Boc/Bzl solid phase synthesis of deltorphin II and its analogues without utilization of anhydrous hydrogen fluoride

V. N. Azev; Азев В. Н.; L. G. Mustaeva; Мустаева Л. Г.; E. Y. Gorbunova; Горбунова Е. Ю.; L. K. Baidakova; Байдакова Л. К.; A. N. Chulin; Чулин А. Н.; L. N. Maslov; Маслов Л. Н.; A. V. Mukhomedziyanov; Мухомедзянов А. В.; М. V. Molchanov; Молчанов М. В.; A. I. Miroshnikov; Мирошников А. И.

doi:10.31857/S0132342324050089

Boc/Bzl-твердофазный синтез пептида дельторфина II и его аналогов без применения безводного фтористого водорода

Авторы: Азев В.Н.¹, Мустаева Л.Г.¹, Горбунова Е.Ю.¹, Байдакова Л.К.¹, Чулин А.Н.¹, Маслов Л.Н.², Мухомедзянов А.В.², Молчанов М.В.³, Мирошников А.И.⁴
Учреждения:
1. Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
2. НИИ кардиологии, Томский НИМЦ
3. Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
4. Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
Выпуск: Том 50, № 5 (2024)
Страницы: 657-664
Раздел: Статьи
URL: https://journals.rcsi.science/0132-3423/article/view/272176
DOI: https://doi.org/10.31857/S0132342324050089
EDN: https://elibrary.ru/LQWVAU
ID: 272176

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Токсичность безводного фтористого водорода – ключевой фактор поиска альтернативных кислот Льюиса для проведения процессов глобального удаления защитных групп и снятия пептидов с полимерной подложки на последней стадии их Boc/Bzl-синтеза. В отличие от фтористого водорода, эти кислоты – высококипящие соединения, но благоприятные физико-химические свойства большинства пептидов позволяют отделить целевой продукт от избытка кислот посредством метода переосаждения. Мы обнаружили, что этот метод не применим для синтеза образцов пептида дельторфина II и его аналогов, в связи с чем были исследованы иные способы их выделения и очистки. В результате были разработаны альтернативные методы синтеза, выделения и эффективной очистки пептидов класса дельторфина II. Новые подходы могут найти применение в синтезе других гидрофобных пептидов.

Ключевые слова

Boc/Bzl-методология, дельторфин II, кислота Льюиса, твердофазный синтез пептидов

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Пептид дельторфин II (H-Tyr-(D)-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH₂) – высокоселективный агонист δ-опиоидного рецептора (δ-ОР) [1]. Модуляторы опиоидных рецепторов проявляют биологическую активность не только в отношении ЦНС: в частности, в последнее время активно исследовалась кардиопротекторная активность агонистов и антагонистов опиоидных рецепторов [2, 3], включая δ-ОР [4].

Кардиопротекторный эффект дельторфина II изучен мало, хотя была продемонстрирована значительная инфаркт-лимитирующая активность этого пептида [5, 6], кроме того, проводились исследования, направленные на установление молекулярного механизма этой активности [7]. Совокупность полученных данных позволила нам сделать вывод о перспективности продолжения работ по изучению кардиопротекторных свойств дельторфина II и его аналогов, что, в свою очередь, требовало разработки эффективных методов их химического синтеза.

Некоторые аналоги дельторфина II синтезировали в растворе по блочной схеме, в которой сборка целевых пептидов происходила с активацией трипептида, содержащего фенилаланин на С-конце [8]. Авторы не оценивали степень протекания побочной реакции рацемизации хирального центра фенилаланина, хотя известно, что на модельных пептидах такое осложнение протекает в значительной степени [9].

Описаны Fmoc/^tBu-твердофазные синтезы дельторфина II и различных его аналогов. При применении этого подхода в общем случае могут образовываться побочные продукты удвоения аминокислот [10], а в одном из конкретных литературных примеров практической реализации этого метода для синтеза аналогов дельторфина II были описаны трудности в образовании амидных связей между остатками валинов и Glu-Val [11].

Boc/Bzl-методология твердофазного пептидного синтеза лишена этих недостатков, однако в ее практической реализации в классическом варианте применяется безводный фтористый водород – реагент для глобального деблокирования и снятия целевых соединений с полимерной подложки [12]. Это токсичный реагент, и, кроме того, для проведения экспериментальной работы с его использованием требуется специальное оборудование из фторуглеродных материалов [13]. Тем не менее в практике Boc/Bzl-методологии твердофазного пептидного синтеза используются другие кислоты Льюиса для осуществления тех же химических превращений, в том числе для синтеза С-концевых амидных форм пептидов: растворы триметилсилибромида [14], триметилсилилтрифлата [15] и трифторметансульфокислоты [16] в трифторуксусной кислоте в присутствии тиоанизола и других нуклеофильных добавок.

Целью данной работы был поиск альтернативного эффективного метода химического синтеза пептида дельторфина II (I) и его аналогов с использованием Boc/Bzl-методологии без применения безводного фтористого водорода. Помимо пептида (I) объектами исследования были следующие его аналоги: соединения H-Tyr-D-Ala-Phe(4-NO₂)-Glu-Val-Val-Gly-NH₂ (II), H-Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Ser-NH₂ (III) и H-Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-D-Ala-NH₂ (IV).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Используя в начале всей работы пептид (I) в качестве модельного соединения, изучали возможность применения ускоренного протокола пошагового наращивания пептидной цепи, в котором стадия конденсации оксибензотриазолилового эфира аминокислоты с аминогруппой пептидил-полимера требует 10–20 мин [17]. Однако на стадии образования связи Val⁵–Val⁶ результаты качественного теста Кайзера [18] однозначно свидетельствовали о низкой конверсии реакции ацилирования в этих условиях, вероятно, из-за неблагоприятного стерического взаимодействия двух изопропильных групп. Тем не менее при использовании обычных условий осуществления синтеза по Boc/Bzl-методологии [19] (первая конденсация 2–3 ч, повторная до 18 ч) наращивание пептидной цепи проходило без осложнений в случае всех синтезируемых объектов.

Неожиданный результат был получен на последних стадиях синтеза целевых соединений – деблокирования и снятия с подложки – при попытке выделения пептида (I) и его аналогов с использованием стандартного метода переосаждения. В данном методе раствор TFMSA и продуктов реакции в TFA добавляют к диэтиловому эфиру, при этом с той или иной скоростью образуется осадок, обогащенный пептидом, а избыток кислот находится в растворе. Именно таким образом выделяли, например, синтетическую рибонуклеазу А [20], и тот же метод использовали в работе, посвященной систематическому поиску условий снятия пептидов с полимерной подложки с использованием TFMSA [16]. Наконец, ранее мы аналогичным образом успешно выделяли другие пептиды [21].

При использовании указанного метода образование осадка пептида (I) не наблюдалось, и, насколько нам известно, такие прецеденты в литературе не описаны. Попытки разбавления раствора каким-либо еще малополярным растворителем или смена растворителя для переосаждения были непродуктивны. Поскольку избыток сильных кислот мог привести к протеканию побочных реакций в растворе пептида (I), другим очевидным решением была нейтрализация кислот с использованием третичных аминов. Из ряда опробованных оснований только добавление пиридина привело к образованию кристаллической массы, содержащей пептид (тест Кайзера с аликвотой осадка) в количестве ~1 масс. %.

Нам не удалось разделить пептид (I) и соли с использованием диализа, поскольку все имеющиеся у нас мембраны, по-видимому, разрушались избытком органических солей. Пробное разделение смеси пептида (I) и солей пиридина проводили с применением гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-10 (метод 1). Такой стандартный подход себя не оправдал: по результатам нингидринового теста и масс-спектрометрического анализа во фракциях A и B (рис. 1а) находился целевой пептид, при этом основная по массе фракция А содержала значительное количество солей.

Рис. 1. Хроматограммы стадий процесса гель-фильтрации смеси пептида (I) и низкомолекулярных примесей, вертикальные линии соответствуют промежутку времени 2 мин. (а) – Сорбент Sephadex G-10, отсутствие разделения при нанесении необработанной смеси; (б) – Sephadex G-10, частичное разделение после отгонки значительной части солей с водяным паром перед нанесением; (в) – сорбент Sephadex LH-20, частичное разделение при нанесении необработанной смеси; (г) – сорбент Sephadex LH-20, практически полное разделение после отгонки значительной части солей с водяным паром в ходе лиофилизации перед нанесением.

Однако мы обратили внимание на существенную разницу в массах нанесенной смеси (суммарно 1.5 г) и выделенных фракций (756 мг фракции A и 8 мг фракции B). Вероятно, значительное количество солей переходило в газовую фазу во время упаривания фракций и лиофилизации остатков после упаривания. Из литературы известно, например, что некоторые соли соединений азота настолько летучи, что могут использоваться как компоненты элюентов в ВЭЖХ-МС [22, 23].

В одном из последующих экспериментов (метод 2) по выделению смесь пептида (I) и его солей (также 1.5 г) многократно упаривали с большим объемом воды и лиофилизировали. Остаток (~270 мг) разделяли на сорбенте G-10 (рис. 1б). Такой способ разделения целевого соединения и солей имел уже некоторый успех, потому что фракция A содержала в основном пептид (I), а фракция В – по-прежнему смесь пептида (I) и трифлата пиридиния. Последний был выделен из фракции В с помощью ВЭЖХ.

С целью повышения эффективности процесса разделения анализировали возможность применения иных сорбентов. В литературе описан эксперимент по фракционированию сложной смеси соединений пептидной природы на сорбенте Sephadex LH-20 [24]. Авторы отмечают, что время удерживания пептидов зависело от числа ароматических аминокислотных остатков, вероятно, вследствие адсорбционного механизм разделения. Соли пиридина содержат один относительно гидрофобный ароматический остаток, а целевые соединения – два, и, кроме того, они содержат гидрофобные остатки аминокислоты валина. Таким образом, применение сорбента Sephadex LH-20 имело перспективы.

Действительно, при использовании этого сорбента распределение пептида во фракциях оказалось совершенно иным (метод 3). Фракция А (рис. 1в) не содержала пептид, но, в то же время, он распределился по фракциям В и С. Кроме того, порядок выхода элюатов (первыми соли, а затем пептид) свидетельствовал об адсорбционном механизме разделения соединений. Фракции В и С подвергали разделению методом ВЭЖХ, при этом выход пептида (I) оказался гораздо выше (56% против 24% по методу 2).

Исследовали также возможность проведения лиофилизации солей с водяным паром (вместо упаривания) с последующей очисткой уже на сорбенте Sephadex LH-20 (метод 4). В этом эксперименте из 1.5 г смеси после лиофилизации получили ~230 мг остатка: соотношение в целом похоже на результат с использованием метода 2. Разделение полученного лиофилизата оказалось еще более продуктивным: целевой пептид содержался в одной фракции D (рис. 1г), которая уже явно отделялась от примесей солей. Выход пептида (I) после препаративной ВЭЖХ-очистки оказался несколько более высоким, чем полученный при использовании метода 3.

В настоящее время мы не можем отдать предпочтение методу 3 или методу 4. Затраты по времени на лиофилизацию большого объема воды и на прямое разделение смеси с большей массой одинаковые (упаривание еще большего объема воды, как в методе 2, приводит к существенным временным затратам). Следует также принимать во внимание коррозионные свойства солей пиридина при проведении лиофилизации. В то же время в методе 4 целевой продукт элюировался одним пиком. С использованием метода 4 нам удалось выделить остальные объекты исследования, поскольку ни один из них также не осаждался из диэтилового эфира после стадии глобального деблокирования. Соединения (I–IV) очищали методом ВЭЖХ и тщательно характеризовали спектральными методами.

Следует отметить факт стабильности нитрогруппы в условиях ацидолиза (1 M PhSMe, 1 M TFMSA в TFA). Хотя пептиды, содержащие 4-нитрофенилаланин, были успешно синтезированы при использовании безводного фтористого водорода [25], применяемый нами реагент значительно отличается по своей химической природе, но является сильной кислотой. В то же время в сильнокислой среде известны прецеденты миграции нитрогруппы при нитровании ароматических соединений [26], а в некоторых случаях было показано, что реакция нитрования ароматических соединений может быть обратима [27]. Кроме того, существуют методы восстановления нитрогруппы в ароматических соединениях с использованием неорганических сульфидов в присутствии кислот Льюиса [28, 29], а в нашем случае восстановителем мог быть тиоанизол. Таким образом, стабильность нитрогруппы в условиях ацидолиза a priori не была однозначной. Тем не менее, несмотря на наши опасения, основным продуктом, судя по данным ЯМР-спектроскопии (наличие п-замещенной ароматической системы, содержащей сильный электроноакцепторный заместитель), было целевое соединение (II).

Применение TFMSA оказалось довольно трудоемким процессом. В одном из пробных экспериментов по использованию другой кислоты Льюиса (TMSOTf) [15] была получена смесь пептида (I) и другого соединения, которое, судя по данным масс-спектрометрического анализа (m/z 784.3851), представляло собой, по-видимому, C-концевую кислотную форму пептида (I). Дальнейшие эксперименты с использованием TMSOTf не проводились. В то же время TMSBr [14] в наших руках оказался неэффективен в снятии пептида (I) с полимерной подложки.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Все растворители, гидроксид калия, безводный хлорид кальция – коммерчески доступные продукты (Реахим и Химмед, Россия). В работе использовали стандартные производные аминокислот (IRIS Bitech GMBH, Германия); Boc-Phe(4-NO₂)-OH, м-крезол, тиоанизол (Fluka, Швейцария), трифторметансульфокислоту (Chemical Line, Россия), трифторуксусную кислоту (P&M Invest, Россия). В работе с трифторметансульфокислотой шлифы всех стеклянных приборов смазывали фторуглеродной смазкой Томфлон ПЭФ 300 (ООО “Фторполимерные технологии”, Россия). Очищенную воду (18 МОм) получали на установке Milli-Q (Millipore, США).

Спектры ЯМР регистрировали на приборе Avance III (BioSpin, Bruker, Германия) (¹Н при 600 MГц, ¹³C при 125 MГц) и калибровали по сигналам остаточных протонов дейтерированного растворителя DMSO-d₆. Химические сдвиги приведены в миллионных долях, а КССВ – в герцах. Сигналы в ¹Н-ЯМР-спектрах относили с использованием данных 2D-ЯМР-экспериментов (COSY, HSQC, HMBC). Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на приборе Orbitrap Elite Hybrid Ion Trap-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Германия).

Аналитическую ВЭЖХ проводили с использованием хроматографа Waters (Waters Corporation, США), оборудованного насосом модели 1525 и детектором 2487, на колонке Phenomenex (Phenomenex, США) Luna 5u C18 (0.46 × 25 см) с детекцией на двух длинах волн (226 и 280 нм), объемный расход элюента 1 мл/мин. Элюент A – вода (0.1%-ная TFA), элюент B – ацетонитрил. Параметры градиента: 0–1 мин – 5% B; 1–20 мин – 5–80% B; 20–21 мин – 80–5% B; 21–25 мин – 5% B.

Общие условия осуществления химического синтеза пептидил-полимеров. Синтез проводили с использованием MBHA-полимера с начальной загрузкой аминогрупп 1.2 ммоль/г (0.45 ммоль) и стандартных защищенных производных аминокислот: Boc-Tyr(2-BrZ)-OH, Boc-Glu(OBzl)-OH и Boc-Ser(Bzl)-OH. Операции промывок и деблокирования временной N_α-Boc-защитной группы проводили по известным методикам [19], а активацию производных аминокислот – с помощью TBTU [30]. Конверсию реакций ацилирования аминогрупп оценивали с использованием качественного теста Кайзера [18].

Общие условия осуществления стадии деблокирования и снятия пептида с подложки. Пептидил-полимер (0.45 ммоль) суспендировали при медленном перемешивании в смеси тиоанизола (1.4 мл) и м-крезола (0.58 мл) в одногорлой колбе, снабженной стеклянным краном (колбе Шленка), внешний штуцер которого укупорен резиновой пробкой (септой). Спустя 10 мин добавляли 100%-ную TFA (8.7 мл), подсоединяли хлоркальциевую трубку (CaCl₂), содержимое колбы охлаждали в ледяной бане в течение 10 мин. К содержимому колбы с помощью стеклянного шприца, снабженного иглой из нержавеющей стали, добавляли TFMSA (0.94 мл) через септу. Кран закрывали, содержимое колбы перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и фильтровали в диэтиловый эфир (100 мл). Пептидил-полимер на фильтре промывали TFA (3 × 0.5 мл). К колбе с эфирным раствором подсоединяли капельную воронку с противодавлением, снабженную хлоркальциевой трубкой (CaCl₂), в которую добавляли пиридин (15.2 мл). Колбу охлаждали на ледяной бане, смесь кислот нейтрализовывали пиридином при перемешивании. Содержимое колбы нагревали до комнатной температуры и фильтровали. Осадок на фильтре промывали диэтиловым эфиром (3 × 50 мл). Полученную смесь солей и пептида сушили в вакуум-эксикаторе над KOH в течение 48 ч. Масса смеси после высушивания составила 30.2–30.5 г, теоретическое содержание пептида 0.35–0.38 г (~1 масс. %).

Общие условия проведения процесса гель-фильтрации. Хроматографическое разделение проводили с использованием системы LKB Bromma (LKB, Швеция), состоящей из перистальтического насоса модели 2115, колонки 26 × 400 мм (высота слоя сорбента 320 мм), детектора серии 2158 (детекция на длине волны 226 нм), коллектора фракций модели 2211 и самописца модели 2210. Элюирование проводили в изократическом режиме с использованием 0.1 М водной AcOH с последующей промывкой колонки 1 М водной AcOH. Объемный расход элюента 3 мл/мин, объем фракции 6 мл.

Общие условия анионного обмена. Пептид растворяли в очищенной воде и выдерживали с избытком (20 экв.) анионообменной смолы IRA-400 (хлоридная форма) в течение 15 мин. Раствор фильтровали, промывали смолу очищенной водой (3 × 2 мл), после чего раствор лиофилизировали.

Разделение пептида (I) и солей пиридиния. Метод 1. Смесь солей и пептида (1.5 г) порциями по 100 мг растворяли в 0.1 М AcOH (1.5 мл), наносили на колонку гель-фильтрации и хроматографировали в соответствии с общими условиями на сорбенте Sephadex G-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция). После упаривания и лиофилизации получили 756 мг фракции A и 8 мг фракции B (рис. 1а). Ввиду значительного содержания солей во фракции А дальнейшую очистку методом ВЭЖХ не проводили.

Метод 2. Смесь солей и пептида (1.5 г) растворяли в 300 мл очищенной воды и упаривали досуха на ротационном испарителе. Процесс повторяли 10 раз. Остаток после упаривания лиофилизировали. Полученную смесь (268 мг) порциями по 35–45 мг растворяли в 0.1 М AcOH (1.5 мл), наносили на колонку гель-фильтрации и хроматографировали в соответствии с общими условиями на сорбенте Sephadex G-10. После упаривания и лиофилизации получили 4.1 мг фракции A и 38.3 мг фракции B (рис. 1б). Из обеих фракций по отдельности выделяли целевой пептид методом препаративной ВЭЖХ (28%-ный водный MeCN, 0.1%-ная TFA). После анионного обмена выход пептида (I) составил 4.3 мг (24% на все стадии).

Метод 3. Смесь солей и пептида (1.5 г) порциями по 100 мг растворяли в 0.1 М AcOH (1.5 мл), наносили на колонку гель-фильтрации и хроматографировали в соответствии с общими условиями на сорбенте Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Швеция). После упаривания и лиофилизации получили 11.5 мг фракции B и 23.2 мг фракции C (рис. 1в). Из обеих фракций по отдельности выделяли целевой пептид методом препаративной ВЭЖХ (28%-ный водный MeCN, 0.1%-ная TFA). После анионного обмена выход пептида (I) составил 10.1 мг (56% на все стадии).

Метод 4. Смесь солей и пептида (1.5 г) растворяли в 400 мл очищенной воды и лиофилизировали в течение 36 ч. Остаток перерастворяли в 100 мл очищенной воды и лиофилизировали в течение 18 ч. Полученную смесь (227 мг) порциями по 30 мг растворяли в 0.1 М AcOH (1.5 мл), наносили на колонку гель-фильтрации и хроматографировали в соответствии с общими условиями на сорбенте Sephadex LH-20. После упаривания и лиофилизации получили 69 мг фракции D (рис. 1г), из которой выделяли целевой пептид методом препаративной ВЭЖХ (28%-ный водный MeCN, 0.1%-ная TFA). После анионного обмена выход пептида (I) составил 11.2 мг (62% на все стадии).

H-Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Gly-NH₂ гидрохлорид (I). Суммарный выход 210 мг (57%). Время удерживания 14.45 мин. Спектр ¹Н-ЯМР (298 K): 0.71 (д, J 6.96, 1H, ala²СH₃β), 0.79–0.88 (м, 12H, Val⁵СH₃γ и Val⁶СH₃γ), 1.79 (м, 1H, Glu⁴СH₂β), 1.83–2.01 (м, 3H, Glu⁴СH₂β Val⁵СH₃β и Val⁶СH₃β), 2.24 (м, 2H, Glu⁴СH₂γ), 2.66 (дд, J 11.22, 13.50, 1H, Phe³СH₂β), 2.82 (м, 2H, Tyr¹СH₂β), 3.03 (дд, J 3.24, 13.74, 1H, Phe³СH₂β), 3.59 (дд, J 5.58, 16.74, 1H, Gly⁷СH₂α), 3.66 (дд, J 6.01, 16.71, 1H, Gly⁷СH₂α), 3.98 (м, 1H, Tyr¹СHα), 4.11 (ψт, J 7.38, 1H, Val⁶СHα), 4.24 (дд, J 7.08, 8.46, 1H, Val⁵СHα), 4.31 (м, 1H, Glu⁴СHα), 4.36 (м, 1H, ala²СHα), 4.59 (ддд, J 3.42, 8.48, 11.21, 1H, Phe³СHα), 6.67 (д, J 8.52, 2H, Tyr¹Ar), 6.99 (д, J 8.51, 2H, Tyr¹Ar), 7.01 (уш. с, 1H, Gly⁷NH₂), 7.11–7.31 (м, 6H, Phe³Ar и Gly⁷NH₂), 7.79 (д, J 8.76, 1H, Val₅NHα), 7.95 (д, J 8.28, 1H, Val⁶NHα), 8.05 (уш. с, 3H, Tyr¹NH₃⁺α), 8.08 (ψт, J 5.71, 1H, Gly⁷NHα), 8.32–8.39 (м, 3H, ala²NHα, Phe³NHα и Glu⁴NHα), 9.31 (с, 1H, Tyr¹OH), 12.13 (уш. с, 1H, Glu⁴СO₂Hγ). Спектр ¹³C-ЯМР (298 K): 171.17, 171.09, 170.97, 170.79, 170.61, 167.20, 156.47, 137.69, 130.46, 129.25, 127.85, 126.22, 124.69, 115.16, 58.03, 57.40, 53.34, 53.30, 51.92, 47.73, 41.70, 37.93, 36.36, 30.52, 30.14, 27.29, 19.18, 19.11, 18.81, 18.19, 18.00. HRMS (+ESI) m/z: найдено M 783.3979; вычислено для C₃₈H₅₅N₈O₁₀⁺, [M + H]⁺ 783.403.

H-Tyr-D-Ala-Phe(4-NO₂)-Glu-Val-Val-Gly-NH₂ гидрохлорид (II). Суммарный выход 214 мг (55%). Время удерживания 15.26 мин. Спектр ¹Н-ЯМР (298 K): 0.78–0.88 (м, 12H, Val⁵СH₃γ и Val⁶СH₃γ), 0.71 (д, J 7.02, 1H, ala²СH₃β), 1.78 (м, 1H, Glu⁴СH₂β), 1.83 (м, 1H, Glu⁴СH₂β), 1.96 (м, 1H, Val⁶СH₃β), 1.97 (м, 1H, Val⁵СH₃β), 2.06–2.22 (м, 2H, Glu⁴СH₂γ), 2.55 (дд, J 7.98, 13.50, 1H, Tyr¹СH₂β), 2.80 (дд, J 5.94, 13.58, 1H, Tyr¹СH₂β), 2.89 (дд, J 10.08, 13.50, 1H, Phe(4-NO₂)³СH₂β), 3.17 (дд, J 3.66, 13.56, 1H, Phe(4-NO₂)³СH₂β), 3.53 (м, 1H, Tyr¹СHα), 3.59 (дд, J 5.58, 16.74, 1H, Gly⁷СH₂α), 3.66 (дд, J 6.01, 16.72, 1H, Gly⁷СH₂α), 4.09 (ψт, J 7.50, 1H, Val⁶СHα), 4.17–4.26 (м, 3H, ala²СHα, Glu⁴СHα и Val⁵СHα), 4.63 (ддд, J 3.96, 9.42, 9.97, 1H, Phe(4-NO₂)³СHα), 6.65 (д, J 8.46, 2H, Tyr¹Ar), 6.99 (д, J 8.50, 2H, Tyr¹Ar), 7.02 (уш. с, 1H, Gly⁷NH₂), 7.18 (уш. с, 1H, Gly⁷NH₂), 7.49 (д, J 8.70, 2H, Phe(4-NO₂)³Ar), 7.81 (д, J 8.70, 1H, Val⁵NHα), 7.89 (д, J 8.16, 1H, Val⁶NHα), 8.06–8.16 (м, 3H, Phe(4-NO₂)³Ar и Gly⁷NHα), 8.22 (д, J 8.46, 1H, Phe(4-NO₂)³NHα), 8.26 (д, J 6.42, 1H, ala²NHα), 8.63 (д, J 6.65, 1H, Glu⁴NHα), 9.30 (уш. с, 1H, Tyr¹OH). Спектр ¹³C-ЯМР (298 K): 174.60, 172.34, 171.79, 170.91, 170.85, 170.51, 170.16, 155.77, 146.16, 145.93, 130.50, 129.99, 127.61, 122.87, 114.90, 58.09, 57.55, 55.44, 52.99, 52.63, 47.89, 41.71, 37.18, 30.85, 30.23, 29.97, 27.08, 19.06, 19.00, 18.08, 17.90. HRMS (+ESI) m/z: найдено M 828.3820; вычислено для C₃₈H₅₄N₉O₁₂⁺, [M + H⁺] 828.3886.

H-Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-Ser-NH₂ гидрохлорид (III). Суммарный выход 214 мг (56%). Время удерживания 14.42 мин. Спектр ¹Н-ЯМР (298 K): 0.71 (д, J 6.96, 1H, ala²СH₃β), 0.79–0.89 (м, 12H, Val⁵СH³γ и Val⁶СH₃γ), 1.76 (м, 1H, Glu⁴СH₂β), 1.88 (м, 1H, Glu⁴СH₂β), 1.89–2.05 (м, 2H, Val⁵СH₃β и Val⁶СH₃β), 2.23 (м, 2H, Glu⁴СH₂γ), 2.66 (дд, J 11.40, 13.74, 1H, Phe³СH₂β), 2.81 (м, 2H, Tyr¹СH₂β), 3.03 (дд, J 3.30, 13.74, 1H, Phe³СH₂β), 3.50 (дд, J 5.52, 10.68, 1H, Ser⁷СH₂β), 3.56 (дд, J 5.52, 10.62, 1H, Ser⁷СH₂β), 3.95 (ψт, J 7.26, 1H, Tyr¹СHα), 4.17–4.23 (м, 2H, Val⁶СHα и Ser⁷СH₂α), 4.25 (дд, J 7.08, 10.92, 1H, Val⁵СHα), 4.31 (м, 1H, Glu⁴СHα), 4.35 (м, 1H, ala²СHα), 4.59 (ддд, J 3.41, 8.47, 11.12, 1H, Phe³СHα), 4.82 (уш. с, 1H, Ser⁷OH), 6.67 (д, J 8.52, 2H, Tyr¹Ar), 6.98 (д, J 8.51, 2H, Tyr¹Ar), 7.06 (уш. с, 1H, Ser⁷NH₂), 7.15–7.28 (м, 6H, Phe³Ar и Ser⁷NH₂), 7.74 (д, J 7.92, 1H, Ser⁷NHα), 7.80 (д, J 8.77, 1H, Val⁵NHα), 7.94 (д, J 8.70, 1H, Val⁶NHα), 8.32–8.40 (м, 3H, ala²NHα, Phe³NHα и Glu⁴NHα), 9.30 (с, 1H, Tyr¹OH), 12.14 (уш. с, 1H, Glu⁴СO₂Hγ). Спектр ¹³C-ЯМР (298 K): 173.92, 171.68, 171.17, 171.10, 170.87, 170.80, 170.50, 167.31, 156.45, 137.69, 130.45, 129.24, 127.85, 126.21, 124.75, 115.15, 61.64, 57.72, 57.44, 54.75, 53.34, 51.94, 47.73, 37.91, 36.41, 30.51, 30.28, 30.14, 27.27, 19.21, 19.13, 18.81, 17.99, 17.90. HRMS (+ESI) m/z: найдено M 813.4073; вычислено для C₃₉H₅₇N₈O₁₁⁺, [M + H⁺] 813.4141.

H-Tyr-D-Ala-Phe-Glu-Val-Val-D-Ala-NH₂ гидрохлорид (IV). Суммарный выход 225 мг (60%). Время удерживания 15.36 мин. Спектр ¹Н-ЯМР (298 K): 0.78–0.91 (м, 15H, ala²СH₃β и Val⁵СH₃γ и Val⁶СH₃γ), 1.18 (д, J 7.14, 1H, ala⁷СH³β), 1.77 (м, 1H, Glu⁴СH₂β), 1.85 (м, 1H, Glu⁴СH₂β), 1.91–2.01 (м, 2H, Val⁵СH₃β и Val⁶СH₃β), 2.17 (м, 2H, Glu⁴СH₂γ), 2.53 (м, 1H, Tyr¹СH₂β), 2.72 (дд, J 10.80, 13.68, 1H, Phe³СH₂β), 2.81 (дд, J 5.46, 13.62, 1H, Tyr¹СH₂β), 3.06 (дд, J 3.24, 13.68, 1H, Phe³СH₂β), 3.48 (м, 1H, Tyr¹СHα), 4.05 (ψт, J 7.62, 1H, Val⁶СHα), 4.15–4.28 (м, 4H, ala²СHα, Glu⁴СHα, Val⁵СHα и ala⁷СHα), 4.51 (м, 1H, Phe³СHα), 6.64 (д, J 8.40, 2H, Tyr¹Ar), 6.97 (д, J 8.41, 2H, Tyr¹Ar), 6.98 (уш. с, 1H, ala⁷NH₂), 7.12–7.27 (м, 6H, Phe³Ar и ala⁷NH₂), 7.76 (д, J 8.64, 1H, Val⁵NHα), 7.93 (д, J 8.05, 1H, Val⁶NHα), 8.04 (д, J 7.80, 1H, ala⁷NHα), 8.16–8.26 (м, 2H, ala²NHα и Phe³NHα), 8.56 (д, J 6.54, 1H, Glu⁴NHα). Спектр ¹³C-ЯМР (298 K): 174.92, 174.03, 172.43, 171.82, 171.10, 171.05, 171.01, 170.36, 155.82, 137.76, 130.13, 129.20, 127.91, 127.79, 126.18, 114.96, 58.39, 57.55, 55.54, 53.71, 52.69, 47.79, 37.34, 31.17, 30.36, 29.90, 27.18, 19.14, 19.03, 18.36, 18.27, 18.14, 18.07. HRMS (+ESI) m/z: найдено M 797.4127; вычислено для C₃₉H₅₇N₈O₁₀⁺, [M + H⁺] 797.4192.

Трифлат пиридиния. Выделен из аликвоты фракции В (метод 2) c использованием препаративной ВЭЖХ. Спектр ¹Н-ЯМР (298 K, D₂O-H₂O): 7.99 (ψт, J 6.97, 2H, PyH-3), 8.54 (тт, J 1.35, 7.95, 1H, PyH-4), 8.69 (д, J 5.66, 2H, PyH-2). Спектр ¹³C-ЯМР (298 K, D₂O-H₂O): 147.14, 141.17, 127.41, 119.58 (к, J 316.84).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При использовании сильных кислот Льюиса в качестве альтернативы безводному фтористому водороду процесс выделения гидрофобных пептидов может иметь трудности при применении стандартного подхода. В качестве альтернативы предложен и успешно опробован на примере пептида дельторфина II и трех его аналогов способ, в котором смесь кислот нейтрализуют пиридином, а полученную смесь солей и целевого пептида хроматографируют на сорбенте LH-20 либо сразу, либо после предварительной лиофилизации избытка солей пиридиния с водяным паром.

Разработанные методы выделения и очистки могут найти применение в выделении других гидрофобных пептидов в случае, когда стандартный способ непродуктивен.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы признательны к.ф.-м.н. А.К. Сурину (Институт белка РАН) за помощь в регистрации масс-спектров высокого разрешения.

Авторы выражают благодарность инженеру А.И. Поляковой (ФИБХ РАН) за осуществление масштабирования процессов разделения пептидов.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант 23-65-10017). Исследование стабильности 4-нитрофенилаланина в условиях ацидолиза выполнено в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (№ FFEU-2024-0056).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.