Antioxidant activity of catecholamines during the oxidation of methyl linoleoate in Triton X-100 micelles

Full Text

1. ВВЕДЕНИЕ

Катехоламины играют важную роль в жизнедеятельности организмов, выполняя нейромедиаторные функции. По химической природе катехоламины являются производными пирокатехина, т.е. относятся к полифенолам. Ранее было показано, что многие полифенолы являются эффективными антиоксидантами [1–3], а некоторые из них по силе действия сравнимы с α-токоферолом. В этой связи следует ожидать, что катехоламины обладают антиоксидантными свойствами. Исследование активности антиоксидантов проводят как с использованием в качестве субстратов окисления объектов биологической природы, так и с применением модельных систем [4]. Удобной моделью для изучения антиоксидантов в условиях, приближенных к липидной мембране, является окисление метиллинолеата в мицеллах [3]. Исследование с применением данной модели ранее было проведено только для двух представителей катехоламинов; результаты имеют неоднозначный характер [5]. В настоящей работе исследовано влияние катехоламинов на окисление метиллинолеата в мицеллах Triton X-100 при различных значениях pH среды, а также в присутствии фермента супероксиддисмутазы.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовались следующие реактивы производства компании Sigma-Aldrich: азоинициатор – 2,2′-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорид (AAPH); мицеллообразователь – Triton X-100, субстрат окисления – метиллинолеат (LH); катехоламины (в виде гидрохлоридов) – адреналин, норадреналин, 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА), дофамин. Супероксиддисмутаза (СОД) из бычьей печени применялась как акцептор супероксидных радикалов.

Буферный раствор готовили путем смешивания индивидуальных растворов NaH₂PO₄ и Na₂HPO₄ производства компании Merck (Germany) концентрации 0.05 моль ⋅ л^–1, которые дополнительно очищали от следов переходных металлов с помощью ионообменной смолы Chelex-100 производства компании Bio-Rad (USA).

Окисление LH (0.01 моль ⋅ л^–1) исследовали в мицеллах Triton X-100 (0.05 моль ⋅ л^–1) в фосфатном буфере (0.05 моль ⋅ л^–1) под действием инициатора AAPH (0.004 моль ⋅ л^–1) при 310 K. Кинетику поглощения кислорода при окислении LH изучали с использованием кислородного биологического монитора YSI 5300A (USA). Скорость инициирования W_i определяли методом ингибиторов по времени окончания периода индукции τ_ind с помощью соотношения W_i = 2[InH]₀/τ_ind. В качестве ингибитора (InH) при этом использовали 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилбензохроман-2-карбоновую кислоту (Sigma Aldrich). Коэффициенты ингибирования f определяли по формуле

$f={\tau }_{ind}{W}_i/\left[{\text{QH}}_2\right].$

Величины τ_ind определяли интегральным методом по уравнению

${\tau }_{ind}=\underset{0}{\overset{\infty }{\int }}\left(1-{\left(\frac{W}{W_0}\right)}^2\right)dt,$

где [QH₂] — концентрация фенола, W₀ и W — скорость окисления в отсутствие и в присутствии ингибитора соответственно.

Значение константы скорости реакции фенолов с пероксидным радикалом, k₄, определяли по изменению скорости ингибированного окисления во времени согласно уравнению [6]

$\ln \frac{1+W/W_0}{1-W/W_0}-\frac{W_0}{W}=\frac{k_{\text{4}}{W}_0}{k_2\left[\text{LH}\right]}t+\text{const,}$

где k₂ — константа скорости продолжения цепи в LH (70 л ⋅ моль^–1 ⋅ с^–1 [7]).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Первоначально исследовано влияние катехоламинов на окисление LH в мицеллах Triton X-100 при pH = 7.4. Установлено, что введение катехоламинов приводит не к снижению скорости окисления, а даже к некоторому ее возрастанию (рис. 1, сплошные точки). Таким образом, катехоламины не проявляют антиоксидантного действия при окислении LH в мицеллах Triton X-100 при pH = 7.4. Ранее такой эффект был обнаружен для отдельных катехоламинов [5], гидрохинонов [8, 9] и производных пирогаллола [3]. Отсутствие антиоксидантного действия у ДОФА и дофамина авторы объясняли их высокой гидрофильностью [5], приводящей к низкой локальной концентрации в мицеллах. Но более вероятной причиной этого эффекта является взаимодействие фенола QH₂ или феноксильного радикала QH^• с кислородом, приводящее к образованию гидропероксидного (супероксидного) радикала, ведущего далее цепь окисления [3, 8]. В этом случае ингибирование возможно только при эффективном устранении радикалов HO₂^•/O₂^•– из системы, которого можно достигнуть путем введения фермента супероксиддисмутазы [3, 8, 9]. Поэтому далее было исследовано влияние концентрации катехоламинов на скорость окисления LH в присутствии СОД (рис. 1, контурные точки). Отметим, что введение СОД само приводит к снижению скорости неингибированного окисления LH на ~30 %, что обусловлено блокированием передачи цепи между мицеллами за счет радикала HO₂^• [7, 10]. В области низких концентраций катехоламины, за исключением адреналина, ингибируют окисление LH в присутствии СОД. При их высоких концентрациях (>2 ⋅ 10^–5 моль · л^–1) происходит увеличение скорости окисления, т.е. проявляется некоторое прооксидантное действие.

 

Рис. 1. Зависимость скорости окисления LH в мицеллах W от концентрации адреналина (▲, $∆$), норадреналина (⬥, $\diamond$), ДОФА (■, $\square$) и дофамина (●, ○) в отсутствие (темные точки) и в присутствии 100 ед./мл СОД (светлые точки) при pH = 7.4.

 

Классический механизм антиоксидантного действия полифенолов представлен на Cхеме 1. Антиоксидантную активность характеризуют двумя независимыми параметрами: константой скорости взаимодействия с пероксидным радикалом, k₄, и коэффициентом ингибирования f. Для определения данных параметров была исследована кинетика ингибированного катехоламинами окисления LH в мицеллах в присутствии СОД при pH = 7.4; примеры кинетических кривых приведены на рис. 2. Результаты определения параметров антиоксидантной активности для исследованных катехоламинов представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Параметры антиоксидантной активности катехоламинов при окислении LH в мицеллах в присутствии 100 ед./мл СОД, при pH = 7.4

QH2	k4, л ⋅ моль-1 ⋅ с-1	f	lg P [16]
Дофамин	5.3 ⋅ 103	4.4	–0.99
ДОФА	4.4 ⋅ 103	2.9	–2.38
Норадреналин	3.4 ⋅ 103	4.7	–1.85

 

Схема 1. Механизм антиоксидантного действия полифенолов [1, 3]

$\text{I}\stackrel{+{\text{O}}_2,+\text{LH}}{\to }{\text{L}}^{•},$ (i)

${\text{L}}^{•}+{\text{O}}_2\to {\text{LO}}_2^{•},$ (1)

${\text{LO}}_2^{•}+\text{LH}\to \text{LOOH}+{\text{L}}^{•},$ (2)

${\text{LO}}_2^{•}+{\text{ LO}}_2^{•}\to Продукты,$ (3)

${\text{LO}}_2^{•}+{\text{QH}}_2\to \text{LOOH }+{\text{QH}}^{•},$ (4)

${\text{LO}}_2^{•}+{\text{QH}}^{•}\to \text{Q}+ \text{LOOH},$ (5)

${\text{QH}}^{•}+{\text{QH}}^{•}\to {\text{QH}}_2+\text{Q}.$ (6)

Значения коэффициента ингибирования f для всех соединений значительно превышает теоретическое значение для фенолов, равное двум [1, 3]. Кроме того, из кинетических кривых видно, что скорость в середине периода индукции падает по сравнению с таковой в его начале (рис. 2). Ранее оба подобных эффекта были обнаружены для некоторых производных пирокатехина при окислении LH в мицеллах и объяснены реакциями продуктов превращения антиоксидантов с исходными фенолами [3]. В случае катехоламинов к регенерации ОН-групп в ходе окисления может приводить циклизация первичного продукта превращения – орто-хинона, являющаяся одной из стадий превращения катехоламинов в циклические хиноидные структуры [11, 12]. Например, превращение дофамина в аминохром можно описать следущей последовательностью стадий:

 

 

 

Рис. 2. Кинетические кривые поглощения кислорода при окислении LH в мицеллах без ингибитора (1) и в присутствии 4 · 10–6 моль · л–1 ДОФА (2), дофамина (3) и норадреналина (4); [СОД] = 100 ед./мл, pH = 7.4.

 

Данный процесс может протекать не только ферментативным, но и радикальным путем [12–14]. На второй стадии представленной упрощенной схемы образуется производное пирокатехина гетероциклической природы (5,6-дигидроксииндол), которое само по себе должно обладать антиоксидантными свойствами. Причем наличие донорной аминогруппы в бензольном кольце может обуславливать более высокую силу антиоксидантного действия по сравнению с исходным катехоламином. Отметим, что значения f для катехоламинов при окислении этилбензола не превышают двух [15], т.е. такая циклизация в органической среде не происходит.

Значения k₄ для катехоламинов (табл. 1) близки между собой. Как показано ранее [3, 8], значения k₄ в мицеллах являются эффективными и зависящими от нескольких факторов: образования водородной связи между ОН-группой фенола и полярными компонентами системы, распределения антиоксиданта между внутренней частью мицеллы и водой. Последний фактор количественно можно охарактеризовать величиной lg P – логарифмом коэффициента распределения в стандартной системе “октанол–вода” (табл. 1). Абсолютные значения k₄ для исследованных катехоламинов не должны сильно различаться, поскольку наличие гидроксильных и карбоксильных групп в боковой цепи не может оказывать сильного влияния на фенольные группы посредством индуктивного эффекта. По этой же причине значения констант комплексообразования фенольных ОН-групп катехоламинов с компонентами среды также, вероятно, близки. Примечательно, что из трех исследованных катехоламинов близкой структуры наибольшим значением k₄ обладает дофамин, являющийся согласно приведенным lg P (табл. 1) более липофильным соединением из представленных.

Итак, при pH = 7.4 катехоламины не тормозят окисление LH, а ингибирование возможно только при введении СОД. Подобный эффект свидетельствует о протекании побочных реакций с участием катехоламинов, наиболее вероятными из которых являются взаимодействие феноксильных радикалов с кислородом по радикальному или ион-радикальному механизмам, а также реакция прямого автоокисления антиоксиданта кислородом:

$\begin{array}{c}{\text{QH}}^{•}+{\text{O}}_2\to \text{Q}+{\text{HO}}_2^{•} \\ {\text{или\hspace{0.33em}\hspace{0.33em}\hspace{0.33em}Q}}^{•–}+{\text{O}}_2\to \text{Q}+{\text{O}}_2^{•-},\\ {\text{QH}}_2+{\text{ O}}_2\to {\text{QH}}^{•}+{{\text{ HO}}_2}^{•} \\ {\text{или\hspace{0.33em}\hspace{0.33em}\hspace{0.33em}QH}}^{–}+{\text{O}}_2\to {\text{QH}}^{•}+{\text{O}}_2^{•-}.\end{array}$

Для определения ключевой реакции, приводящей к образованию радикалов HO₂^•/O₂^•–, было исследовано ингибированное окисление LH в мицеллах при различных значениях pH буферного раствора. С уменьшением pH все исследованные катехоламины проявляют ингибирующее действие даже в отсутствие СОД: с увеличением концентрации катехоламина происходит однозначное снижение скорости окисления (представлено на рис. 3 на примере дофамина). Увеличение эффективности антиоксидантного действия при снижении pH свидетельствует о том, что катехоламины (или их феноксильные радикалы) вступают в побочные реакции в ионизированной форме.

 

Рис. 3. Зависимость скорости окисления LH в мицеллах от концентрации дофамина при pH = 4.0 (1), 5.0 (2), 6.0 (3), 7.4 (4).

 

Проведем кинетическую оценку вклада автоокисления катехоламинов в отсутствие у них антиоксидантных свойств при pH = 7.4. При [QH₂] = = 4 ⋅ 10^–5 моль · л^–1 начальная скорость окисления адреналина в буферном растворе с pH 7.4, измеренная по поглощению кислорода, составила 1.5 ⋅ 10^–8 моль · л^–1 · с^–1. Если принять, что расходование катехоламина описывается кинетическим уравнением псевдопервого порядка с эффективной константой скорости k = 1.5 ⋅ 10^–8/4 ⋅ 10^–5 = = 3.8 ⋅ 10^–4 c^–1, то время его полупревращения составит 30 мин. В условиях ингибированного окисления при данной концентрации [QH₂] теоретический период индукции (при f = 2) равен 350 мин. Очевидно, что скорость расходования адреналина в процессе автоокисления существенно превышает скорость его ожидаемого взаимодействия с пероксидными радикалами в процессе ингибированного окисления. Таким образом, автоокисление катехоламинов объясняет отсутствие у них антиоксидантных свойств при pH = 7.4. Введение СОД подавляет процесс автоокисления, вследствие чего катехоламины тормозят окисление LH в мицеллах. При этом следует понимать, что автоокисление включает в себя реакцию с кислородом не только фенолов, но и их феноксильных радикалов. По-видимому, протекание обеих реакций обуславливает отсутствие антиоксидантных свойств у катехоламинов.

Механизм анти/прооксидантного действия катехоламинов при окислении LH в мицеллах может быть описан Схемой 1 с включением в нее дополнительных реакций (Схема 2). Побочные реакции (7) и (8) обуславливают прооксидантное действие катехоламинов, так как образующиеся в них радикалы O₂^•– (HO₂^•) продолжают цепи окисления аналогично реакции (2) в Схеме 1. Снижение pH среды уменьшает концентрацию анионных форм (QH^– и Q^•–), и, как следствие, вклад побочных реакций (7), (8) в сравнении с основными реакциями ингибирования (4)–(6). Реакция (9) схематично изображает регенерацию OH-групп при циклизации орто-хинонов катехоламинов.

Схема 2. Реакции катехоламинов и продуктов их превращения при окислении LH в мицеллах

${\text{QH}}_2 \rightleftarrows {\text{QH}}^{–}+{\text{H}}^{+},$

${\text{QH}}^{•}\rightleftarrows {\text{Q}}^{•–}+{\text{H}}^{+},$

${\text{QH}}^{–}+{\text{O}}_2\to {\text{QH}}^{•}+{{\text{O}}_2}^{•–},$ (7)

${\text{Q}}^{•–}+{\text{O}}_2\to \text{Q }+{{\text{O}}_2}^{•–},$ (8)

${\text{HO}}_2^{•}\rightleftarrows {\text{O}}_2^{•-}+{\text{H}}^{+}\text{},$

_{$\text{Q}{\to }_2.$} (9)

Следует отметить, что окисление LH в мицеллах Triton X-100 является очень упрощенной моделью окислительных процессов в липидных мембранах. В реальных клеточных мембранах фенольные антиоксиданты могут взаимодействовать с фосфолипидами [17, 18], что может приводить к усилению антиоксидантного действия. Так, показано, что дофамин ингибирует окисление метиллинолеата в липосомах при pH = 7.4, причем ингибирование более выражено в липосомах фосфатидилхолина, чем в липосомах фосфатидилглицерина [19]. Авторы объясняют данный эффект гидрофобным взаимодействием дофамина с фосфатидилхолином на поверхности липосомы.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Катехоламины не тормозят окисление метилленолеата в мицеллах при pH = 7.4, вследствие побочных реакций взаимодействия QH^– и Q^•– с кислородом с образованием супероксидных анион-радикалов. Введение СОД, а также снижение pH среды подавляют данные процессы и благоприятствуют ингибированию. Высокие значения коэффициентов ингибирования для катехоламинов в присутствии СОД обусловлены циклизацией образующихся орто-хинонов, приводящей к регенерации ОН-групп. Наиболее активным антиоксидантом из исследованных катехоламинов является дофамин, обладающий более высокой липофильностью.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 20-13-00148; https://rscf.ru/project/20-13-00148/.

About the authors

V. A. Ryabkova

Demidov Yaroslavl State University

Email: tikhonoviv.ysu@gmail.com
Russian Federation, Yaroslavl

I. V. Tikhonov

Demidov Yaroslavl State University

Author for correspondence.
Email: tikhonoviv.ysu@gmail.com
Russian Federation, Yaroslavl

E. M. Pliss

Demidov Yaroslavl State University

Email: tikhonoviv.ysu@gmail.com
Russian Federation, Yaroslavl

References

Supplementary files