Non-agglomerated oligonucleotide-containing nanocomposites based on titanium dioxide nanoparticles

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Фрагменты нуклеиновых кислот (НК) и их аналоги рассматриваются как перспективные агенты для избирательного воздействия на внутриклеточный генетический материал. Для широкого использования в терапии необходимы эффективные методы доставки препаратов на основе нуклеиновых кислот. Известно, что олигонуклеотиды (ODN, фрагменты НК) обладают очень низкой эффективностью проникновения, в первую очередь из-за гидрофобной природы плазматической мембраны клеток. Преодоление этого барьера позволит использовать препараты НК при лечении различных заболеваний, связанных с появлением в организме чужеродных или поврежденных нуклеиновых кислот. Для создания эффективных систем доставки фрагментов нуклеиновых кислот применяют различные методы, например, включение в липосомы, конъюгацию с полимерами различной природы и т.д. [1]. Стремительно развивающаяся нанобиотехнология внесла свой вклад в решение проблемы доставки НК с использованием широкого спектра наночастиц [2–4]. Одно из преимуществ использования для доставки НК-фрагментов наночастиц – их способность защищать НК от действия внутриклеточных нуклеаз [2, 3].

Наночастицы диоксида титана привлекают внимание как потенциальные носители фрагментов НК благодаря способности проникать через плазматическую мембрану, стабильности и возможности модификации поверхности для иммобилизации различных соединений [5–8]. Показано, что TiO₂-наночастицы защищают иммобилизованные на них олигонуклеотиды от деградации в клеточной среде [9–10].

Известно, что наночастицы, в частности наночастицы диоксида титана, имеют склонность к агломерации [11–14], что ограничивает их применение в биологических системах. Стабильность и монодисперсность – важные характеристики наночастиц и нанокомпозитов, которые обеспечивают надежность их применения in vitro или in vivo и воспроизводимость результатов.

Целью данной работы было получение неагломерированных олигонуклеотид-содержащих нанокомпозитов на основе наночастиц диоксида титана в форме анатаза (Ans~ODN) для воздействия на внутриклеточные нуклеиновые кислоты-мишени.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение нанокомпозитов Ans~ODN. ODN-содержащие нанокомпозиты на основе наночастиц диоксида титана в кристаллической форме анатаза готовили двумя способами [15, 16]: 1) нанокомпозит Ans/PL•ODN с ионной связью между ODN и PL (полилизином) синтезировали путем иммобилизации ODN на наночастицах, предварительно связанных с PL; 2) нанокомпозит Ans/PL-ODN с ковалентной связью между PL и ODN получали при иммобилизации на наночастицах анатаза предварительно синтезированного конъюгата PL-ODN.

Ранее нанокомпозиты Ans/PL•ODN и Ans/PL-ODN готовили в солевых растворах (0.9% NaCl). Полученные таким образом нанокомпозиты проявляли высокую противовирусную активность в отношении разных субтипов вируса гриппа А in vitro [17–19] и in vivo [9, 20] и эффективно корректировали гипертензию на модели крыс НИСАГ (крыс с наследуемой индуцируемой стрессом артериальной гипертензией) [21].

Влияние NaCl на агломерацию наночастиц и нанокомпозитов. Для характеристики наночастиц анатаза и нанокомпозитов на их основе использовали метод динамического светорассеяния (ДСР), который позволяет оценить размер и поверхностный заряд наночастиц. На первом этапе мы показали влияние NaCl на агломерацию наночастиц и нанокомпозитов (табл. 1). Размер нанокомпозитов Ans/PL•ODN, образованных после электростатического присоединения ODN к наночастицам, предварительно покрытым полилизином, незначительно отличается от размера нанокомпозитов Ans/PL-ODN с ковалентной связью между PL и ODN, поэтому в табл. 1 и 2 приведены усредненные значения для обоих типов нанокомпозитов, обозначенных как Ans~ODN.

 

Таблица 1. Гидродинамический диаметр (d) и величина индекса полидисперсности (pdi) исследованных образцов в зависимости от концентрации NaCl

Образец	Параметр	Концентрация NaCl, М
		0	0.01	0.02	0.05	0.1	0.2
Ans	d, нм	22.2 ± 9.2	73.1 ± 16.8	2087 ± 164	2534 ± 405	3360 ± 904	–
	pdi	0.237 ± 0.009	0.609 ± 0.042	0.409 ± 0.036	0.439 ± 0.091	0.449 ± 0.055	–
Ans/PL	d, нм	27.5 ± 1.8	27.2 ± 1.4	28.4 ± 1.0	50.9 ± 15.4	110 ± 43.3	2229 ± 569
	pdi	0.250 ± 0.004	0.313 ± 0.009	0.319 ± 0.010	0.348 ± 0.030	0.530 ± 0.038	0.338 ± 0.058
Ans~ODN1	d, нм	28.0 ± 3.8	32.7 ± 2.6	34.5 ± 7.9	33.3± 7.9	827 ± 193	2625 ± 265
	pdi	0.286 ± 0.041	0.353 ± 0.012	0.388 ± 0.001	0.395 ± 0.001	0.319 ± 0.098	0.295 ± 0.035

Примечание: поскольку значения показателей для нанокомпозитов Ans/PL•ODN и Ans/PL-ODN с ионной или с ковалентной связью между PL и ODN незначительно отличаются, в таблице приведены усредненные значения для обоих типов нанокомпозитов, обозначенных как Ans~ODN.

 

Таблица 2. Гидродинамический диаметр (d) и ξ-потенциал исследованных образцов в воде

№	Образец	d, нм	pdi	ξ-потенциал, мВ
1	Ans	21.1 ± 2.5	0.371 ± 0.017	–30.6 ± 0.5
2	Ans/PL	28.6 ± 2.0	0.239 ± 0.012	53.2 ± 0.2
3	Ans~ODN1 (21-мер)	32.8 ± 0.6	0.282 ± 0.065	30.4 ± 0.2
4	Ans~ODN2 (33-мер)	37.4 ± 10.0	0.257 ± 0.062	11.4 ± 0.6
5	PL-ODN1 (21-мер)	70.0 ± 2.6	0.166 ± 0.018	57.6 ± 0.9
6	PL-ODN2 (33-мер)	75.2 ± 10.5	0.208 ± 0.017	–

 

Состояние наночастиц Ans зависит от концентрации соли, и уже при 0.02 М NaCl частицы образуют скопления размером до микрометров. Наличие на наночастицах иммобилизованных PL и ODN предотвращает их агломерацию до концентрации NaCl 0.05 M. При увеличении концентрации NaCl в смеси появляются частицы разного размера, т.е. образец становится более гетерогенным, что отражается на увеличении индекса гетерогенности или полидисперсности (pdi) (табл. 1; данные для нанокомпозита с участием ODN₁ приведены в качестве примера). Индекс полидисперсности (pdi) отражает возможное присутствие агрегатов. Значение pdi для монодисперсных образцов не должно превышать 0.5 [22]. Принимая во внимание значения pdi и размер частиц, образец Ans удовлетворяет критериям качества только в отсутствие NaCl. Подобное влияние NaCl на агломерацию наночастиц анатаза отмечено в работе [23]. Образцы Ans/PL и Ans~ODN₁ удовлетворяют критериям качества в диапазоне концентраций NaCl 0–0.05 M.

При получении нанокомпозитов Ans/PL•ODN и Ans/PL-ODN в 0.9% растворе NaCl образуются агломераты наночастиц с размерами до микрометров. Мы попытались решить проблему агломерации путем иммобилизации конъюгатов PL-ODN на наночастицах Ans или ODN на Ans/PL в водных растворах. При этом следовало показать возможность иммобилизации олигонуклеотидов на наночастицах, т.е. формирования нанокомпозитов, в отсутствие NaCl.

Оценка размера и ξ-потенциала наночастиц и нанокомпозитов. Иммобилизацию олигонуклеотидов в воде на наночастицах Ans исследовали методом ДСР. Были измерены гидродинамические диаметры (d) исходных наночастиц Ans, конъюгатов PL-ODN и нанокомпозитов после иммобилизации PL-ODN на Ans или ODN на Ans/PL (табл. 2). Гидродинамический диаметр исходных наночастиц в воде составлял ~20 нм. После связывания с PL размер наночастиц увеличивался до 28.6 нм, а после связывания с конъюгатом PL-ODN – до 32.8 и 37.4 нм, в зависимости от длины олигонуклеотида (табл. 2).

Интересно отметить, что размер нанокомпозитов Ans/PL-ODN меньше, чем размер конъюгатов PL-ODN (рис. 1), что может быть обусловлено преобразованием рыхлой структуры конгломератов PL-ODN в более компактную при “обволакивании” наночастицы.

 

Рис. 1. Схема образования нанокомпозитов Ans/PL-ODN.

 

Значения pdi в табл. 2 для наночастиц анатаза и нанокомпозитов на их основе свидетельствуют об относительной монодисперсности образцов. По данным ДСР полученные результаты удовлетворяют критериям качества для каждого образца (Results meet quality criteria according to size quality report).

Мы проверили, насколько стабильны частицы Ans и нанокомпозиты на их основе при длительном хранении в воде при 4°C. На рис. 2 приведены данные для Ans, Ans/PL и Ans/PL-ODN. Размер наночастиц Ans несколько увеличился через три месяца с ~20 до ~28 нм, т.е. эти наночастицы имеют тенденцию к агломерации, однако в значительно меньшей степени по сравнению с таковой в солевых растворах (табл. 1). В отличие от наночастиц Ans, нанокомпозиты Ans/PL и Ans/PL-ODN за этот период не изменили свой гидродинамический диаметр и дисперсность, вероятно, из-за того, что слой PL или PL-ODN предотвращает агломерацию. Аналогичный эффект наблюдался в работе [24] при защите наночастиц Ans белковыми слоями. Следует отметить, что замораживание суспензий наночастиц и нанокомпозитов на основе анатаза приводит к их заметной агломерации (размеры увеличиваются до 400–600 нм).

 

Рис. 2. Распределение частиц по размерам по данным ДСР через 1–2 ч (а) и через 3 месяца (б) после приготовления образцов. 1 – Ans, 2 – Ans/PL, 3 – Ans/PL-ODN. Концентрация частиц и нанокомпозитов – 0.1 мг/мл в расчете на Ans.

 

Присоединение PL и PL-содержащих олигонуклеотидных конъюгатов в основном обусловлено электростатическим взаимодействием положительно заряженных аминогрупп с отрицательно заряженной поверхностью Ans при нейтральном рН [8]. Это предположение подтверждается значениями ξ-потенциала исследуемых образцов (табл. 2). Величины ξ-потенциала изменяются с отрицательных на положительные значения, когда исходные наночастицы Ans связывают PL (ср. строки 1 и 2) или PL-ODN (ср. строки 1 и 3 или 4), причем в первом случае (присоединение PL) это изменение более выражено, чем в случае присоединения PL-ODN, т.к. отрицательно заряженные межнуклеотидные фосфатные группы олигонуклеотида вносят свой вклад в суммарный заряд нанокомпозита (уменьшают “положительное” влияние PL). Разница между величинами ξ-потенциала для нанокомпозитов, содержащих ODN₁ (21-мер) и ODN₂ (33-мер) (табл. 2, строки 3 и 4) объясняется большим вкладом отрицательного заряда более протяженного олигонуклеотида, что приводит к уменьшению положительного заряда на частицах в случае 33-мера. Уменьшение положительного заряда нанокомпозита An/PL-ODN₁ по сравнению с PL-ODN₁ (табл. 2, строки 3 и 5) можно объяснить вкладом отрицательно заряженных наночастиц.

Данные о размерах и значениях ξ-потенциала нанокомпозитов Ans/PL•ODN по сравнению с данными для исходных наночастиц Ans и конъюгатов Ans/PL однозначно показывают, что эти нанокомпозиты могут быть сформированы в водном растворе в отсутствие NaCl, т.е. PL и ODN могут успешно связываться, соответственно, с наночастицами Ans и Ans/PL в водных растворах.

Исследование наночастиц и нанокомпозитов методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Исследование наночастиц методом ПЭМ позволяет определить их форму и физические размеры, а таже визуализировать их пространственную организацию. В образцах водной суспензии наночастиц Ans наблюдаются округлые частицы (2.5–4.0 нм) средней или высокой электронной плотности (4.0–6.5 нм) (рис. 3а). Основную долю составляют первые, организованные в “цепочки” и “веточки”, лежащие на сеточке по отдельности или в виде рыхлых скоплений разного размера. “Цепочки” частиц иногда замыкались в замкнутые округлые профили (рис. 3а). Подобная организация округлых частиц Ans в цепочки была показана методом сканирующей электронной микроскопии [25]. Электронно-плотные частицы располагались случайным образом. Следует отметить, что практически все наночастицы Ans были организованы в рыхлые скопления, отдельные частицы наблюдались крайне редко; аналогичная картина была отмечена во всех препаратах водных суспензий. Округлые электронно-плотные структуры (7– 10 нм) встречались в образцах водной суспензии наночастиц Ans (рис. 3а, врезка), а также во всех остальных образцах частиц в водной суспензии.

 

Рис. 3. Ультраструктура суспензий наночастиц Ans, Ans/PL и Ans/PL•ODN, полученных методом ПЭМ: (а) – водная суспензия наночастиц Ans. На врезке – частицы средней электронной плотности, округлая электронно-плотная частица показана стрелкой; (б) и (в) – водные суспензии наночастиц Ans/PL и Ans/PL•ODN. Звездочками показаны полости замкнутых округлых профилей. Участки плотного расположения наночастиц выделены окружностями; (г) – суспензия наночастиц Ans в 0.9%-ном растворе NaCl. На врезке представлен увеличенный участок скопления, видны “склеенные” частицы; (д) и (е) – суспензии наночастиц Ans/PL и Ans/PL•ODN. Сорбция суспензии на сеточку. Длина масштабных отрезков – 100 нм.

 

В водной суспензии структура и размеры наночастиц Ans/PL не отличались от структуры исходных наночастиц Ans, однако несколько менялась пространственная организация их скоплений: наряду с “цепочками” и “веточками” появились многочисленные электронно-плотные локусы, в которых наночастицы плотно прилегали друг к другу (рис. 3б). Формирование локусов указывает на изменения поверхностных свойств наночастиц Ans при обработке полилизином, приводящие к их неупорядоченному “слипанию”.

Добавление олигонуклеотида не привело к заметным изменениям морфологии наночастиц Ans/PL•ODN в водной суспензии по сравнению с наночастицами Ans/PL. В рыхлых скоплениях наночастиц Ans/PL•ODN заметно возрастала доля электронно-плотных локусов по сравнению с наночастицами Ans/PL (рис. 3в).

Полученные результаты показывают выраженное сродство наночастиц Ans друг к другу: в свежеприготовленной водной суспензии они объединяются в разветвленные линейные структуры, формирующие рыхлые скопления. Модификация Ans полилизином приводит к уплотнению скоплений за счет неупорядоченного “слипания” наночастиц, формирующих электронно-плотные локусы. Визуально величина скоплений уменьшается по сравнению с исходными наночастицами Ans. Модификация олигонуклеотидом наночастиц Ans/PL усиливает их связывание друг с другом, что отражается на пространственной организации их скоплений, в которых возрастает доля “плотных” локусов и сокращается длина линейных компонентов.

В отличие от водной суспензии, в 0.9%-ном растворе NaCl наночастицы Ans формировали плотные комковатые скопления различного размера и формы (рис. 3г). Отдельные наночастицы и “цепочки” наночастиц просматривались лишь на периферии скоплений. Структура скоплений наночастиц Ans/PL и Ans/PL•ODN в 0.9%-ном растворе NaCl визуально не отличалась от наблюдаемой в образцах наночастиц Ans: модифицированные наночастицы формировали плотные комковатые скопления различного размера и формы (рис. 3г–е).

Инкубация водных суспензий наночастиц Ans, Ans/PL и Ans/PL•ODN в течение суток при 4°С не привела к заметным изменениям морфологии наночастиц, характера сорбции на сеточку и пространственной организации скоплений. Суспензия содержала рыхлые разветвленные скопления разного размера, “цепочки” и “веточки” наночастиц Ans, как и свежеприготовленные образцы. Морфология скоплений наночастиц Ans, Ans/PL и Ans/PL•ODN через 24 ч инкубации в 0.9%-ном растворе NaCl при 4°С также заметно не изменялась по сравнению со свежеприготовленными образцами.

Таким образом, результаты ПЭМ иллюстрируют связывание наночастиц анатаза с полилизином и олигонуклеотидом, а также показывают различия между суспензиями наночастиц и нанокомпозитов в воде и в растворе NaCl.

Противовирусная активность нанокомпозитов в отношении ВПГ-1. Мы сравнили биологическую активность нанокомпозитов, полученных в воде и 0.9%-ном NaCl, на примере ингибирования репликации вируса простого герпеса первого типа в зараженных клетках VERO. В качестве действующего агента в составе нанокомпозитов мы использовали олигонуклеотид GCCGAGGTCCATGTCGTACGC (ODN₁), направленный на определенный участок генома вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1), а именно на сайт инициации трансляции мРНК белка UL13 [26].

Нанокомпозит Ans/PL•ODN₁ подавлял репликацию ВПГ-1 на 4.5 порядка независимо от способа приготовления (в воде или в 0.9% NaCl), если он был использован через сутки после получения (табл. 3). Через 10 суток хранения активность образца Ans/PL•ODN₁, приготовленного в солевом растворе, была на два порядка ниже, чем у сохранившего свою активность образца, приготовленного в воде.

 

Таблица 3. Противовирусная активность образцов Ans/PL•ODN в клетках VERO, зараженных ВПГ-1

Образец	Способ приготовления	ИПП вируса, lg
Ans/PL•ODN1	H2O, сутки	4.5
	0.9% NaCl, сутки	4.5
	H2O, 10 суток	4.5
	0.9% NaCl, 10 суток	2.5

Примечание: ИПП – индекс подавления продукции вируса; ИПП = Титр вируса в контроле – Титр вируса в опыте (lg).

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез наночастиц. Наночастицы TiO₂ в кристаллической форме (анатаз) (Ans) синтезировали, как описано в работе [15]. Ans получали добавлением смеси тетраизопропоксида титана и 2-изопропанола (6 : 1, v/v) в водный раствор HNO₃ при интенсивном перемешивании, соблюдая соотношение [H⁺] : [Ti] = 0.5 и [H₂O] : [Ti] = 200. Золь перемешивали в течение 7 ч при 70°C и затем охлаждали до комнатной температуры. Затем золь диализовали против воды при 3–4°C до рН 3.3–3.5, разбавляли раствор до концентрации 5 мг/мл, добавляли равный объем изопропилглицидилового эфира и 0.2 М водный раствор LiOH до рН 7.2. Полученную реакционную смесь диализовали против воды.

Синтез олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды синтезировали амидофосфитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-800 (Биоссет, Россия) из синтонов (Glen Research, США). В работе использовали следующие олигонуклеотиды: ODN₁ 5'-GCCGAGGTCCATGTCGTACGCp (21-мер), ODN₂ 5'-gaaaTaagaGGCTA-GCTACAACGAccTTcaTTap (33-мер). Концентрацию олигонуклеотидов и их конъюгатов с полилизином определяли по оптическому поглощению на 260 нм, измеренному на спектрофотометре U-1800 (Shimadzu, Япония).

Синтез нанокомпозитов Ans/PL, Ans/PL-ODN и Ans/PL•ODN. В работе использовали поли-L-лизин гидробромид (PL, MW 15000– 30000, Sigma-Aldrich, США). Полилизин-содержащие олигонуклеотиды (PL-ODN) синтезированы, как описано в работе [27], с использованием растворенного в воде полилизина при молярном отношении аминогрупп в полилизине к олигонуклеотиду 100 : 1. Конъюгаты PL-ODN диализовали против воды для удаления остаточных количеств диметилсульфоксида и непрореагировавших олигонуклеотидов. Водные растворы PL-ODN (50–80 мМ) хранили при 4°C перед использованием.

Ans/PL получали, как описано в работе [15], добавляя 20 мкл 0.1 М водного раствора полилизина (в расчете на мономерное звено) к 1 мл суспензии наночастиц (1 мг). Таким образом, при полном связывании полилизина с наночастицами емкость препарата Ans/PL по аминогруппам составляла 2 мкмоль/мг.

Нанокомпозиты Ans/PL-ODN получали, как описано в работе [16], смешивая суспензию наночастиц Ans (0.1 мг) в 100 мкл воды c 10 мкл 0.1 мМ раствора PL-ODN. Нанокомпозиты Ans/PL•ODN получали, как описано в работе [16], при смешивании наночастиц, покрытых полилизином (Ans/PL) (0.1 мг по Ans-наночастицам, 2 мкмоль/мг по NH₂-группам), с ODN (10 мкл 0.1 мМ) в 100 мкл воды или 140 мМ раствора NaCl. Емкость нанокомпозитов по олигонуклеотиду составляла 20 нмоль/мг в обоих случаях.

Все манипуляции с наночастицами и нанокомпозитами проводили после обработки ультразвуком (90 Вт, 25°С) в течение 30 с.

Размер частиц и значения ξ-потенциала. Размер (гидродинамический диаметр, d) и ξ-потенциал исследуемых образцов измеряли методами динамического рассеяния света и фазового анализа рассеяния света на приборе Zetasizer Nano ZS Plus (Malvern, Великобритания) в водной среде. Ans, Ans/PL, Ans/PL-ODN и Ans/PL•ODN использовали в концентрации 0.1 мг/мл в расчете на наночастицы с содержанием полилизина 2 мкмоль/мг и олигонуклеотидов 20 нмоль/мг. Значения ξ-потенциала образцов измеряли с использованием кюветы DTS1070. Каждый образец готовили по меньшей мере в трех экземплярах, измерения каждого из них проводили в трех повторах при комнатной температуре. Значения размера частиц и ξ-потенциала усредняли по этим экспериментам. Влияние соли на агломерацию наночастиц и нанокомпозитов исследовали, добавляя к суспензии 1 М раствор NaCl до соответствующей концентрации соли (50– 100 мМ). Результаты представлены в табл. 1 и 2.

Противовирусная активность нанокомпозитов. Противовирусную активность образцов изучали на клетках VERO (ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор” Роспотребнадзора, Россия), инфицированных вирусом простого герпеса 1-го типа (ВПГ-1) штамма VR-3 в “профилактическом” режиме. Титры ВПГ-1 в вируссодержащей жидкости (ВСЖ) в контроле (без образца) и опыте (с образцом) рассчитывали и выражали в десятичных логарифмах 50% тканевых цитопатических доз в мл (lg ТЦД₅₀/мл) по методу Спирмена–Кербера [28]. Клетки VERO в логарифмической фазе (10⁵ кл./мл) высевали в питательной среде DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), содержащей 10%-ную фетальную телячью сыворотку (Gibco, США), в 96-луночные планшеты (100 мкл/лунка) и инкубировали при 37°С, 5% CO₂ и влажности 100%. После достижения ~80% монослоя среду удаляли, в лунки добавляли исследуемые образцы Ans/PL•ODN (5 мкМ по ODN) в 100 мкл среды DMEM, содержащей 2%-ную фетальную телячью сыворотку. В качестве контроля использовали 100 мкл среды DMEM. Клетки инкубировали при 37°С, 5% CO₂ и влажности 100% в течение 4 ч с последующим добавлением раствора ВПГ-1, множественность инфицирования 0.001 ТЦД₅₀/кл. (тканевая цитопатическая доза вируса, вызывающая гибель 50% клеток). Клетки инкубировали в течение 48 ч в тех же условиях.

Вирус-ингибирующий эффект исследуемых образцов рассчитывали по формуле: ИПП = Титр вируса в контроле – Титр вируса в опыте (lg). В контрольном образце значение титра вируса было равно 7.0 ± 0.3 lg ТЦД₅₀/мл.

Электронная микроскопия. Свежеприготовленные суспензии Ans, Ans/PL и Ans/PL•ODN (0.1 мг/мл в расчете на Ans; 2 мкмоль PL и 20 нмоль ODN на 1 мг Ans) в воде или 0.9%-ном растворе NaCl, а также суспензии этих частиц после инкубации в течение 24 ч при 4°С, обрабатывали ультразвуком (90 Вт, 25°С) в течение 30 с. Cуспензии каждого образца (10 мкл) сорбировали на медные сетки с формваровой подложкой в течение 30 с, избыток жидкости удаляли фильтровальной бумагой, сетки высушивали на воздухе. Препараты изучали в просвечивающем электронном микроскопе Jem-1400 (Jeol, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Образцы изучали при аппаратном увеличении микроскопа 50–150 тыс. раз. Снимки получали с помощью цифровой камеры бокового ввода Veleta (SIS, Германия). Ультраструктуры суспензий приведены на рис. 3.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получены неагломерированные олигонуклеотид-содержащие нанокомпозиты на основе наночастиц анатаза (Ans/PL•ODN, и Ans/PL-ODN). При иммобилизации олигонуклеотидов на наночастицах в воде образуются монодисперсные частицы небольшого размера, в то время как в присутствии NaCl происходит агломерация наночастиц и нанокомпозитов. Исследование биологической активности нанокомпозитов на примере подавления репликации вируса простого герпеса первого типа показало, что нанокомпозит Ans/PL•ODN₁, полученный в воде, проявил высокую противогерпетическую активность в культуре клеток (подавление репликации ВПГ-1 на 4.5 порядка), которая сохранялась по крайней мере в течение 10 суток. Активность того же нанокомпозита, полученного в солевом растворе, уменьшалась на два порядка за это время. Таким образом, продемонстрировано, что полученные нанокомпозиты могут храниться в воде при 4°C в течение длительного времени без падения их эффективности. Это упрощает и расширяет возможность применения предложенных нанокомпозитов в качестве биологически активных агентов.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 23-24-00184).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Автор АСЛ руководитель. Авторы МНР, ОЮМ, ЕИФ, НАМ, ЮЕП, ЕИР и ВФЗ внесли равный вклад в исследование и подготовку текста статьи.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ

Данные, подтверждающие выводы настоящего ис-следования, можно получить у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

About the authors

M. N. Repkova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, prosp. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090

O. Y. Mazurkov

FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

E. I. Filippova

FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

N. A. Mazurkova

FBRI State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, Koltsovo, Novosibirsk region, 630559

Yu. E. Poletaeva

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, prosp. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090

E. I. Ryabchikova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, prosp. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090

B. F. Zarytova

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, prosp. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090

A. S. Levina

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: asl1032@yandex.ru
Russian Federation, prosp. Lavrent’eva 8, Novosibirsk, 630090

References

Supplementary files