Genetic species concept as applied to multilocus nuclear data

Full Text

ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ КОНЦЕПЦИИ ВИДА

Генетическая концепция вида (ГКВ) прошла длительную эволюцию, и существует множество ее интерпретаций (Bateson, 1909; Taverner, 1920; Muller, 1939; Simpson, 1943; Dobzhansky, 1950; Mayr, 1969; Nei, 1976; Baker, Bickham, 1986; Masters, Spencer, 1989; Avise, Ball, 1990; Mayden, 1997; Schilthuizen, 2000; Butlin, 2005). Основа генетической концепции видов впервые изложена Бейтсоном более 100 лет назад (Bateson, 1909) и получила дальнейшее развитие у Добжанского (Dobzhansky, 1937, 1950) и Мюллера (Muller, 1939). По Добжанскому, вид – это система популяций, генный обмен между которыми ограничен или запрещен из-за репродуктивных изолирующих механизмов или комбинации нескольких таких механизмов. Таким образом, ГКВ Добжанского – это практически изоляционная концепция, так как подчеркивает репродуктивную изолированность видов, чем фактически напоминает концепцию Бейтсона (Bateson, 1909). Позже была предложена модель Бейтсона–Добжанского–Мюллера (Bateson–Dobzhansky–Muller, BDM), согласно которой к образованию двух видов приводит накопление генетических изменений в двух отдельных популяциях (Gavrilets, 2003). Здесь имеется в виду довольно сложная архитектура репродуктивной изоляции, а именно, указание на “несовместимость” аллелей в локусах (Gavrilets, 2003).

В такой интерпретации ГКВ частично совпадает с биологической концепцией вида (БКВ), поскольку скрещивающиеся популяции, которые репродуктивно и генетически не изолированы, считаются конспецифичными, а популяции, репродуктивно и генетически изолированные, – отдельными видами. Эти две концепции расходятся в том случае, когда генетическая изоляция популяций существует, но репродуктивная изоляция отсутствует. В этом случае БКВ в трактовке Добжанского (Dobzhansky, 1937) и Майра (Mayr, 1942), но не Койна и Орра (Coyn, Orr, 2004) должна считать такие популяции конспецифичными, а ГКВ – принадлежащими к разным видам.

Многочисленные примеры гибридизации между видами, известные на сегодня, сильно ослабляют ориентацию исключительно на репродуктивно изолированные популяции. С учетом этого соображения Койн и Орр (Coyn, Orr, 2004) предложили новое определение биологической концепции вида, дополнив ее возможностью гибридизации. С точки зрения этих авторов, ГКВ эквивалентна БКВ или является подмножеством последней.

В приложении к млекопитающим, согласно современной ГКВ, две генетические линии являются видами, если целостность их генофондов сохраняется даже в присутствии потока генов, т. е. защищена (Baker, Bradley, 2006). Таким образом, вид – это совокупность природных популяций, которые генетически совместимы друг с другом, но изолированы от других подобных совокупностей, а видообразование есть аккумуляция генетических изменений между двумя филетическими линиями, что обеспечивает защиту и изоляцию их генофондов (Baker, Bradley, 2006).

Практически в любой интерпретации ГКВ для вывода о репродуктивной изоляции и эволюционной независимости генетических линий предполагается измерение генетических различий (Mayden, 1997). Однако главное критическое замечание в адрес ГКВ состоит в неопределенности величины и единиц измерения генетической изменчивости, необходимой для решения вопроса “вид/подвид”. Таким образом, проведение границы между видовым и внутривидовым уровнем дивергенции по-прежнему остается нерешенной задачей теоретического уровня.

Бэйкер и Брэдли (Baker, Bradley, 2006) предложили операциональный критерий, который состоит в количественной оценке уровня дивергенции геномов через (1) генетические дистанции, (2) анализ потока генов между таксонами, (3) оценку уровня гибридизации, (4) оценку времени дивергенции. Брэдли и Бэйкер (Bradley, Baker, 2001) разработали методику, позволяющую практически реализовать ГКВ в пределах класса млекопитающих. Анализируя генетические дистанции между сестринскими видами в разных группах млекопитающих по митохондриальному гену цитохрома b (cyt b), Брэдли и Бэйкер (Bradley, Baker, 2001) пришли к заключению, что большинство из них отличается на 4–11% нуклеотидных замен, дистанция ≤2% обычна для внутривидового уровня, дистанция ≥10% характеризует сложившиеся виды “…наиболее прагматичным первым шагом является использование порога генетической дистанции в 5% по гену цитохрома b, поскольку во многих случаях адекватная оценка внутривидовой изменчивости не доступна; при этом дистанция ≥5% – это очевидно приблизительная оценка, она не дает окончательного решения” (Baker, Bradley, 2006, p. 657). Хотя эту методологию, как и всю генетическую концепцию, нельзя применять без информации об уровнях генетических дистанций между сестринскими видами в составе определенного таксона, она сделалась полезным инструментом практикующих систематиков.

ПЕРЕХОД К МУЛЬТИЛОКУСНЫМ И ГЕНОМНЫМ ДАННЫМ

Итак, ранее ГКВ в интерпретации Брэдли и Бэйкера (Bradley, Baker, 2001; Baker, Bradley, 2006) предложила подход, который состоит в оценке генетических дистанций и выборе в качестве видового уровня таких различий, которые соответствуют дивергенции между ближайшими таксонами, для которых показано наличие генетической изоляции. Этот количественный, довольно удобный и по-настоящему операциональный критерий тем не менее на практике реализуется только на базе митохондриальных данных, что нередко приводит к ошибкам из-за интрогрессии чужеродной митохондриальной ДНК (мтДНК) вследствие исторической или современной гибридизации. Применение этого критерия к ядерным данным затрудняется меньшей изменчивостью ядерных генов и использованием в разных случаях разных локусов и разного их числа.

Между тем мультилокусный анализ генетического разнообразия – это ключевой подход к современному решению филогенетических, филогеографических и популяционно-генетических задач. В настоящее время общепринятой практикой становится использование данных высокопроизводительного секвенирования, что связано с постепенным исчерпанием возможностей секвенирования сотен отдельных генов по методу Сэнгера, с одной стороны, и накоплением материала по полногеномным или редуцированным геномным данным (например, транскриптомы или маркеры RADSeq) – с другой. Стремительный переход от однолокусных, в том числе митохондриальных, наборов данных к геномным ресурсам поднимает вопрос о том, как из этих новых огромных массивов информации получать представление о структуре филогенетических отношений и о временах дивергенций и как эти данные транслировать в стандартные таксономические ранги. Это означает и необходимость трансформации современной генетической концепции вида.

Адаптация ГКВ к мультилокусному анализу будет означать появление нового операционального критерия вида – мультигенной дистанции. В последнем случае встает важная задача определения минимального объема генетической информации (числа генетических локусов и их информативности), необходимого для получения устойчивого филогенетического сигнала, восстановления порядка кладогенетических событий, верной оценки величины генного потока и в конечном итоге вывода о том, соответствуют ли изучаемые группы видам или внутривидовым категориям. В результате приложения операционального критерия ГКВ к мультигенным ядерным данным должно быть установлено соответствие между уровнем дивергенции по сумме ядерных локусов и уровнем репродуктивной изоляции. В свою очередь, уровень различия ядерных генов должен быть сопоставлен со временем дивергенции и приведен в соответствие с таксономическим рангом. Поскольку количественные критерии ГКВ могут различаться в разных таксономических группах, важно определить диапазон этих различий. Следовательно, мультигенная дистанция и время дивергенции как критерии вида должны представлять собой не точечные значения, а диапазоны дистанций и времен. В рамках практической систематики это должно облегчить принятие таксономических решений в сложных с точки зрения систематики группах и определить ревизию целого ряда проблемных таксонов.

МУЛЬТИГЕННАЯ ДИСТАНЦИЯ И ВРЕМЯ ДИВЕРГЕНЦИИ

Перевод генетической концепции в плоскость времени обуславливает практическую применимость еще одного видового критерия – времени дивергенции.

Использование генетических дистанций для сопоставления ранга таксонов, предложенное Бэйкером и Брэдли (Baker, Bradley, 2006), часто вызывает неприятие. На самом деле, оценка генетических дистанций предлагалась ими только как первая и наиболее прагматическая ступень анализа. Как альтернативу генетическим дистанциям эти авторы рассматривают продолжительность видообразования (“We considered duration of speciation for sister species as an alternative to the 1st step value of genetic distance between sister species for application of the Genetic Species Concept”; Baker, Bradley, 2006, p. 658) и полагают, что настоящим показателем видообразования будет оценка времени, связанного с накоплением генетических изменений, необходимых для формирования изолирующих механизмов.

Таким образом, современная ГКВ оперирует временем, которое необходимо для достижения изоляции. Это очень важный момент, потому что время дивергенции никогда не принимается во внимание биологической концепцией, иногда – морфологической, если имеются ископаемые остатки, иногда – филогенетической, но всегда – ГКВ (Baker, Bradley, 2006).

Вопрос нестандартизованных таксономических рангов не является новым (Hennig, 1966; Avise, Johns, 1999; Avise, Mitchell, 2007). Хенниг (Hennig, 1966) был первым, кто отметил, что абсолютное время эволюции могло бы быть стандартом для синхронизации таксономических рангов. Обзор и обобщение проблем синхронизации линнеевских рангов в далеких группах организмов на основании времени происхождения был выполнен Эвайсом и Лю (Avise, Liu, 2011). В настоящее время линнеевские ранги по-прежнему активно используются, но уже, очевидно, не соответствуют задачам таксономии и не отражают современный уровень знания о филогенетических связях организмов. Их объективные характеристики отсутствуют, они мало соотносимы в разных группах, их невозможно непосредственно наложить на шкалу времени (Avise, Liu, 2011), и потому временные несоответствия пронизывают нынешние классификации. В безранговой филогенетической систематике (филокодексе) система сводится к кодексу номенклатуры видов, для которых установлены филогенетические связи (Queiroz, Gauthier, 1992). Однако иерархическая система классификации представляется большинству систематиков более привычной и логичной, и научное сообщество пока не готово отказаться от нее. Можно ли не отказываться от рангов совсем, но сделать их объективными?

Разумеется, нет смысла напрямую сопоставлять внутривидовые, межвидовые или межродовые генетические и временные дистанции в далеких группах, например, у млекопитающих с таковыми у рептилий и амфибий. В последней группе они всегда будут выше по той простой причине, что любые таксоны рептилий и амфибий в основном древнее видов млекопитающих. Более того, таксоны рептилий и амфибий не только последовательно старше на каждом таксономическом уровне, чем аналогичные им таксоны птиц и млекопитающих, но похоже, что их эволюционный возраст увеличивается быстрее с ростом таксономического ранга (Hedges, Kumar, 2003). Проблема согласованности рангов в разных группах на основе времен происхождения этих групп усугубляется тем, что клады каждого таксономического ранга имеют больший или меньший диапазон эволюционных возрастов. Например, эволюционный возраст принятых в современной таксономии семейств плацентарных млекопитающих по молекулярным данным изменяется в среднем от 12 до 60 млн лет (Meredith et al., 2011; Reis et al., 2012), а эволюционный возраст семейств амфибий варьирует от 55 до 180 млн лет (Zhang, Wake, 2009; Kamei et al., 2012; Feng et al., 2017). В диапазон датировок семейств млекопитающих с некоторой натяжкой попадают времена дивергенции родов Anura: 65–20 млн лет назад (Feng et al., 2017).

Виды амфибий расходятся примерно от позднего миоцена до границы плиоцена и плейстоцена, при этом информация о времени дивергенции близких видов в составе родов амфибий для европейских и североамериканских таксонов (в основном плиоценовые и раннеплейстоценовые (Veith et al., 2003; Dufresnes et al., 2018) и позднемиоценовые (Hofman et al., 2007)) отличается от таковой для тропических групп: здесь миоценовая радиация отмечена даже для комплексов близких видов (Yang et al., 2017; Gorin et al., 2020). Возможно, впрочем, это артефакт меньшей изученности тропической фауны. Времена дивергенции близких видов рептилий также приходятся в основном на миоцен–плиоцен (Poyarkov et al., 2014; Schöneberg et al., 2023), иногда доходят до раннего плейстоцена (Salvi et al., 2021).

В любом случае, учитывая все известные сложности синхронизации рангов по времени, в рамках конкретных таксонов все же представляется вполне логичным использовать времена для размышлений о таксономическом ранге и статусе и для проведения границы между видовым и внутривидовым уровнем дифференциации.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вопрос о том, какая часть исследуемого генома позволит достигнуть желаемого результата, иными словами, какое именно количество генов необходимо для того, чтобы получить генетическую дистанцию, разрешающую отношения ветвей филогенетического дерева комплекса близкородственных видов, остается открытым.

Учитывая, что разные функционально-структурные области генома эволюционируют с разной скоростью, задача определения уровня дивергенции по ядерным данным связана с задачей определения генетической дистанции по мультилокусным данным и оценкой ее ошибки. Поэтому на первом этапе исследования необходимо подобрать стандартный набор маркеров, который будет служить эталоном генетической дистанции. Наиболее рациональным выбором представляется экзом. Существующие в настоящее время данные в большинстве случаев представлены лишь относительно небольшим числом генов, последовательности которых получены с помощью таргетного секвенирования или из транскриптомов (десятки и сотни). Поэтому для получения сравнимых дистанций необходимо вводить поправочные коэффициенты, учитывающие отношение средней скорости по исследуемой выборке генов к средней скорости экзома в целом. Учитывая, что как отдельные локусы, так и целые геномы испытывают значительные изменения скоростей накопления мутаций в своей эволюции, очевидно, что сравнимость дистанций может быть достигнута только в пределах таксономически компактных групп животных.

Цель нашего исследования состоит в том, чтобы, сохраняя преемственность при переходе от классической систематики к геносистематике, обеспечить практикующих систематиков новым объективным инструментом, который облегчит принятие таксономического решения (вид/подвид). Во-первых, используя уже существующие мультилокусные данные, мы хотим определить уровень различий, характеризующий близкие виды и внутривидовые формы млекопитающих. На этом основании, возможно, удастся сформулировать критерий по ядерным генам, аналогичный предложенному ранее (Bradley, Baker, 2001; Baker, Bradley, 2006), и в конечном итоге разработать мультигенный и временной критерий вида для млекопитающих. Во-вторых, мы пытаемся оценить диапазон изменчивости мультигенной генетической дистанции и определить примерный объем данных, необходимый для получения информационно значимой генетической дистанции с необходимой точностью.

MАТЕРИАЛ И MЕТОДЫ

Эмпирические дистанции между близкими видами

Для эмпирического определения генетических дистанций между близкими видами (сестринские виды или члены единой видовой группы с неразрешенными взаимоотношениями) исходно было отобрано 188 белок-кодирующих генов длиной от 1000 до 4000 п. н. Для удобства работы использовались гены, кодирующая последовательность которых включала единственный экзон (согласно аннотации генома китайского хомячка Cricetulus barabensis griseus GCF_000223135.1). Предварительно, с использованием ресурсов базы Orthomam (v.12a) (https://orthomam.mbb.cnrs.fr/; Allio et al., 2024), проверялось присутствие каждого гена кандидата в геномных последовательностях не менее 170 видов млекопитающих и их аутосомная принадлежность. Из списка видов, последовательности которых доступны в GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), выбирали пары или группы близких видов и определяли ближайший к ним (референсный) вид, для генома которого существовала аннотация Refseq. Геномные аннотации в формате GTF из базы данных NCBI были использованы для извлечения координат CDS отобранных 188 генов. Сами последовательности CDS были извлечены из соответствующих референсных геномов при помощи программы bedtools getfasta. Поиск ортологов в остальных родственных геномах для каждой пары/группы близких видов проводили при помощи программы BLASTn с параметрами соответствия 95% сходства и 50% длины последовательностей. Наиболее подходящий результат поиска BLAST для каждого из геномов был сведен в множественное выравнивание ортологов определенного гена с помощью программы MAFFT (Katoh, Standley, 2013) с параметром –ep 0.123. Все гены для конкретной группы сравниваемых геномов были сведены в конкатенат при помощи программы seqkit concat. Между конкатенированными последовательностями вычислялась p-дистанция в программе PAUP, version 4.0b10 (Swofford, 2003). В ряде случаев кроме пар близких видов в исследуемую группу включались более далекие виды из того же рода или внутривидовые формы. Список исследованных таксонов приведен в табл. 1.

 

Таблица 1. Мультигенные межвидовые и внутривидовые дистанции, рассчитанные по 188 ядерным локусам для грызунов, рукокрылых, парнокопытных и китообразных

Таксоны	Дистанции	Таксоны	Дистанции
RODENTIA
Mus		Acomys
domesticus / castaneus / musculus	0.00319** 0.00349**	russatus/	0.02166***
domesticus	0.00083+ 0.00115+	percivali/	0.02084***
musculus	0.00081+	kempi/	0.00929***
castaneus	0.0001+	cahirinus / dimidiatus	0.00078
musculus + domesticus / spretus + spicilegus	0.00759***	Cavia
spretus / spicilegus	0.0069***	aperea/	0.00382***
spretus	6.65E+05+	tschudii / porcellus	0.0005*
caroli/	0.01704***	Marmota
pahari/	0.03218	marmota / himalayana	0.00257***
minutoides/	0.03198	monax/	0.00396***
Peromyscus		vancouverensis / flaviventris	0.0037***
maniculatus / polionotus	0.00621***	vancouverensis + flaviventris / marmot + himalayana + monax	0.0043***
maniculatus	0.00037+	Rhabdomys
nudipes / melanophrys	0.00974***	pumilio / dilectus	0.0051***
eremicus / californicus	0.01259***	Mastomys
eremicus1 / eremicus2	0.00567	natalensis / coucha	0.00583***
nudipes + melanophrys / eremicus + californicus	0.0195***
maniculatus + polionotus / eremicus + californicus + nudipes + melanophrys	0.0233***
CHIROPTERA
Rousettus		Pipistrellus
aegyptiacus / madagascariensis	0.0033***	pygmaeus / pipistrellus	0.0074***
leshenaultii / aegyptiacus + madagascariensis	0.00485***	kuhlii / pygmaeus + pipistrellus	0.0161***
Pteropus		Hipposideros
giganteus / vampyrus	0.00283***	armiger / pendlebury	0.0037***
pselaphon/	0.00331***	larvatus / pendlebury + armiger	0.0065***
alecto/	0.00602***
CARNIVORA
Mustela		Canis
eversmanii / nigripes	0.00118**	dingo / familiaris	0.0007*
putorius / furo	0.0004*	lupus / familiaris+	0.00095*
eversmanii + nigripes / putorius	0.0022***	Neofelis
lutreola/	0.00348***	diardi / nebulosa	0.0022***
Martes		Ursus
martes / zibellina	0.0026***	maritimus / arctos	0.0016***
Felis		americanus / maritimus + arctos	0.00265***
catus / nigripes	0.0035***	Prionailurus
chaus / catus + nigripes	0.004***	bengalensis / iriomotensis	0.00094*
Lynx		viverrinus / bengalensis+	0.00254***
canadensis / pardinus	0.0013**	Mirounga
rufus / canadensis + pardinus	0.00285***	leonina / angustirostris	0.0017***
CETARTIODACTYLA
Bubalus		Moschus
bubalis / carabanensis	0.0021**	chryzogaster / berezovskii	0.0017***
depressicornis / bubalis	0.0027***	moschiferus / chryzogaster + + berez	0.0044***
depressicornis / carabanensis	0.0023***	Ovis
Capra		nivicola / canadensis	0.00134**
aegagrus / hircus	0.0011	aries / orientalis	0.00155**
aegagrus + hircus / sibirica	0.0035***	ammon / aries + ori	0.00276**
Cervus		pachyceros / ovis	0.00357***
canadensis / hanglu	0.0013**	Sus
elaphus / canadensis + hanglu	0.0016**	scrofa / cebifrons	0.0042***
albirostris/	0.0019***	Camelus
Capreolus		bactrianus / ferus	0.0009*
capreolus / pygargus	0.0037***	dromedarius / bactrianus+	0.00245***
Tursiops		Balaenoptera
truncatus / aduncus	0.002***	acutorostrata / bonariensis	0.0034***

Примечание. ***дистанции между видами; **между полувидами; *между внутривидовыми группами; ⁺ индивидуальные дистанции внутри группировок.

 

Симуляция генетических дистанций для разных значений параметров

Помимо определения эмпирических дистанций, проводили симуляции генетических дистанций для разных значений параметров. Цель симуляций – оценить зависимость ошибки генетической дистанции от объема данных и определить, при каком объеме данных относительная ошибка дистанции будет сопоставима с аналогичной величиной для мтДНК. Предварительно был проведен анализ распределения скоростей локусов среди таксонов млекопитающих на основе данных по ~50 тыс. ядерных маркеров, использованных в работе Хекера и Хиллера (Hecker, Hiller, 2020). Параметры для симуляции включают, с одной стороны, характеристики эволюционного процесса, а с другой – параметры, касающиеся формирования объема данных в процессе исследования.

Важнейший параметр эволюционного процесса – скорость накопления замен, она может быть неодинаковой и отличаться как между генами, так и между линиями (концепция свободных часов). Мы предполагаем, что распределение скоростей разумно моделировать с помощью логнормального распределения со следующими параметрами:

µ_exp – средняя скорость накопления замен;

σ(µ) – дисперсия скорости, учитывает различия скоростей как в разных линиях, так и у разных генов;

Ne – эффективная численность; в общем случае их три – для современных таксонов, между которыми считается дистанция, и для их общего предка; от этих величин будут зависеть времена коалесценции аллелей;

T – время дивергенции.

В общем случае мы предполагаем, что сиквенсы соответствуют нефазированным генотипам, в которых гетерозиготные позиции кодируются с помощью стандартных обозначений для вырожденных позиций (ambiguity codes).

Подсчет дистанций производится между отдельными экземплярами, а не выборками.

Ожидаемая дистанция для гена k будет равна 2µ_kT = µ_k(2T_div + 2t_anc – t₁ – t₂), где T_div – время дивергенции, а t_anc, t₁, t₂ – времена коалесценции аллелей у предка и современных форм.

Эти параметры моделируются с помощью экспоненциальных распределений с математическими ожиданиями, равными 2Ne. Если уровень анцестрального полиморфизма соответствует среднему значению для современных форм, то ожидаемая дистанция будет равна 2μ_kT_div. Это упрощение принято в наших симуляциях.

Наконец, последние два параметра характеризуют процесс формирования выборки – это число генов (n) и длины их последовательностей (L).

Учитывая, что при небольших временах дивергенции количество замен на ген длиной около 1000 п. н. обычно не превосходит несколько нуклеотидов, для моделирования числа замен в случайно выбранном гене использовалось распределение Пуассона с параметром L × μ_k(2T_div + + 2t_anc – t₁ – t₂), где µ_k – случайная величина из логнормального распределения с параметрами (µ_exp, σ(µ)), а t_anc, t₁ и t₂ – независимые случайные величины, извлеченные из экспоненциального распределения с математическим ожиданием 2Ne. Процедуру повторяли по числу генов. Дистанция по совокупности генов равна сумме числа замен, деленной на nL. Симуляции повторяли 10000 раз для каждого набора параметров, включавшего µ_exp, σ(µ), T_div, Ne, n и L. На основе эмпирических распределений вычисляли коэффициент вариации дистанции как показатель ее относительной ошибки. Эту величину сравнивали с коэффициентом вариации дистанции по митохондриальному гену cyt b для сходных уровней дивергенции (детали вычислений приведены в Приложении). На выходе определяли, какой объем данных (n и L) достаточен для получения дистанций с ошибкой не выше, чем для митохондриальных данных. Все симуляции проводились в среде R c использованием встроенных функций rlnorm, rexp, rpois.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Величины межвидовых и внутривидовых дистанций

Априори было выделено три категории дистанций: 1) дистанции между видами в пределах рода, по возможности мы не включали туда виды из относительно далеких ветвей ранга подродов; 2) дистанции между конспецифичными формами, включая подвиды, а также домашними и дикими формами; 3) категория полувидов, статус которых по-разному принимается разными авторами (например, Mus musculus и M. domesticus), или крайне близкие виды, между которыми известны зоны гибридизации (например, косули Capreolus capreolus и C. pygargus). Учитывая, что скорость нуклеотидных замен в некоторых группах, по крайней мере в некоторых таксонах, грызунов заметно отличается от таковой у других млекопитающих (Bergeron et al., 2023; наши данные), дистанции между видами Rodentia мы рассматриваем отдельно, выделяя все те же три категории. Результаты приведены в табл. 1 и на рис. 1. Как видим, дистанции между видами для большинства млекопитающих находятся в диапазоне от 0.15 до 0.75% с медианой 0.33%. Дистанции между полувидами находятся в диапазоне от 0.12 до 0.28% с медианой 0.14%. Внутривидовые дистанции (межпопуляционные или внутрипопуляционные) всегда меньше 0.11%.

 

Рис. 1. Диапазон межвидовой и внутривидовой изменчивости: а – для разных отрядов млекопитающих, б – для отряда Rodentia.

 

У грызунов можно наблюдать более высокие значения межвидовых дистанций – от 0.25 до 2.3% с медианой 0.72%. Дистанции между полувидами находятся в диапазоне от 0.1 до 0.35%. Внутривидовые дистанции у грызунов меньше 0.12%.

Определение необходимого объема выборки в зависимости от параметров модели

Результаты симуляции эволюции cyt b показали, что относительная ошибка (CV) для величин дистанций, характерных для близких видов или полувидов (4–6%), равна 0.11–0.14. Соответственно, нам требуется определить, при каких значениях параметров и объеме выборки ядерных генов будет достигаться пороговое значение, равное 0.11.

Симуляции показали, что относительная ошибка уменьшается с ростом величины самой дистанции и, соответственно, с ростом времени дивергенции (табл. 2, А). Пороговое значение CV при длине гена 300 п. н. для времени дивергенции в 500 тыс. лет (дистанция = 0.003) достигается при выборке в 100 генов, но требует больше 200 генов для времени дивергенции в 200 тыс. лет (дистанция = 0.00125). Если длина гена увеличивается до 1000 п. н., то пороговое значение для времени дивергенции 0.5 млн лет достигается уже при 50 генах (табл. 2, Б).

 

Таблица 2. Зависимость коэффициента вариации (CV) от параметров модели

Число генов	Параметры модели
	А время дивергенции (тыс. лет)				Б длина гена (п. н.)			В σ(µ) – дисперсия скорости			Г Ne – эффективная численность
	200	300	500	800	300	600	1000	1е-9	2е-9	3е-9	5000	10000	50000	100000	300000
	Неварьирующие переменные
	σ(µ) = 1e-9 µ = 3e-9 Ne = 5e4 длина гена = 300 п. н.				σ(µ) = 1e-9 µ = 3e-9 Ne = 5e4 t = 500 тыс. лет			µ = 3e-9 Ne = 5e4 длина гена = 300 п. н.			σ(µ) = 1e-9 µ = 3e-9 t = 500 тыс. лет длина гена = 300 п. н.
5	0.85	0.65	0.50	0.41	0.50	0.38	0.32	0.50	0.58	0.67	0.49	0.50	0.50	0.53	0.69
10	0.60	0.46	0.36	0.29	0.36	0.27	0.23	0.36	0.41	0.47	0.35	0.35	0.36	0.39	0.49
20	0.42	0.33	0.26	0.21	0.26	0.19	0.16	0.26	0.28	0.33	0.25	0.25	0.26	0.27	0.34
30	0.35	0.27	0.21	0.17	0.21	0.16	0.13	0.21	0.23	0.27	0.20	0.20	0.21	0.22	0.28
50	0.27	0.21	0.16	0.13	0.16	0.12	0.10	0.16	0.18	0.21	0.16	0.16	0.16	0.17	0.22
100	0.19	0.15	0.11	0.09	0.11	0.09	0.07	0.11	0.13	0.15	0.11	0.11	0.11	0.12	0.16
200	0.13	0.10	0.08	0.06	0.08	0.06	0.05	0.08	0.09	0.11	0.08	0.08	0.08	0.08	0.11
500	0.08	0.07	0.05	0.04				0.05	0.06	0.07
1000	0.06	0.05	0.04	0.03				0.04	0.04	0.05

 

Вклад увеличения дисперсии скоростей генов (табл. 2, В) заключается в том, что увеличение σ(µ) c 1е-9 до 3е-9 приводит к необходимости увеличения выборки с 100 до 200 генов.

При увеличении Ne объем выборки, необходимый для достижения порогового значения CV, существенно возрастает при величинах Ne, сопоставимых со временем дивергенции (табл. 2, Г).

Примеры генетических различий между полувидами и дикими и домашними формами у млекопитающих

Хотя в Кодексе зоологической номенклатуры ранг полувида не принят, тем не менее этот термин обычен и широко употребляется в литературе (Mallet, 2007), наряду с близким по значению понятием “species in statu nascendi” (Singh, 2021) для обозначения одного из начальных этапов формирования вида, когда ему не может еще быть присвоен таксономический ранг, однако мы наблюдаем процессы, которые могут привести к его полному становлению.

В качестве классического примера полувидов можно привести надвидовой комплекс Mus musculus / M. domesticus. Эти географические формы с контактной зоной в Центральной Европе разными авторами рассматриваются как близкие виды или подвиды политипического вида M. musculus, при этом поток генов в гибридной зоне ограничен и асимметричен (Good et al., 2008; Baird, Macholan, 2012). Дистанция между ними по ядерным генам составляет 0.32%. Примерно тот же уровень различий характеризует M. musculus и M. castaneus (0.35%). Внутривидовые дистанции для M. musculus и M. domesticus составляют 0.08%, для M. castaneus – 0.01%. Дистанции от них до других близких видов, ранее тоже относимых к M. musculus s. l., существенно выше. M. caroli из Юго-Восточной Азии – это относительно далекий вид, однако принадлежащий к тому же подроду. M. pahari и M. minutoides относятся к другим подродам и дистанции от них до M. musculus / M. domesticus значительно выше (~3%).

Другой пример близких викариирующих форм – хорьки р. Mustela. Степной и лесной хори, M. eversmanii и M. putorius, распространены парапатрично и скрещиваются в природе. Дистанция между ними 0.22%. К лесному хорю много ближе домашняя форма M. furo (0.04%). Ближайшая сестринская группа степного хоря – черноногий хорь M. nigripes (0.12%). Дистанция между хорями и относительно близкой к ним европейской норкой – 0.35%.

Дистанция между безусловно сестринскими видами бурым (Ursus arctos) и белым медведем (U. maritimus) – 0.16%. Дистанция до ближайшего к ним вида, U. americanus, 0.27%.

Ириомотейская кошка Prionailurus iriomotensis считается островным подвидом бенгальской кошки P. bengalensis, хотя исходно была описана как отдельный вид. По нашим данным, дистанция между ними 0.094%, что заметно меньше дистанции между P. bengalensis и P. viverrinus – 0.25%.

Некоторое время назад все разнообразие благородных оленей Голарктики по мтДНК было сведено к трем группам: европейский благородный олень Cervus elaphus, южно-азиатская форма C. hanglu и канадский олень C. canadensis, объединяющий оленей Сибири и Северной Америки (Mackiewicz et al., 2022). Данные по ядерным геномам подтверждают родство этих трех форм при диапазоне дистанций между ними 0.13–0.19%. К ним близок тибетский беломордый олень C. albirostris (0.19%), что тоже согласуется с митохондриальными данными.

Систематика рода горных баранов (Ovis) всегда трактовалась неоднозначно. Разные исследователи включали сюда от двух до семи видов (Grubb, 2005). Данные по ядерным генам согласуются с делением на три группы. Азиатский муфлон O. orientalis оказался относительно близок к домашней овце O. aries (0.16%), чье происхождение связывают с подвидом O. aries musimon. С ними объединяется архар O. ammon с дистанцией 0.28%. Азиатские и американские снежные бараны очень близки (0.14%).

Среди диких и домашних форм млекопитающих наиболее показательны следующие примеры. Волк и домашняя собака в настоящее время считаются конспецифичными формами (Bergström et al., 2022). Дистанция между волком, домашней собакой и динго составляет 0.095%.

Дикий и домашний двугорбые верблюды, Camelus ferus и C. bactrianus, по митохондриальным данным относятся к разным, хотя и родственным, кладам. Геномные данные указывают на их близость при дистанции (0.09%). Дистанция между двугорбым и одногорбым верблюдами – 0.25%.

Между Bos taurus и B. indicus – родоначальниками домашнего рогатого скота – дистанция по ядерным генам составляет 0.15%. Несколько большая дистанция (0.2%) между речным и болотным буйволами, Bubalus bubalis и B. carabanensis, которые также участвовали в формировании домашнего скота. Несколько дальше от них целебесский буйвол B. depressicornis (0.23%).

Лабораторная морская свинка Cavia porcellus считается производной от дикого вида C. tschudii. Это полностью соответствует дистанциям по ядерным генам, которые между этим двумя формами очень малы (0.05%). Относительно далек от них другой дикий вид C. aperea (~0.4%).

ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее на примере видовых комплексов Sorex araneus (Raspopova et al., 2022), Crocidura suaveolens (Грицышин и др., 2023), Dipus sagitta (Лисенкова и др., 2023), а также некоторых видовых комплексов р. Allactaga (Lebedev et al., 2022) нами было показано, что разрешающей способности набора из 10–20 ядерных локусов недостаточно для изучения диверсификации филетических линий в сложных видовых комплексах и группах близкородственных видов. Для удовлетворительного анализа филогенетических отношений и событий гибридизации в пределах этих видовых групп необходим переход к методикам глубокого секвенирования нового поколения.

Почему экзом?

Довольно часто исследуют характеристики генома как целого, в частности такой показатель, как скорость мутирования на поколение или год по геному в среднем. Кроме того, довольно часто, рассматривая белок-кодирующие гены, исследователи фокусируются на интронных последовательностях, мотивируя свой выбор их большей скоростью эволюции, что приводит к большей информативности данных. Однако в качестве стандартного набора маркеров, с нашей точки зрения, больше подходит экзом, или как минимум большая выборка кодирующих последовательностей. Аргументом в пользу такового выбора может быть тот факт, что в этом случае проще установить гомологию. С другой стороны, эволюция интронов часто осложнена такими событиями, как инсерции диспергированных повторов и индели в тандемных повторах (Fedorova, Fedorov, 2003; Zhang, Hewitt, 2003), что может затруднять оценку уровня дивергенции и искажать результат. Кроме того, скорость изменения экзонов по сравнению с интронами ниже в 1.5– 2 раза (Zhang, Hewitt, 2003), но проблем с выравниванием экзонных последовательностей значительно меньше.

Проблемы определения генетической дистанции и возможности их преодоления

Результаты нашего исследования показывают, что у млекопитающих разница между видом и внутривидовой формой на уровне генома составляет 0.1–0.15%. Эти данные являются предварительными и подлежат уточнению после изучения большего числа групп, содержащих полувиды. Среди грызунов дистанции в видовом комплексе домовой мыши (см. ниже) указывают на больший уровень различий, чем в случае полувидов из других отрядов. В сочетании с более высоким уровнем различий между “хорошими” видами у грызунов это говорит в пользу предположения, что единого порога для всех млекопитающих не существует и его величина зависит, возможно, от скорости мутирования в тех или иных группах. Например, у грызунов скорость мутирования на единицу времени выше, чем у других млекопитающих (Bergeron et al., 2023).

Кроме того, следует проверить предположение, что разница между внутри- и межвидовой изменчивостью лучше видна не по генетическим дистанциям, а по временам дивергенций. Если это окажется так, то будет подтверждена гипотеза, что процесс видообразования не напрямую связан с количеством различий по первичной структуре ДНК, а зависит от какого-то другого процесса, протекающего с более или менее постоянной скоростью относительно физического времени. С другой стороны, такой вывод противоречил бы существующим данным, которые указывают на положительную корреляцию между скоростью видообразования и скоростью молекулярной эволюции (Webster et al., 2003). Этот сложный вопрос требует дальнейших исследований.

Тем не менее, даже если ранг таксона лучше соответствует времени, чем дистанции, оценка уровня генетических различий является необходимой частью анализа. Соответственно, вопрос о необходимой точности оценки дистанции остается актуальным. Принимая величину коэффициента вариации в 0.1–0.15 за минимальный уровень относительной ошибки, мы приходим к выводу, что для получения надежной оценки дистанции по ядерным генам необходимый объем данных составляет 50–100 генов длиной примерно в 1000 п. н. или для генов длиной 300 п. н. требуется 100–200 генов. Необходимость большой длины совокупного выравнивания есть следствие существенно более медленной эволюции ядерных генов. Однако при высоких значениях анцестральной эффективной численности (Ne = 1е5) существенным оказывается вклад ошибки, связанной с числом генов.

Тем самым результаты исследования показывают, что выборки ядерных генов числом менее 10 абсолютно недостаточны для проверки гипотезы по уровню дивергенции ядерного генома, потому что относительная ошибка очень велика (25–75%). В частности, невозможно проверить гипотезу о том, что уровень различия по митохондриальному геному соответствует уровню различий по ядерному геному, и, следовательно, отвергнуть гипотезу о заимствовании мтДНК. Этот вывод ставит предел возможностям сэнгеровского секвенирования в связи с временными и финансовыми затратами.

Итак, наши результаты по ядерным генетическим дистанциям в целом соответствуют ожиданиям в том, что дистанции между полувидами меньше дистанций между “хорошими” видами в тех же группах, при этом внутривидовые дистанции еще меньше. Основываясь на представленных данных, можно сделать следующее заключение: порог межвидовой/внутривидовой генетической дистанции для млекопитающих, рассчитываемой по экзонам, которые наиболее часто используются в молекулярной филогенетике этой группы, составляет около 0.15%. Данная гипотеза предполагает признание за видами in statu nascendi видового ранга. Следует заметить, однако, что не все “хорошие” виды имеют значительные генетические дистанции в связи с тем, что репродуктивные барьеры иногда формируются быстрее, чем накапливаются замены по геному.

Потенциальные источники ошибок

Проведенная нами работа с последовательностями, получаемыми из депонированных в GenBank геномов, может содержать в себе потенциальные ошибки. Во-первых, при небольшом числе экзонов оценка дистанции может быть искажена давлением отбора на динамику появления мутаций в их последовательностях, однако мы предполагаем, что достаточно большая выборка локусов позволяет нивелировать это влияние. Во-вторых, геномная последовательность, представленная в базах данных, псевдогаплоидна, так как обычно не учитывается, что организм реально диплоидный. Кроме того, в самих геномных данных довольно часто встречаются ошибки. Оба последних фактора приводят к тому, что генетические дистанции между близкими геномами могут оказаться завышенными. Чтобы избавиться от искажения результата, желательно, вычисляя дистанцию, вводить поправку на эти источники ошибок, рассчитывая net-дистанцию с учетом дистанции между геномами внутри одного таксона. В этом случае мы можем оценить внутрипопуляционную дистанцию между геномами. Однако, к сожалению, эти показатели в настоящее время практически недоступны для немодельных объектов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приносим благодарность В. А. Горину за помощь в обзоре литературы по временам дивергенций амфибий и рептилий.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа поддержана Российским научным фондом (грант РНФ № 21-14-00007).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит экспериментальных исследований с использованием животных в качестве объектов.

ПРИЛОЖЕНИЕ

В случае быстро эволюционирующих митохондриальных последовательностей использование для симуляции распределения Пуассона не подходит. Вместо этого мы симулировали последовательности для пары таксонов на основании реалистичных эволюционных моделей в программе Indelible v.1.03 (Fletcher, Yang, 2009). Истинная эволюционная дистанция между таксонами принимала одно из пяти значений (0.15– 0.10–0.07–0.049–0.0343), для каждого варианта проводили 10000 симуляций. Три позиции кодонов имели каждая свою модель (соответственно, TrN + I + G, HKY + I + G, TrN + G), скорости позиций соотносились как 0.045 : 0.01 : 0.245. Параметры моделей приведены в контрольном файле ниже, вычислялись в PAUP* 4.0b10 (Swofford, 2003). Результаты отражены в табл. П1.

 

Таблица П1. Некорректированные (p-)дистанции между симулированными последовательностями гена cyt b

Истинная дистанция	0.15	0.10	0.07	0.049	0.0343
Средняя p-дистанция	0.0914	0.0724	0.0551	0.0413	0.0303
CV	0.0888	0.1026	0.118	0.140	0.1628

 

Контрольный файл (часть):

[MODEL] m1

[submodel] TrN30.0 15.0

[statefreq] 0.25 0.25 0.25 0.25

[rates] 0.5 0.5 4

[MODEL] m2

[submodel] HKY15.0

[statefreq] 0.4 0.25 0.20 0.15

[rates] 0.8 1.0 4

[MODEL] m3

[submodel] TrN12.0 36.0

[statefreq] 0.20 0.40 0.35 0.05

[rates] 0.0 2.5 4

[TREE] t1 (A:1.0, B:1.0);

[treelength] 0.06300

[TREE] t2 (A:1.0, B:1.0);

[treelength] 0.01400

[TREE] t3 (A:1.0, B:1.0);

[treelength] 0.34300

[PARTITIONS] p0

[t1 m1 380]

[t2 m2 380]

[t3 m3 380]

About the authors

V. S. Lebedev

Moscow State University

Email: wslebedev@mail.ru

Zoological Museum

Russian Federation, Moscow

S. A. Kosushkin

Engelhardt Institute of Molecular Biology, RAS

Email: toki@mail.ru
Russian Federation, 119991, Moscow, Vavilova, 32

A. A. Bannikova

Moscow State University

Author for correspondence.
Email: hylomys@mail.ru

Department of Vertebrate Zoology

Russian Federation, 119234, Moscow, Leninskiye Gory, 1, Bld. 12

References

Supplementary files