Трехпетельные токсины гадюк – клонирование кДНК и экспрессия в E. coli с использованием химерной (гибридной) конструкции с белком-партнером SUMO

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Трехпетельные токсины (ТПТ) образуют одно из наиболее обширных семейств токсинов змеиных ядов. ТПТ характерны для большинства ядов аспид, но практически не встречаются в ядах гадюк. С использованием ядовитых желез гадюк Vipera nikolskii и V. berus был получен 21 клон кДНК, кодирующий эту группу токсинов. Из полученных последовательностей кДНК были выведены аминокислотные последовательности 9 ТПТ. Установленные последовательности имеют сигнальные пептиды, содержащие 19-21 аминокислотный остаток, за которыми следует зрелый белок, состоящий из 67 остатков. Все ТПТ гадюк относятся к группе нетрадиционных (non-conventional) токсинов, а их последовательности содержат 9 остатков цистеина. ТПТ, кодируемый одним из транскриптов, был получен гетерологической экспрессией в клетках E. coli в виде гибридного белка с растительным белком-партнером SUMO с последующим отщеплением специфичной растительной протеазой Bd-SENP1 и хроматографической очисткой. Структура полученного белка подтверждена методом масс-спектрометрии. Анализ его биологической активности показал, что этот токсин – слабый антагонист никотиновых холинорецепторов нейронного α7 и α3β2 подтипов. С использованием гибридного белка с SUMO мы также попытались получить ТПТ Aze-2 гадюки Azemiops feae, аминокислотная последовательность которого была установлена нами ранее в результате транскриптомного анализа ядовитой железы A. feae, а сам белок в минимальных количествах был идентифицирован в яде этой змеи. Однако токсин, точно соответствующий по массе Aze-2, с использованием этого подхода получить не удалось. Таким образом, в результате работы были установлены аминокислотные последовательности 9 ТПТ гадюк, один из которых был получен экспрессией гена в клетках E. coli и проявил способность взаимодействовать с никотиновыми холинорецепторами нейронного α7 и α3β2 подтипов.

Об авторах

Д. А Сухов

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН; МИРЭА – Российский технологический университет

Москва, Россия; Москва, Россия

Л. О Оджомоко

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

И. В Шелухина

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

М. В Владыкина

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

В. Ю Кост

Институт Вейцмана

отдел химической и структурной биологии Реховот, Израиль

Р. Х Зиганшин

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

О. В Гераськина

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Москва, Россия

С. В Баландин

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

Т. В Овчинникова

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

В. И Цетлин

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Москва, Россия

Ю. Н Уткин

ФГБУН ГНЦ "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН

Email: yutkin@yandex.ru
Москва, Россия

Список литературы

  1. Utkin Y., Sunagar K., Jackson T.N., Reeks T., Fry B.G. // In Venomous Reptiles and Their Toxins: Evolution, Pathophysiology and Biodiscovery. Ed. Fry B.G. New York: Oxford University Press, 2015. P. 215– 227.
  2. Dubovskii P.V., Utkin Y.N. // Toxins (Basel). 2024. V. 16. P. 262. https://doi.org/10.3390/toxins16060262
  3. Nirthanan S., Gopalakrishnakone P., Gwee M.C., Khoo H.E., Kini R.M. // Toxicon. 2003. V. 41. P. 397– 407. https://doi.org/10.1016/s0041-0101(02)00388-4
  4. Heyborne W.H., Mackessy S.P. // Toxicon. 2021. V. 190. P. 22–30. https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2020.12.002
  5. Srodawa K., Cerda P.A., Davis Rabosky A.R., Crowe-Riddell J.M. // Toxins (Basel). 2023. V. 15. P. 523. https://doi.org/10.3390/toxins15090523
  6. Junqueira-de-Azevedo I.L., Ching A.T., Carvalho E., Faria F., Nishiyama M.Y. Jr., Ho P.L., Diniz M.R. // Genetics. 2006. V. 173. P. 877–889. https://doi.org/10.1534/genetics.106.056515
  7. Pahari S., Mackessy S.P., Kini R.M. // BMC Mol. Biol. 2007. V. 8. P. 115. https://doi.org/10.1186/1471-2199-8-115
  8. Nicolau C.A., Carvalho P.C., Junqueira-de-Azevedo I.L., Teixeira-Ferreira A., Junqueira M., Perales J., Neves- Ferreira A.G., Valente R.H. // J. Proteomics. 2017. V. 151. P. 214–231. https://doi.org/10.1016/j.jprot.2016.06.029
  9. Babenko V.V., Ziganshin R.H., Weise C., Dyachenko I., Shaykhutdinova E., Murashev A.N., Zhmak M., Starkov V., Hoang A.N., Tsetlin V., Utkin Y. // Biomedicines. 2020. V. 8. P. 249. https://doi.org/10.3390/biomedicines8080249
  10. Dingwoke E.J., Adamude F.A., Mohamed G., Klein A., Salihu A., Abubakar M.S., Sallau A.B. // Biochem. Biophys. Rep. 2021. V. 28. P. 101164. https://doi.org/10.1016/j.bbrep.2021.101164
  11. Kovalchuk S.I., Ziganshin R.H., Starkov V.G., Tsetlin V.I., Utkin Y.N. // Toxins (Basel). 2016. V. 8. P. 105. https://doi.org/10.3390/toxins8040105
  12. Makarova Y.V., Kryukova E.V., Shelukhina I.V., Lebedev D.S., Andreeva T.V., Ryazantsev D.Y., Balandin S.V., Ovchinnikova T.V., Tsetlin V.I., Utkin Y.N. // Dokl. Biochem. Biophys. 2018. V. 479. P. 127–130. https://doi.org/10.1134/S1607672918020205
  13. Malakhov M.P., Mattern M.R., Malakhova O.A., Drinker M., Weeks S.D., Butt T.R. // J. Struct. Funct. Genomic. 2004. V. 5. P. 75–86. https://doi.org/10.1023/B:JSFG.0000029237.70316.52
  14. Kuo D., Nie M., Courey A.J. // Methods Mol. Biol. 2014. V. 1177. P. 71–80. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-1034-2_6
  15. Frey S., Görlich D. // J. Chromatogr. A. 2014. V. 1337. P. 95–105. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2014.02.029
  16. Doley R., Tram N.N., Reza M.A., Kini R.M. // BMC Evol. Biol. 2008. V. 8. P. 70. https://doi.org/10.1186/1471-2148-8-70
  17. Chang L.S., Lin S.R., Chang C.C. // Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 354. P. 1–8. https://doi.org/10.1006/abbi.1998.0660
  18. Fry B.G., Scheib H., van der Weerd L., Young B., McNaughtan J., Ramjan S.F., Vidal N., Poelmann R.E., Norman J.A. // Mol. Cell Proteomics. 2008. V. 7. P. 215–246. https://doi.org/10.1074/mcp.M700094-MCP200
  19. Modahl C.M., Mackessy S.P. // PLoS Negl. Trop. Dis. 2016. V. 10. P. e0004587. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004587
  20. Modahl C.M., Mrinalini, Frietze S., Mackessy S.P. // Proc. Biol. Sci. 2018. V. 285. P. 20181003. https://doi.org/10.1098/rspb.2018.1003
  21. Escherichia coli [gbbct]: 8087 CDS's (2330943 codons) // Codon Usage Database. https://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon. cgi?species=37762
  22. Carpanta V., Clement H., Arenas I., Corzo G. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2024. V. 732. P. 150420. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2024.150420
  23. Drake A.F., Dufton M.J., Hider R.C. // Eur. J. Biochem. 1980. V. 105. P. 623–630. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04540.x
  24. Micsonai A., Wien F., Kernya L., Lee Y.H., Goto Y., Réfrégiers M., Kardos J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. P. E3095–E3103. https://doi.org/10.1073/pnas.1500851112
  25. Micsonai A., Moussong É., Wien F., Boros E., Vadászi H., Murvai N., Lee Y.H., Molnár T., Réfrégiers M., Goto Y., Tantos Á., Kardos J. // Nucleic Acids Res. 2022. V. 50(W1). P. W90–W98. https://doi.org/10.1093/nar/gkac345
  26. Feofanov A.V., Sharonov G.V., Dubinnyi M.A., Astapova M.V., Kudelina I.A., Dubovskii P.V., Rodionov D.I., Utkin Y.N., Arseniev A.S. // Biochemistry (Moscow). 2004. V. 69. P. 1148–1157. https://doi.org/10.1023/b:biry.0000046890.46901.7e
  27. Severyukhina M.S., Ojomoko L.O., Shelukhina I.V., Kudryavtsev D.S., Kryukova E.V., Epifanova L.A., Denisova D.A., Averin A.S., Ismailova A.M., Shaykhutdinova E.R., Dyachenko I.A., Egorova N.S., Murashev A.N., Tsetlin V.I., Utkin Y.N. // Int. J. Biol. Macromol. 2025. V. 288. P. 138626. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.138626
  28. Otto P., Kephart D., Bitner R., Huber S., Volkerding K. // Promega Notes. 1998. V. 69. P. 19–23.
  29. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
  30. Ryabinin V.V., Ziganshin R.H., Starkov V.G., Tsetlin V.I., Utkin Y.N. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 107–121. https://doi.org/10.1134/S1068162019020109
  31. Rappsilber J., Mann M., Ishihama Y. // Nat. Protoc. 2007. V. 2. P. 1896–1906. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.261
  32. Geyer P.E., Kulak N.A., Pichler G., Holdt L.M., Teupser D., Mann M. // Cell Syst. 2016. V. 2. P. 185– 195. https://doi.org/10.1016/j.cels.2016.01.002
  33. Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2003. V. 17. P. 2337–2342. https://doi.org/10.1002/rcm.1198
  34. Lebedev D.S., Kryukova E.V., Ivanov I.A., Egorova N.S., Timofeev N.D., Spirova E.N., Tufanova E.Y., Siniavin A.E., Kudryavtsev D.S., Kasheverov I.E., Zouridakis M., Katsarava R., Zavradashvili N., Iagorshvili I., Tzartos S.J., Tsetlin V.I. // Mol. Pharmacol. 2019. V. 96. P. 664–673. https://doi.org/10.1124/mol.119.117713

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2025

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».