Synthesis of peptide fragments spike glycoprotein SARS-CoV-2 and studying their binding with human blood cells

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Пандемия коронавируса вызвала повышенный интерес ученых разных стран к поиску новых безопасных вакцин. С 2020 г. только против COVID-19 исследуется >800 вакцин. Всего 13 вакцин включены в список ВОЗ для использования в чрезвычайных ситуациях. Эти вакцины одобрены, разрешены, лицензированы, им выдано разрешение на использование в чрезвычайных ситуациях или предоставлено право использования вне клинических испытаний каким-либо образом регулирующим органом, национальным органом или другой организацией. По состоянию на март 2023 г. 50 вакцин получили одобрение ВОЗ, 183 вакцины – кандидаты, из них около трети (59 или 32%) – белковые субъединичные вакцины. Из 199 вакцин, находящихся на стадии доклинических исследований, 76 (38%) – белковые субъединичные. Таким образом, в настоящее время разработка вакцин на основе белковых платформ представляется перспективной.

Традиционная разработка вакцины может занимать до 15 лет, начиная с фазы открытия, во время которой разрабатываются вакцины и проводятся предварительные доклинические исследования. Доклиническая стадия длится от 1.5 до 2.5 лет и довольно избирательна. Клинические испытания проходят менее 20% вакцин-кандидатов. Некоторые исследования терпят неудачу вследствие неэффективности продукта, другие прекращаются из-за отсутствия финансирования. Следующий этап испытаний вакцины – тестирование на людях, включающее получение одобрения FDA (США) и EMA (Европа), эти испытания проводят на десятках (I фаза), сотнях (II фаза) и тысячах добровольцев (III и IV фазы). Поскольку цель состоит в том, чтобы определить эффективную дозу вакцины и, что более важно, минимизировать побочные эффекты, всегда предпочтительнее проводить испытания на небольших выборках. Если вакцина-кандидат успешно проходит III фазу испытаний, подается заявление на получение лицензии на вакцину, которое рассматривается регулирующими органами, и вакцина лицензируется. После этого начинается серийное производство лицензированной вакцины и проводится серия постмаркетинговых исследований [1, 2]. Кроме того, подходы in silico могут быть использованы для разработки вакцин за счет более быстрого скрининга и более точного прогнозирования последовательностей аминокислот с высокой иммуногенностью и аффинностью к молекулам HLA I и II классов. Эти вычислительные подходы могут предсказать аффинность специфических пептидных последовательностей к молекулам HLA I и II классов, к рецепторам В-клеток. Антигенность, аллергенность, физико-химические параметры, а также вторичная и третичная структура этих белков точно предсказываются in silico.

Вакцины на основе пептидов в настоящее время разрабатываются для использования как в качестве терапевтического, так и профилактического средства при множестве заболеваний, начиная от рака и вирусных инфекций, заканчивая аллергией и болезнью Альцгеймера. Учитывая, что только специфические аминокислотные последовательности полноразмерных белковых антигенов ответственны за эффективные иммунные ответы, для вакцин предлагаются иммуногенные пептиды, имитирующие В- и Т-клеточные эпитопы [3].

Можно выделить четыре основных преимущества вакцин на основе пептидов: 1) крупномасштабный синтез пептидов относительно недорог, а технология хорошо отработана; 2) пептиды могут складываться в трехмерные эпитопы, способные индуцировать гуморальный ответ на линейные и конформационные структуры; 3) уникальные эпитопы могут быть выбраны, чтобы избежать аутоиммунных ответов, которые могут быть вызваны полноразмерным белком; 4) новые эпитопы могут быть легко добавлены к смеси пептидов по мере выявления новых вирусных мутаций [4].

Антитела после введения белковой субъединичной (пептидной) вакцины могут вообще не появиться. Вакцинация только эпитопами Т-клеток подходит как для профилактической, так и для терапевтической вакцинации – может помочь быстрее выздороветь. Не следует ожидать, что вакцина из Т-клеточных эпитопов предотвратит инфицирование, как традиционные вакцины, которые стимулируют появление нейтрализующих антител. Индукция Т-клеток против нескольких разных белков обеспечивает защиту от вирусных мутаций, как обсуждалось применительно к вирусу гриппа. В случае еще неизвестных вариантов SARS-CoV-2 этот тип вакцины также может быть эффективным [5–8].

До пандемии COVID-19 ~500 пептидных вакцин против различных заболеваний не достигли IV фазы испытаний. Большинство пептидных вакцин в клинических испытаниях были направлены против различных видов рака, далее следуют вирусные инфекции, аллергии и аутоиммунные заболевания. Конечной их целью заявлялась разработка безопасной, воспроизводимой и генетически стабильной вакцины, которая способна вызывать соответствующий иммунный ответ. Стоит отметить, что существует несколько вакцин против COVID-19 на основе пептидов: ЭпиВакКорона (ФБНУ “Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”, Россия; одобрена ВОЗ и разрешена для применения в других странах), UB-612 (United Biomedical Inc., США; III фаза испытаний), CoVepiT (OSE Immunotherapeutics, Франция; I фаза испытаний), B-pVAC-SARS-CoV-2 (University Hospital Tuebingen, Германия; II фаза испытаний). Эксперименты для проверки активности пептидов in vivo проводились как непосредственно после биоинформационных исследований, так и с лабораторным этапом in vitro.

В связи с вышесказанным, разработка новых белковых вакцин против COVID-19 представляется актуальной задачей.

Целью данной работы был синтез пептидов Lys-Ile-Ala-Asp-Tyr-Asn-Tyr-Lys-Leu (IX) (417– 425 а.о.) и Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Asn-Gly-Gln-Thr (XVIII) (407–415 а.о.) – фрагментов поверхностного гликопротеина Spike коронавируса SARS-CoV-2 – как потенциальных компонентов вакцины против COVID-19 и изучение их связывания с клетками крови человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез пептидов (IX) и (XVIII). Синтез пептида (IX) осуществляли по схеме 1, используя тактику максимальной защиты боковых функциональных групп аминокислот.

 

Схема 1. Синтез пептида (IX).

 

Гексапептид (V) получали последовательным наращиванием пептидной цепи, начиная с С-конца, лейцин вводили в реакцию в виде п-нитрофенилового эфира, который конденсировали с BocLys(N^ε-Z)-ОН. В качестве основного конденсирующего агента использовали DIPC с добавлением HOBt. Для блокирования α-аминогрупп применяли Вос-защитную группу. Ее отщепление проводили обработкой 4.5 М раствором HCl в этилацетате. Гидрохлориды пептидов после отщепления Вос-защитной группы, которое протекало с выходами, близким к количественным (93– 98%), использовали в синтезе после определения их однородности методом тонкослойной хроматографии. Полной характеризации гидрохлоридов не проводили, т.к. кислотный гидролиз Вос-группы протекает, как правило, без рацемизации и изменения структуры пептидной цепи [9].

N-Концевой трипептид (VII) получали методом активированных эфиров, причем Boc-Lys(N^ε-Z)-OSu и Boc-Ile-OSu вводили в реакцию, отфильтровав осадок дициклогексилмочевины, что позволило сократить время и количество растворителей на выделение эфиров. Нанопептид (VIII) получали с использованием карбодиимидного метода. Защиту с боковых функциональных групп аминокислот удаляли гидрированием пептида над катализатором (палладиевой чернью) в растворе уксусной кислоты.

Для синтеза пептида (XVIII) была предложена схема 2. С-Концевой пентапептид (XIII) получали конденсацией трипептида (XI) и дипептида Boc-Ala-Pro-OH (XII). Последний получали методом активированных эфиров с использованием Boc-Ala-OSu, который вводили в реакцию без выделения. N-Концевой тетрапептид (XVI) получали путем сшивки двух дипептидов, Boc-Val-Arg(NO₂)ОН и HCl∙H-Gln-Ile-OH, также полученных с использованием активированных эфиров.

 

Схема 2. Синтез пептида (XVIII).

 

Целевые пептиды до снятия защит боковых функциональных групп подвергали очистке методом колоночной хроматографии на сефадексе G-10. Как видно из схемы 2, для защиты боковой гуанидиновой группы аргинина использовали водородолабильную нитрогруппу, которую также удаляли пропусканием тока водорода через раствор пептида в уксусной кислоте в присутствии палладиевого катализатора в течение 8 ч.

Идентификацию соединений на всех стадиях синтеза выполняли методом масс-спектрометрии, гомогенность подтверждали хроматографическими методами.

Пептиды, меченные FITC (FITC-Val-Arg-Gln-Ile-Ala-Pro-Gly-Gln-Thr-OMe, FITC-Lys-Ile-Ala-Asp-Tyr-Asn-Tyr-Lys-Leu-OH), получали путем биоконъюгации одной молекулы FITC с молекулой пептида DMF в течение 4 ч.

Влияние пептидов (IX) и (XVIII) на лейкоциты. Влияние пептидов (IX) и (XVIII) на лейкоциты крови исследовали методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител против молекул, которые экспрессируются на лейкоцитах (CD45), отвечают за раннюю активацию лимфоцитов (CD69) и базофилов (CD203c, CD63), на 80 образцах венозной крови добровольцев, средний возраст которых составил 26.9 ± 9.4 года. Для пептида (IX) концентрация полуингибирования (IC₅₀) для HLA 02 : 01 составила 16.0 нМ, а для пептида (XVIII) – 4.5 мкМ.

Трансмембранная протеинтирозинфосфатаза CD45 – ключевой регулятор передачи сигналов антигенных рецепторов в T- и B-клетках. CD45 имеет высокий уровень экспрессии во всех клонах кроветворных клеток на всех стадиях развития. Функционально CD45 подавляет клеточную пролиферацию, опосредованную IL-3, эритропоэтин-зависимый гемопоэз и противовирусные ответы in vitro и in vivo [10].

CD69 – антиген очень ранней активации, экспрессия которого на поверхности лейкоцитов и тромбоцитов быстро повышается при активации вирусами. CD69 вовлечен в передачу сигнала на начальных этапах активации, может быть использован для характеристики напряженности иммунитета. CD69 – интегральный мембранный белок II типа с внеклеточным лектиновым доменом C-типа. Это самый ранний гликопротеин, экспрессируемый на поверхности клеток при активации Т-, В- и NK-клеток in vitro. CD69 конститутивно экспрессируется на субпопуляциях тимоцитов и тромбоцитов, плазмоцитоидных дендритных клеток и клеток-предшественников [11], его активация запускает каскад внутриклеточных процессов, связанных с представленными ниже молекулами.

CD203c (ENPP3, эктонуклеотидпирофосфатаза/фосфодиэстераза) экспрессируется на клетках многих органов, в том числе на эпителии, особенно на базофилах и тучных клетках. Функция этого фермента состоит в подавлении АТФ-зависимого воспаления. Базофилы и тучные клетки участвуют в реакции на определенные патогены, а также на острые и хронические воспалительные и аллергические процессы. CD203c можно использовать как для идентификации, так и в качестве активационного маркера. Его экспрессия на базофилах быстро увеличивается при манипуляциях с клетками или во время стимуляции базофилов без дегрануляции [12].

Антиген CD63 обнаруживается на поверхности моноцитов/макрофагов и слабо экспрессируется покоящимися гранулоцитами, Т-лимфоцитами и В-лимфоцитами. Антиген CD63 присутствует в азурофильных гранулах нестимулированных нейтрофилов, экспрессируется на поверхности нейтрофилов и базофилов после активации [13].

Для подтверждения активации лимфоцитов синтезированными пептидами (IX) и (XVIII) было взято за основу определение содержания гамма-интерферона (IFN-γ), который применяется в различных вариациях [14, 15]. IFN-γ представляет собой цитокин, играющий важную роль в различных биологических реакциях, включая защиту от инфекций, противоопухолевое действие и регуляцию эффекторных клеток как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Он способствует усилению презентации антигена молекулами главного комплекса гистосовместимости, дифференцировке клеток, стимуляции фагоцитов, координации взаимодействий лейкоцитов и эндотелия, влияет на клеточную пролиферацию и апоптоз, а также на стимуляцию и подавление различных генов. IFN-γ регулирует дифференцировку, активацию и гомеостаз лимфоцитов, активацию М1-подтипа макрофагов, индуцирует рекрутирование эффекторных клеток при различных видах воспаления. Он рассматривается как ключевое звено между врожденным и адаптивным иммунным ответом и как главный переключатель каскада цитокинов [16].

Анализ полученных данных показал, что большее количество нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов после суточной инкубации реагировало на пептид (XVIII), нежели на пептид (IX). Напротив, лейкоциты в целом и эозинофилы в частности реагировали на пептид (IX) в большей степени за короткое время в сравнении с пептидом (XVIII). Следует учесть, что за сутки инкубирования часть клеток становилась нежизнеспособной, и пептид (XVIII) активировал большее количество базофилов и лимфоцитов на 35.00 и 25.92% соответственно. Анализ показал, что количество лимфоцитов (CD45), моноцитов (CD45), эозинофилов (CD45) и активированных базофилов (CD203с⁺) достоверно отличалось (р ˂ 0.05) при взаимодействии с данными пептидами. Для нейтрофилов (CD45) и активированных лимфоцитов (CD69⁺) достоверных отличий при активации пептидами (IX) и (XVIII) не выявлено (р ˂ 0.05). Таким образом, мы выяснили, что существуют достоверные различия между ответом лейкоцитов на пептиды: лимфоциты (CD45) и моноциты (CD45) прореагировали с пептидом (XVIII) в большем количестве, чем с пептидом (IX). В случае эозинофилов (CD45) пептид (XVIII) активировал достоверно большее количество базофилов (CD203с⁺), в отличие от пептида (IX). В табл. 1 отражены медианные значения количества клеток, отмечены достоверные отличия.

 

Таблица 1. Количество клеток, отреагировавших на пептиды (IX) и (XVIII) (в расчете на 30 000 клеток)

Тип клеток и количество наблюдений (n) для пептидов (IX)/(XVIII)	Количество клеток, ответивших на пептиды (IX)/(XVIII) соответственно
Лейкоциты всего (CD45), n = 70/54, из них:	233.0 (71.0–761.0)/175.0 (80.0–380.0)
лимфоциты (CD45), n = 20/51	1.0 (1.0–2.5)/12.0 (6.0–22.0)*
моноциты (CD45), n = 37/50	2.0 (1.0–4.0)/6.0 (3.0–11.8)*
нейтрофилы (CD45), n = 70/54	32.0 (21.0–100.0)/75.0 (20.0–141.5)
эозинофилы (CD45), n = 70/54	25.0 (8.0–85.0)/15.0 (6.0–29.0)*
Активированные лимфоциты CD69+, n = 78	65.0 (31.5–117.5)/92.0 (35.3–145.0)
Активированные базофилы CD203с+, n = 77	9.0 (3.0–25.5)/16.0 (5.0–32.0)*

Примечание: данные представлены в виде средних значений, в скобках указан интерквартильный размах в виде 25 и 75 процентилей.

* Статистически значимые отличия (p < 0.05).

 

При анализе методом ИФА содержания IFN-γ, который был секретирован лимфоцитами в ответ на пептиды, был выявлен рост значений при использовании пептида (IX) в отличие от пептида (XVIII) (табл. 2). Таким образом, показано, что пептид (IX) достоверно активировал лимфоциты посредством секреции ими IFN-γ.

 

Таблица 2. Анализ содержания IFN-γ, секретированного лимфоцитами в ответ на активацию пептидами (IX) и (XVIII)

Активация пептидами	Средняя концентрация IFN-γ, пг/мл (n = 51)
(IX)	7.98*
(XVIII)	5.54*

* Статистически значимые отличия (p < 0.05).

 

Всесторонние исследования in vivo показали, что длинные пептиды способствуют более качественному Т-клеточному ответу, но, с другой стороны, они сильно зависят от процессинга и могут быть представлены только профессиональными антиген-презентирующими клетками. При анализе информации о вакцинах-кандидатах и вакцинах, одобренных к применению, отмечено, что не менее трети из них представляют собой белковые субъединичные (в т.ч. пептидные) препараты, что поддерживает идею создания пептидной вакцины. Первый шаг в этом направлении – подтверждение гипотезы об активации лимфоцитов короткими пептидами.

Показано, что используемые в данной работе пептиды достоверно взаимодействуют с лейкоцитами. Пептид (IX) продемонстрировал достоверное влияние на эозинофилы, в отличие от пептида (XVIII). Нами показана достоверная активация базофилов (CD203с⁺), а также лимфоцитов (CD69⁺) пептидом (XVIII) в большей степени, чем пептидом (IX) (табл. 3), причем рост содержания IFN-γ у активированных лимфоцитов характерен для последнего соединения. Вне зависимости от HLA-A-фенотипа добровольцев, пептиды могли взаимодействовать с лейкоцитами, что говорит об их универсальности. Стоит отметить, что отсутствие ответа или слабый ответ на пептид мог быть обусловлен иным HLA-A-фенотипом добровольцев. Пептид (XVIII) после суточной инкубации активировал клетки врожденного иммунитета (базофилы) и клетки адаптивного иммунитета (лимфоциты) чаще, чем пептид (IX), за короткий срок инкубации. Наличие хронических заболеваний достоверно повлияло на активацию лимфоцитов. Для усовершенствования протокола исследований стоит уменьшить время инкубации с пептидами до 2 ч.

 

Таблица 3. Результаты анкетирования и связь с активированными лейкоцитами

Категории	Количество респондентов (n), ответивших утвердительно, %	Активированные лимфоциты (CD69+) и базофилы (CD203с+)
Хронические заболевания	n =15 или 18.8% (95% ДИ: 10.2–27.3%)	Статистически значимо (р ˂ 0.05) для лимфоцитов, активированных пептидом (IX)
В течение 14 дней до забора крови
Стресс	n = 27 или 33.8% (95% ДИ: 23.4–44.1%)	Статистически не значимо (р > 0.05) для лимфоцитов и базофилов, активированных пептидом (IX)
Физические нагрузки выше среднего	n = 26 или 32.5% (95% ДИ: 22.2–42.8%)
Прием лекарственных средств	n = 12 или 15.0% (ДИ: 7.2–22.8%)
Двухразовое питание	n = 23 или 28.8% (ДИ: 18.8–38.7%)
Трехразовое питание и более 3 раз в день	n = 57 или 71.3% (ДИ: 61.3–81.2%)
Контакт с инфекционными больными	n = 15 или 18.8% (ДИ: 10.2–27.3%)

Примечание: данные представлены в виде количества и процента респондентов, ответивших утвердительно, в скобках указан доверительный интервал (ДИ).

 

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтез пептидов. В работе были использованы аминокислоты, реагенты и растворители (Novabiochem, Германия; Tokyo Chemical Industry, Япония, США; Экос-1, Россия). Процессы синтеза соединений, удаления защитных групп контролировали методом ТСХ на пластинках с закрепленным слоем силикагеля (Sorbfil, Россия) в системах растворителей: этилацетат/пиридин/уксусная кислота/вода (5 : 3 : 2 : 1) (А); хлороформ/метанол/25%-ный раствор аммиака (6 : 4 : 1) (Б); бутанол/уксусная кислота/вода (4 : 1 : 1) (В). Вещества обнаруживали на пластинках с помощью хлор-бензидинового реагента.

N-Концевую трет-бутильную защиту удаляли 4.5 н. раствором хлороводорода в этилацетате. Выходы в реакциях деблокирования были близки к количественным.

Аналитическую ВЭЖХ и масс-спектрометрию (ионизация распылением в электрическом поле (ESI MS) в режиме сканирования положительных ионов) проводили на хроматографе Agilent 1200 с масс-селективным детектором типа тройной квадруполь Agilent 6140 (США), колонка Agilent ZorbaxSBC18 RR (2.1 × 30 мм), размер частиц 3.5 мкм. Использовали градиент концентраций ацетонитрила 10–95% в 0.05%-ном растворе муравьиной кислоты в деионизированной воде.

Температуры плавления определяли на приборе Кофлера и не корректировали. Удельное вращение соединений измеряли на автоматическом поляриметре Hanon Р850 Pro (Китай) при λ = 589.3 м, длина кюветы 100 мм.

Boc-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (I). К раствору 1.23 г (2.8 ммоль) п-толуолсульфоната п-нитрофенилового эфира лейцина в 3.5 мл DMF добавляли 0.55 мл (3.3 ммоль) DIPEA. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин, затем добавляли 1.07 г (2.8 ммоль) Boc-Lys(N^ε-Z)-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд последовательно добавляли 0.4 г (3.0 ммоль) HOBt и 0.7 г (3.4 ммоль) DCC. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°С и 4 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывали, промывали на фильтре 1 мл DMF. В фильтрат добавляли 10 мл этилацетата, полученный раствор промывали 9%-ным раствором лимонной кислоты, 5%-ным раствором NaHCO₃, насыщенным раствором NaCl, водой, затем сушили над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. После сушки в эксикаторе получили 1.4 г (81%) пептида (I) с т. пл. 96–98°С; [α]²⁵_D –21.877 ± 0.225° (с 0.00308 г/мл, MeOH), R_f 0.82 (А), 0.78 (В). ESI MS, m/z: 615.7 [M + H]⁺, 637.7 [M + Na]⁺, 659.7 [M – Н + 2Na]⁺.

Boc-Tyr(OBzl)-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (II). К раствору 1.2 г (2.2 ммоль) HCl∙H-Lys-(N^ε-Z)-Leu-ONp (получен обработкой соединения (I) HCl в этилацетате) в 4.5 мл DMF добавляли 0.39 мл (2.8 ммоль) TEA. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и вносили 0.82 г (2.2 ммоль) Boc-Tyr(OBzl)-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд последовательно добавляли 0.31 г (2.3 ммоль) HOBt и 0.41 мл (2.6 ммоль) DIPC. Время прохождения реакции – 12 ч. Очистку и выделение трипептида проводили по методике, описанной для соединения (I). Выход соединения (II) составил 1.45 г (76%) c т. пл. 93°С; [α]²⁵_D –7.792 ± 0.0° (с 0.00308 г/мл, MeOH), R_f 0.90 (А). ESI MS, m/z: 868.9 [M + H]⁺, 1758.8 [2M + Na]⁺.

Boc-Asn-Tyr(OBzl)-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (III). К раствору 1.21 г (1.5 ммоль) HCl∙H-Tyr(OBzl)-Lys-(N^ε-Z)-Leu-ONp (получен обработкой соединения (II) HCl в этилацетате) в 4 мл DMF добавляли 0.26 мл (1.9 ммоль) TEA. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и вносили 0.4 г (1.7 ммоль) Boc-Asn-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд последовательно добавляли 0.22 г (1.6 ммоль) HOBt и 0.28 мл (1.8 ммоль) DIPC. Время прохождения реакции – 8 ч. Очистку и выделение тетрапептида проводили по методике, описанной для соединения (I). Выход соединения (III) составил 1.15 г (78%) c т. пл. 81–82°С; [α]²⁵_D –38.561 ± 0.242° (с 0.00196 г/мл, MeOH), R_f 0.88 (А), R_f 0.79 (Б). ESI MS, m/z: 983.1 [M + H]⁺, 1005.1 [M + Na]⁺, 2010.0 [2M + 2Na]⁺.

Boc-Tyr(OBzl)-Asn-Tyr(OBzl)-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (IV). К раствору 1.02 г (1.1 ммоль) HCl∙H-Asn-Tyr(OBzl)-Lys-(N^ε-Z)-Leu-ONp (получен обработкой соединения (II) HCl в этилацетате) в 4 мл DMF добавляли 0.26 мл (1.9 ммоль) TEA. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и вносили 0.4 г (1.7 ммоль) Boc-Asn-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд добавляли последовательно 0.22 г (1.6 ммоль) HOBt и 0.28 мл (1.8 ммоль) DIPC. Время прохождения реакции – 8 ч. Очистку и выделение пентапептида проводили по методике, описанной для соединения (I). Выход соединения (IV) составил 1.15 г (78%) c т. пл. 97–102°С; [α]²⁵_D –5.069 ± 0.537° (с 0.0032, MeOH), R_f 0.88 (А), R_f 0.79 (Б). ESI MS, m/z: 1236.2 [M + H]⁺, 1258.3 [M + Na]⁺.

Boc-Asp(OBzl)-Tyr(OBzl)-Asn-Tyr(OBzl)-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (V). К раствору 0.9 г (1 ммоль) HCl∙Tyr(OBzl)-Asn-Tyr(OBzl)-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (получен обработкой соединения (IV) HCl в этилацетате) в 3.5 мл DMF добавляли 0.18 мл (1.3 ммоль) TEA. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и вносили 0.39 г (1.2 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд последовательно добавляли 0.15 г (1.1 ммоль) HOBt и 0.19 мл (1.2 ммоль) DIPC. Время прохождения реакции – 8 ч. Обработку реакционной смеси проводили по методике, описанной для соединения (I). Выход соединения (V) составил 0.8 г (67%) c т. пл. 94–96°С; [α]²⁵_D –12.356 ± 0.123° (с 0.00467 г/мл, MeOH), R_f 0.63 (А). ESI MS, m/z: 1141.7 [M + H]⁺, 1462.7 [M – Н + Na]⁺, 2927.2 [2M + 2Na]⁺.

Boc-Ile-Ala-OH (VI). К раствору 0.48 г (5 ммоль) аланина в 3 мл воды добавляли Boc-Ile-OSu, полученный без выделения в диоксане из 1.15 г (5.0 ммоль) Boc-Ile-ОН при добавлении 0.59 г (5.1 ммоль) HOSu и 1.07 г (5.2 ммоль) DCC. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч, затем диоксан упаривали в вакууме, а остаток подкисляли 9%-ным раствором лимонной кислоты до pH 5. Продукт трижды экстрагировали этилацетатом, (3 × 5 мл), сушили этилацетатные вытяжки над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. Получили 1.13 г (74%) маслообразного соединения (VI) c т. пл. 127–128°С; [α]²⁵_D –32.739 ± 0.854° (с 0.0092 г/мл, MeOH), R_f 0.93 (А). ESI MS, m/z: 303.3 [M + H]⁺, 324.3 [M – Н + Na]⁺, 627.7 [2M + Na]⁺.

Boc-Lys(N^ε-Z)-Ile-Ala-OH (VII). К раствору 0.65 г (2.7 ммоль) HCl∙H-Ile-Ala-OH (получен обработкой соединения (VI) HCl в этилацетате) в 2 мл DMF добавляли 0.42 мл (3.5 ммоль) TEA. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и вносили Boc-Lys(N^ε-Z)-OSu, полученный без выделения в диоксане из 1.22 г (3.2 ммоль) Boc-Ile-ОН при добавлении 0.44 г (3.8 ммоль) HOSu и 0.8 г (3.9 ммоль) DCC. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч, затем диоксан упаривали в вакууме, а остаток подкисляли 9%-ным раствором лимонной кислоты до pH 5. Продукт трижды экстрагировали этилацетатом (3 × 5 мл), сушили этилацетатные вытяжки над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. Получили 1.13 г (74%) маслообразного соединения (VII) с т. пл. 82–83°С [α]²⁵_D –6.545 ± 0.17° (с 0.0044 г/мл, MeOH), R_f 0.94 (А), R_f 0.83 (Б). ESI MS, m/z: 565.7 [M + H]⁺, 587.7 [M + Na]⁺.

Boc-Lys(N^ε-Z)-Ile-Ala-Asp(OBzl)-Tyr(OBzl)-Asn-Tyr(OBzl)-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (VIII). К раствору 0.56 г (0.4 ммоль) HCl∙H-Asp(OBzl)-Tyr(OBzl)-Asn-Tyr(OBzl)-Lys(N^ε-Z)-Leu-ONp (получен обработкой соединения (V) HCl в этилацетате) в 3 мл смеси DMF/СH₂Cl₂ в соотношении 1 : 1 добавляли 0.06 мл (0.5 ммоль) TEA. Перемешивали реакционную смесь в течение 20 мин и вносили 0.23 г (0.4 ммоль) Boc-Lys(N^ε-Z)-Ile-Ala-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд прибавляли последовательно 0.05 г (0.4 ммоль) HOBt и 0.08 мл (0.5 ммоль) DIPC. После окончания реакции (6 ч) осадок отфильтровывали, промывали на фильтре 0.5 мл DMF. В фильтрат добавляли 15 мл диэтилового эфира, выпавший осадок переосаждали из метанола эфиром. Очистку соединения проводили методом колоночной хроматографии на сефадексе G-10 (0.02–0.045 мм), используя в качестве элюента смесь хлороформ/метанол/вода в соотношении 20 : 24 : 1. Фракции, содержащие чистый пептид, объединяли и упаривали. После сушки в эксикаторе получили 0.39 г (60%) соединения (VIII) с т. пл. 121–122°С; [α]²⁵_D –24.667 ± 0.228° (с 0.003 г/мл, уксусная кислота), R_f 0.85 (А), 0.80 (В). По данным ВЭЖХ содержание целевого соединения (VIII) составило 98%. ESI MS, m/z: 1942.8 [M + H]⁺, 1964.7 [M + Na]⁺, 1986.9 [M – Н + 2Na]⁺.

HCl∙H-Lys-Ile-Ala-Asp-Tyr-Asn-Tyr-Lys-Leu-OH (IX). Через раствор 0.16 г (0.1 ммоль) соединения (VIII) в смеси 1 мл уксусной кислоты и 2 мл метанола пропускали в течение 5 ч ток водорода в присутствии катализатора – 2.5 мг палладиевой черни – при постоянном перемешивании. После деблокирования пептида (контроль ТСХ) катализатор отделяли фильтрованием, фильтрат упаривали, а к остатку добавляли 1 мл этилацетата и 1.7 мл 4.5 М раствора HCl в этилацетате. Перемешивали взвесь в течение 45 мин, растворитель упаривали, а остаток промывали этилацетатом, эфиром, сушили в эксикаторе над NaOH. Выход соединения (IX) составил 0.109 г (94%), т. пл. 230–232°С; [α]²⁵_D –2.043 ± 0.138° (с 0.0102 г/мл, вода), R_f 0.31 (Б). По данным ВЭЖХ содержание целевого пептида (IX) составило 96%. ESI MS, m/z: 1164.9 [M + H]⁺, 1185.9 [M – Н + Na]⁺, 2291.3 [2M – НCl]⁺.

Boc-Gln-Thr-OMe (X). К раствору 1.00 г (5.9 ммоль) хлоргидрата метилового эфира треонина в 4 мл DMF добавляли 2.5 г (5.9 ммоль) дициклогексиламмонийной соли Вос-Gln-OH. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин, после охлаждения до 0°С в реакционный сосуд последовательно добавляли 0.84 г (6.2 ммоль) HOBt и 1.1 мл (7.1 ммоль) DIPC. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при 0°С и 6 ч при комнатной температуре, осадок отфильтровывали, промывали на фильтре 1 мл DMF. В фильтрат добавляли 12 мл этилацетата и полученный раствор промывали 9%-ным раствором лимонной кислоты, 5%-ным раствором NaHCO₃, насыщенным раствором NaCl, водой, затем сушили над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. После сушки в эксикаторе получили 1.81 г (85%) пептида (I) с т. пл. 65–67°С; [α]²⁵_D –12.333 ± 0.972° (с 0.0012 г/мл, MeOH), R_f 0.98 (А), 0.88 (Б). Масс-спектр ESI, m/z: 362.22 [M + H]⁺, 383.21 [M – Н + Na]⁺, 406.21 [M – H + 2Na]⁺.

Boc-Gly-Gln-Thr-OMe (XI). К раствору 1.34 г (4.5 ммоль) HCl∙H-Gln-Thr-OMe (получен обработкой соединения (X) HCl в этилацетате) в 5.5 мл DMF добавляли 0.71 мл (5.8 ммоль) TEA. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и вносили 0.85 г (4.5 ммоль) Boc-Gly-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд последовательно добавляли 0.63 г (4.7 ммоль) HOBt и 0.84 мл (5.4 ммоль) DIPC. Время прохождения реакции – 6 ч. Обработку синтеза проводили по методике, описанной для соединения (I). Выход соединения (XI) составил 1.75 г (83%); [α]²⁵_D –10.386 ± 0.653° (с 0.0015 г/мл, MeOH), R_f 0.91 (Б), 0.95 (А). ESI MS, m/z: 469.8 [M + H]⁺, 490.8 [M – Н + Na]⁺, 960.6 [2M + Na]⁺.

Boc-Ala-Pro-OH (XII). К раствору 0.48 г (4.2 ммоль) пролина в 3 мл воды добавляли Boc-Ala-OSu, полученный без выделения в диоксане из 1 г (5.3 ммоль) Boc-Ala-ОН при добавлении 0.72 г (6.3 ммоль) HOSu и 1.31 г (6.3 ммоль) DCC. Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч, затем диоксан упаривали в вакууме, а остаток подкисляли 9%-ным раствором лимонной кислоты до pH 5. Продукт трижды экстрагировали этилацетатом (3 × 5 мл), сушили этилацетатные вытяжки над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. Получили 1.1 г (73%) соединения (XII) в виде масла [α]²⁵_D –16.160 ± 0.196° (с 0.00574 г/мл, MeOH), R_f 0.86 (А). ESI MS, m/z: 287.2 [M + H]⁺, 574.4 [2M + H]⁺.

Boc-Ala-Pro-Gly-Gln-Thr-OMe (XIII). К раствору 0.81 г (2.0 ммоль) HCl∙H-Gly-Gln-Thr-OMe (получен обработкой соединения (XI) HCl в этилацетате) в 3.5 мл DMF вносили 0.43 мл (2.6 ммоль) DIPEA. Перемешивали реакционную смесь в течение 20 мин, поскольку добавление данного количества основания не привело к нужному значению pH 8–9 в реакционной смеси, добавляли еще 0.3 мл DIPEA, затем вносили 0.56 г (2.0 ммоль) Boc-Ala-Pro-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд последовательно добавляли 0.28 г (2.1 ммоль) HOBt и 0.37 мл (2.4 ммоль) DIPC. После окончания реакции (8 ч) осадок отфильтровывали, промывали на фильтре 0.5 мл DMF. В фильтрат добавляли 12 мл этилацетата и полученный раствор промывали 9%-ным раствором лимонной кислоты, 5%-ным раствором NaHCO₃, насыщенным раствором NaCl, водой, затем сушили над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. После сушки в эксикаторе получили 0.89 г (66%) пептида (XIII) с т. пл. 87–89°С; [α]²⁵_D –25.765 ± 0.115° (с 0.00345 г/мл, MeOH), R_f 0.86 (А), 0.73 (В). ESI MS, m/z: 674.1 [M + H]⁺, 696.2 [M + Na]⁺,1347.1 [2M + H]⁺.

Boc-Val-Arg(NO₂)-OH (XIV). Нитроаргинин в количестве 0.83 г (3.8 ммоль) растворяли в 3 мл 1 н. NaOH, добавляли Boc-Val-OSu, полученный без выделения в диоксане из 1.01 г (5.0 ммоль) Boc-Val-ОН при добавлении 0.63 г (5.5 ммоль) HOSu и 1.23 г (6.0 ммоль) DCC. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч, затем диоксан упаривали в вакууме, а остаток подкисляли 9%-ным раствором лимонной кислоты до pH 5. Продукт трижды экстрагировали этилацетатом (3 × 5 мл), сушили этилацетатные вытяжки над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. Получили 0.63 г (75%) соединения (XIV) c т. пл. 69–70°С; [α]²⁵_D –17.735 ± 0.146^о (с 0.00642 г/мл, MeOH), R_f 0.78 (А). ESI MS, m/z: 464.5 [M + 2Na]⁺.

Boc-Gln-Ile-OH (XV). Изолейцин в количестве 0.43 г (3.3 ммоль) растворяли в 3 мл 1 н. NaOH, добавляли Boc-Gln-OSu, полученный без выделения в диоксане из 1 г (4.1 ммоль) Boc-Gln-ОН при добавлении 0.56 г (4.9 ммоль) HOSu и 1.01 г (4.9 ммоль) DCC. Реакционную смесь перемешивали в течение 8 ч, затем диоксан упаривали в вакууме, а остаток подкисляли 9%-ным раствором лимонной кислоты до pH 5. Продукт трижды экстрагировали этилацетатом (3 × 5 мл), сушили этилацетатные вытяжки над Na₂SO₄. После сушки этилацетат упаривали, а образовавшийся остаток растирали с петролейным эфиром и сушили над Р₂О₅. Получили 0.83 г (70%) соединения (XV) c т. пл. 123–129°С; [α]²⁵_D –16.224 ± 0.383° (с 0.00196 г/мл, MeOH), R_f 0.75 (А), R_f 0.82 (Б). ESI MS, m/z: 381.3 [M – H + Na]⁺.

Boc-Val-Arg(NO₂)-Gln-Ile-OH (XVI). К раствору 0.6 г (2.0 ммоль) HCl∙H-Gln-Ile-OH (получен обработкой соединения (XV) HCl в этилацетате) в 3 мл DMF приливали 0.36 мл (2.6 ммоль) ТЕА. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и добавляли Boc-Val-Arg(NO₂)-OSu (получен без выделения в DMF из 0.97 г (2.3 ммоль) соединения (XIV) при добавлении 0.31 г (2.7 ммоль) HOSu и 0.56 г (2.7 ммоль) DCC). Реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч, осадок отфильтровывали. В фильтрат добавляли 20 мл диэтилового эфира. После двукратного переосаждения из метанола диэтиловым эфиром и сушки в вакууме над Р₂О₅ получили 0.9 г (68%) (XVI) c т. пл. 120–122°С; [α]²⁵_D –10.569 ± 0.087° (с 0.00562 г/мл, MeOH), R_f 0.75 (А), R_f 0.86 (Б). ESI MS, m/z: 682.3 [M – H + Na]⁺, 703.4 [M – 2H + 2Na]⁺.

Boc-Val-Arg(NO₂)-Gln-Ile-Ala-Pro-Gly-Gln-Thr-OMe (XVII). К раствору 0.42 г (0.7 ммоль) HCl∙H-Ala-Pro-Gly-Gln-Tyr-OMe (получен обработкой соединения (XIII) HCl в этилацетате) в 2 мл DMF приливали 0.12 мл (0.9 ммоль) ТЕА. Перемешивали реакционную смесь в течение 20 мин и вносили 0.46 г (0.7 ммоль) Boc-Val-Arg(NO₂)-Gln-Ile-OH. После охлаждения до 0°С в реакционный сосуд добавляли последовательно 0.1 г (0.7 ммоль) HOBt и 0.12 мл (0.8 ммоль) DIPC. После окончания реакции (8 ч) осадок отфильтровывали, промывали на фильтре 0.5 мл DMF. В фильтрат добавляли 15 мл диэтилового эфира, выпавший осадок переосаждали из метанола эфиром. Очистку соединения проводили методом колоночной хроматографии на сефадексе G-10 (0.02–0.045 мм), используя в качестве элюента смесь хлороформ/метанол/вода в соотношении 20 : 24 : 1. Фракции, содержащие чистый пептид, объединяли и упаривали. После сушки в эксикаторе получили 0.6 г (71%) соединения (XVII). R_f 0.82 (А). По данным ВЭЖХ содержание целевого соединения (XVII) составляло 98%. ESI MS, m/z: 1216.1 [M + H]⁺, 1237.2 [M – Н + Na]⁺.

HCl∙H-Val-Arg-Gln-Ile-Ala-Pro-Gly-Gln-Thr-OMe (XVIII). Через раствор 0.2 г (0.16 ммоль) соединения (XVII) в 2 мл уксусной кислоты пропускали в течение 8 ч ток водорода в присутствии катализатора (3 мг палладиевой черни) при постоянном перемешивании. После деблокирования пептида (контроль ТСХ) катализатор отделяли фильтрованием, фильтрат упаривали, а к остатку добавляли 1 мл этилацетата и 2.4 мл 4.5 М раствора HCl в этилацетате. Перемешивали взвесь в течение 45 мин, растворитель упаривали, а остаток промывали этилацетатом, эфиром, сушили в эксикаторе над NaOH. Выход соединения (XVIII) составил 0.145 г (81%), R_f 0.40 (Б) c т. пл. 124–126°С; [α]²⁵_D –9.659 ± 0.180° (с 0.00352 г/мл, вода). По данным ВЭЖХ содержание целевого пептида (XVIII) составляло 97%. ESI MS, m/z: 984.8 [M + H – HCl]⁺, 1005.8 [M – Н + Na – HCl]⁺, 2013.5 [2M + 2Na – НCl]⁺.

FITC-Lys-Ile-Ala-Asp-Tyr-Asn-Tyr-Lys-Leu-OH. Соединение (IX) в количестве 0.09 г (0.08 ммоль) растворяли в 2 мл смеси DMF/СH₂Cl₂ в соотношении 1 : 1, добавляли 13.3 мкл (0.1 ммоль) ТЕА, перемешивали в течение 15 мин и вносили 0.031 г (0.08 ммоль) FITC. После окончания реакции (4 ч) осадок отфильтровывали, а к фильтрату добавляли 10 мл диэтилового эфира. Выпавший осадок переосаждали из метанола эфиром, сушили в вакууме над Р₂О₅. Получили 0.12 г флуоресцентно меченого соединения (IX) с количественным выходом.

FITC-Val-Arg-Gln-Ile-Ala-Pro-Gly-Gln-ThrOMe получали аналогичным способом. Соединение (XVIII) в количестве 0.12 г (0.11 ммоль) растворяли в 2 мл смеси DMF/СH₂Cl₂ в соотношении 1 : 1, добавляли 20.9 мкл (0.15 ммоль) ТЕА, перемешивали в течение 15 мин и вносили 0.043 г (0.11 ммоль) FITC. После окончания реакции (4 ч) осадок отфильтровывали, а к фильтрату добавляли 10 мл диэтилового эфира. Выпавший осадок переосаждали из метанола эфиром, сушили в вакууме над Р₂О₅. Получали 0.15 г флуоресцентно меченого соединения (XVIII) с количественным выходом.

Добровольцы. Обследовали 80 добровольцев, чьи образцы венозной крови были собраны в период пандемии COVID-19 в 2020–2021 гг. Участники заполняли ретроспективную анкету, давали добровольное информированное согласие. Вопросы в анкетах касались анамнеза (в том числе по COVID-19), возраста, наличия хронических заболеваний. Переболевшими считались лица с подтвержденным наличием SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки методом ПЦР, что не исключало обследуемых с бессимптомным носительством SARS-CoV-2 в анамнезе. При анализе 80 анкет выявили, что 28 человек переболели COVID-19 за 3–12 месяцев до исследования. Среди обследуемых оказалось 13 женщин (16.25%) и 67 мужчин (83.75%). Получивших две дозы инактивированной вакцины Vero Cell (Sinovac Life Sciences Co., КНР) было трое (3.75%), привитых вакциной Спутник V и Спутник Лайт (ФГБУ “НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи”, Россия) – четыре человека (5%). Среди переболевших COVID-19 вакцинированных не было, наблюдалось бессимптомное течение или острая респираторная инфекция легкой степени тяжести. Средний возраст участников составил 26.9 ± 9.4 года. Осуществляли забор 5 мл венозной крови из кубитальной вены в стеклянную пробирку со 100 мкл гепарина (100 ед.).

Показатели клеточного иммунитета определяли методом проточной цитометрии на приборе Cytomics FC 500 (Beckman Coulter Inc., США) и меченных FITC, R-фикоэритрином (PE), конъюгатом PE-Texas Red (PE–TR) моноклональных антител (Сорбент, Россия).

К 100 мкл цельной гепаринизированной крови добавляли 2.5 мкл водного раствора флуоресцентно меченого пептида в концентрации 1 мл/мл и моноклональные антитела CD45 PE–TR, содержимое перемешивали пипетированием и помещали в темное место при комнатной температуре на 15 мин. Добавляли 500 мкл лизирующего эритроциты раствора OptiLyse C (Beckman Coulter Inc., США) и помещали в термостат (37°С, 10 мин), после чего добавляли 500 мкл буферного раствора и исследовали на проточном цитометре клетки крови в количестве 30 000 клеток (лейкоциты, лимфоциты, моноциты, нейтрофилы и эозинофилы).

К 500 мкл крови добавляли 2.5 мкл водного раствора немеченого пептида в концентрации 1 мл/мл, встряхивали 5 с на шейкере, термостатировали в течение 15 мин при 37°С, добавляли по 2.5 мкл моноклональных антител CD63 FITC, CD203с PE, содержимое перемешивали пипетированием и помещали в темное место при комнатной температуре на 15 мин. Затем добавляли 500 мкл раствора OptiLyse C и помещали в термостат с температурой 37°С на 10 мин, добавляли 500 мкл буферного раствора и исследовали на проточном цитометре 30 000 клеток (активированные базофилы CD203с⁺).

К 100 мкл крови добавляли 2.5 мкл моноклональных антител CD69 FITC и CD45 PE–TR, содержимое перемешивали пипетированием и помещали в темное место при комнатной температуре на 15 мин. Добавляли 500 мкл раствора OptiLyse C и помещали в термостат с температурой 37°С на 10 мин, далее в пробирку вносили 500 мкл буферного раствора и исследовали на проточном цитометре 30 000 клеток (активированные лимфоциты CD69⁺).

К 500 мкл крови добавляли 2.5 мкл водного раствора немеченого пептида в концентрации 1 мл/мл, встряхивали в течение 5 с на шейкере и помещали в термостат на одни сутки. Затем добавляли моноклональные антитела CD45 PE–TR, содержимое перемешивали пипетированием и помещали в темное место при комнатной температуре на 15 мин. Вносили 500 мкл раствора OptiLyse C и помещали в термостат при 37°С на 10 мин, после чего добавляли 500 мкл буферного раствора и исследовали клетки крови на проточном цитометре в количестве 30 000 клеток (лейкоциты, лимфоциты, моноциты, нейтрофилы и эозинофилы). После центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин получали для замораживания надосадочную жидкость, содержащую IFN-γ. В качестве стандартного раствора для определения IFN-γ использовали надосадочную жидкость, полученную при термостатировании в течение суток и центрифугировании при 3000 об/мин в течение 10 мин цельной гепаринизированной крови. Содержание IFN-γ определяли методом иммуноферментного анализа с использованием диагностических тест-систем ЗАО “Вектор-Бест” (Новосибирск, Россия).

Статистический анализ данных проводили с использованием непараметрических критериев Манна–Уитни с использованием программы Statistica 10 (StatSoft Inc., США).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенной работы осуществлен синтез фрагментов поверхностного Spike-белка коронавируса SARS-CoV-2 – Lys-Ile-Ala-Asp-Tyr-Asn-Tyr-Lys-Leu (417–425 а.о.) и Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Asn-Gly-Gln-Thr (407–415 а.о.). На примере данных соединений апробирован метод, позволяющий оценивать влияние коротких пептидов на лейкоциты крови. Показано, что полученные пептиды достоверно взаимодействуют с лейкоцитами, активируя их посредством секреции IFN-γ. Предложенный нами метод оценки влияния коротких пептидов на клетки крови стал первым шагом в разработке новой пептидной вакцины против СOVID-19.

В дальнейших исследованиях мы планируем увеличить количество участников исследования, использовать моноклональные антитела против биомаркера стволовых клеток CD34, исследовать другие синтезированные пептиды иных возбудителей инфекционных заболеваний, а также проанализировать возможный HLA-A-фенотип будущих участников исследования и сопоставить с имеющейся информацией в общедоступной базе биоинформационных данных.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все эксперименты, выполненные в данном исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинской декларации 1964 года и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Программа исследования одобрена Этическим комитетом Витебского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 25.02.2021 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

О. V. Gribovskaya

Institute of Bioorganic Chemistry, National Academy of Sciences of Belarus

Author for correspondence.
Email: olymelnik@yandex.ru
Belarus, ul. Akad. Kuprevicha 5/2, Minsk, 220084

V. V. Yanchenko

Vitebsk State medical University

Email: olymelnik@yandex.ru
Belarus, pr. Frunze 27, Vitebsk, 210023

A. M. Tsygankov

Vitebsk State medical University

Email: olymelnik@yandex.ru
Russian Federation, pr. Frunze 27, Vitebsk, 210023

V. P. Martinovich

Institute of Bioorganic Chemistry, National Academy of Sciences of Belarus

Email: olymelnik@yandex.ru
Russian Federation, ul. Akad. Kuprevicha 5/2, Minsk, 220084

References

Supplementary files