью. Белки из этого семейства удаляют лишние нуклеотиды с 3’-конца оцДНК при репликации и/или репарации. Структурно TREX1 (молекулярный вес 32 кДа, 314 а. о.) состоит из трех доменов с экзонуклеазной активностью (экзонуклеазный домен I, II, и III) и полипролинового домена (PPII), расположенных на N-конце, а также С-концевой области (80 а. о., с большим количеством Leu), включающей один трансмембранный домен, который участвует в клеточной локализации фермента в ЭПР (преимущественно в перинуклеарном пространстве) (рис. 10а). TREX1 функционирует в качестве гомодимера, причем структура сформированного димера TREX1 уникальна среди белков этого семейства и определяет его каталитическую активность [106–108] (рис. 10б). Известно, что С-конец TREX1 способен взаимодействовать с гликозилирующим комплексом (OST) и комплексом репарации ДНК (SET).

 

Рис. 10. Схема доменной организации TREX1 (а) и модель структуры гомодимера TREX1 (б) (адаптировано из [106, 107], используется с разрешения издательства). б — Мономеры TREX1 обозначены голубым и фиолетовым цветами. Черным квадратом выделена область активного центра, где связываются ионы магния (зеленые сферы) и нуклеотид dТМP (желто-оранжевая структура), а также происходит связывание оцДНК. В составе мономера присутствует неупорядоченная петля (166–174 а. о.), принимающая участие в связывании с дцДНК. Положение петли обозначено Ala165 и Lys175.

 

TREX1 вовлечен в иммунную регуляцию в ответ на вирусную инфекцию. При инфицировании HIV1 в клетках снижалось количество вирусной ДНК за счет работы TREX1, что предотвращало активацию STING-зависимого сигнального пути [109]. Предполагается, что TREX1 выступает в роли отрицательного регулятора врожденного иммунного ответа путем деградации аберрантной ДНК (оцДНК, ретроэлементы и др.), препятствуя ее накоплению в цитоплазме и отменяя стимуляцию STING-опосредованной продукции интерферонов I типа в иммунных и опухолевых клетках [110]. При мутациях в гене Trex1 или подавлении экспрессии Trex1 у мышей происходит повышение продукции интерферона и развитие серьезных аутоиммунных заболеваний (системная красная волчанка, амиотрофический латеральный склероз и др.) [111–113].

Вопрос о том, как TREX1 способен активировать сигнальный путь cGAS–STING остается малоизученным. Возможно, между TREX1 и STING существует какое-то прямое или непрямое взаимодействие, поскольку и TREX1, и STING локализуются в ЭПР. Однако важно отметить, что TREX1 в качестве субстрата использует оцДНК, тогда как STING преимущественно активируется дцДНК. Получение животных с одновременным нокаутом TREX1 и STING поможет понять степень взаимодействия между этими белками, а также установить роль TREX в активации STING-зависимой продукции интерферонов. Несмотря на то, что механизмы участия TREX в индукции интерферона требуют более детального изучения, в настоящее время разработка ингибиторов TREX1 является одной из стратегий активации сигнальных путей, приводящих к продукции провоспалительных цитокинов. Уже был синтезирован ингибитор TREX1, CPI-381, и исследовано его влияние на активацию сигнального каскада cGAS–STING в условиях in vitro и противоопухолевое действие в условиях in vivo. CPI-381 вызывал продукцию cGAMP в клетках B16F1 после трансфекции ДНК. В клетках THP-1 наблюдалась повышенная экспрессия ключевых интерферон-стимулируемых генов. В клетках B16F10, MB49, MC38, CT26 с нокаутом TREX повышалась секреция IFN-β. У мышей с сингенной опухолью, вызванной клетками MC38, отмечалось снижение роста опухолей, как при лечении CPI-381, так и в комбинации с анти-PD1-терапией [114].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разнообразие внутриклеточных сенсоров нуклеиновых кислот, участвующих в активации cGAS–STING сигнального пути, индуцирующего иммунный ответ, открывает широкие возможности для применения агонистов или антагонистов этих сенсоров с целью повышения или снижения иммунного ответа при онкологических и других заболеваниях. Однако для использования этой стратегии в терапии рака на практике потребуется провести большое количество исследований, посвященных определению состояния молекулярно-генетического профиля cGAS–STING сигнального пути в разных типах опухолей, в связи с тем, что в некоторых типах рака (рак толстой кишки и меланома) STING-зависимый сигнальный путь подавлен из-за генетических мутаций или эпигенетической регуляции промоторов STING/cGAS, что приводит к невозможности продукции цитокинов и их участию в иммунологическом надзоре [115]. Таким образом, для разработки STING-таргетированной терапии могут потребоваться персонализированные протоколы, учитывающие особенности cGAS–STING сигнального пути конкретных пациентов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Источники финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Министерства науки и высшего образования РФ № 075–15–2021–1060 от 28.09.2021 г. и НИР в рамках ГЗ на выполнение государственных работ в сфере научной деятельности ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России по теме: «Разработка нового класса противоопухолевых препаратов, основанных на таргетной стимуляции сигнального пути STING в злокачественных новообразованиях» (№ 123021500025–1).

Соответствие принципам этики. Для данной статьи авторами не проводились эксперименты с участием людей или животных в качестве объектов исследования.

About the authors

L. V. Smolyaninova

Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: smolyaninovalarisa1@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 115478

O. N. Solopova

Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: smolyaninovalarisa1@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 115478

References

Supplementary files