Роль функциональных групп при комплексообразовании структурных аналогов ароматических аминокислот с пектином

Full Text

Приоритетным направлением в последнее десятилетие являются исследования в области получения комплексов полисахаридов с аминокислотами (АК), которые могут обладать новыми разнообразными свойствами, что позволит расширить их применение в биотехнологии, фармацевтике и медицине [1–7]. В свою очередь, избирательность комплексообразования напрямую определяется величинами констант устойчивости образующихся комплексов. Эти данные могут быть использованы для изучения влияния структуры комплексообразователей на состав и стабильность комплексов, а также для прогнозирования их последующего применения. Среди полисахаридов важное место отводится пектинам (ПК), которые обладают разнообразной биологической активностью и широко используются для создания новых высокоэффективных препаратов с низкой токсичностью, иммуномодулирующим, антибактериальным, гепатопротекторным действием [8–12]. Среди модифицирующих полисахаридов агентов можно выделить ароматические АК и их производные, которые играют важную роль в химических и биохимических процессах, проходящих в живых клетках, и входят в состав множества фармацевтических препаратов [13–19].

Ранее модификацией яблочного пектина триптофаном (Trp) были получены комплексы с более высокой устойчивостью по сравнению с комплексами ПК с рядом других ароматических АК, в частности с фенилаланином (Phe), что может быть обусловлено различным вкладом ароматического и индольного фрагментов модификатора в данный параметр [20, 21]. Поэтому для понимания особенностей взаимодействия ПК с указанными выше ароматическими АК представляется важным определение вклада структурных фрагментов модификаторов (МА) в устойчивость образующихся пектиновых комплексов, а также оценка их влияния на характер комплексообразования и термодинамику данного процесса.

Целью данной работы является изучение взаимодействия яблочного пектина со структурным аналогом триптофана – индолом (Ind) и производным фенилаланина – L-тирозином (Tyr), установление влияния природы модификатора на состав и устойчивость комплексов, термодинамику процесса и термические свойства.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В экспериментах использовали ПК товарной марки Unipectine XPP 240 с молекулярной массой 26000 Da, степенью этерифицирования 66%, влажностью 2.3% и содержанием свободных карбоксильных групп 7.7%. Определение степени этерифицирования, влажности и содержания свободных карбоксильных групп ПК проводили по методике [22]. Ind, Tyr марки «х.ч.» использовали без дополнительной очистки и высушивали в вакуумном шкафу перед взятием навесок до постоянной массы при 313 К. Спектры ЯМР ¹³C растворов образцов в D₂O регистрировали на спектрометре Bruker Avance III 500 MHz (погрешность определения – 5%). ИК-спектры образцов записывали на спектрометре Shimadzu IR-Prestige-21 (700–3600 см⁻¹, вазелиновое масло). Величину удельного вращения измеряли на поляриметре Perkin-Elmer (модель 141). УФ-спектры водных растворов соединений снимали в кварцевых кюветах толщиной 1 см на спектрофотометре UV-VIS SPECORD M-40. Кислотность растворов контролировали на pH-метре «Анион 4100». Необходимую кислотность раствора создавали растворами НCl и NaOH. Для изучения термического разложения образцов измерения проводили на приборе синхронного термического анализа ТГА-ДСК (Mettler Toledo) в среде воздуха при скорости нагревания 5 К/мин, в интервале температур от 298 до 773 К. Для измерений использовали образцы соединений массой 5–8 мг, применяли тигли из оксида алюминия объемом 70 мкл.

Состав образующихся соединений при взаимодействии ПК с МА определяли спектрофотометрическим методом мольных отношений [23]. Молярные отношения [ПК]:[МА] варьировали от 50:1 до 1:20. В сериях растворов с постоянной концентрацией МА, равной 1×10^–4 моль/л, концентрацию ПК изменяли от 1×10^–5 до 1×10^–3 моль/л. Ионную силу поддерживали постоянной, равной 0.1 моль/л (NaCl, «х.ч.»).

По методу мольных отношений [23] спектральные изменения для раствора ПК+МА описываются уравнением:

${\left[МА\right]}_0/\left(A-{А}_0\right)=1/\left(\epsilon -{\epsilon }_0\right)+1/\left(\left(\epsilon -{\epsilon }_0\right){\beta }_{к}\left[ПК\right]\right)$,

где А и А₀ – оптические плотности растворов в присутствии и отсутствии ПК; [МА]₀ – начальная концентрация соответствующего модификатора; ε и ε₀ – молярные экстинкции соответствующего состава; β_к – константа устойчивости; [ПК] – концентрация пектина.

Из графика зависимости [МА]₀/(А–А₀) от 1/[ПК] по тангенсу угла наклона находили константу устойчивости комплексов.

Тепловые эффекты реакции образования комплексов были вычислены по уравнению Вант-Гоффа в интегральной форме [23]:

$∆H^0=4.575\left({lg{\beta }_{к}}^2/{{\beta }_{к}}^1\right)/\left(1/T_1-1/T_2\right)$.

Изменение энтропии вычислено по формуле:

$∆S=\left(DH-DG\right)/T, ∆G=-RT\ln \left({\beta }_{к}\right)$,

где DH – тепловой эффект реакции, DS – энтропия реакции, DG – изменение свободной энергии, T – средняя температура, β_к – константа устойчивости.

Общая методика получения комплекса ПК–МА

ПК в количестве 5.5 осново-ммоль растворяли в 20 мл воды. МА в количестве 5.5 ммоль растворяли в 20 мл воды и доводили рН до 7.0. К раствору ПК при интенсивном перемешивании прикапывали раствор МА при комнатной температуре. Реакцию проводили в течение 3 ч. По окончании реакции продукт выделяли осаждением этиловым спиртом, переосаждали снова из воды в спирт, осадок отделяли и промывали 3 раза спиртом, затем диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме. Полученные комплексы анализировали на содержание углерода, водорода и азота на анализаторе марки EUKO EA-3000.

ПК-Ind. Выход 85.6%. ИК-спектр, ν, см^–1: 3600–3000 n(ОН), 3396 n(N–H), 1741 n(C=O), 1143–1016 n(С–О, С–С). УФ-спектр, λ_max, нм: 210, 256, 261, 271, 275. Найдено, %: С 56.77; Н 5.25; N 4.27. Вычислено, %: С 57.34; Н 5.12; N 4.78. a²⁰_D, (Н₂О): +225.

ПК-Tyr. Выход 83.2%. ИК-спектр, ν, см^–1: 3600–3000 n(ОН), 3203 n(N–H), 1739 n(C=O), 1608 n(N–H), 1589 n(C=O в СОО^–), 1514 n(CH–Ar), 1153–1016 n(С–О, С–С). УФ-спектр, λ_max, нм: 223, 279. Найдено, %: С 50.51; Н 4.84; N 3.52. Вычислено, %: С 50.42; Н 5.32; N 3.92. a²⁰_D, (Н₂О): +129.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Взаимодействие ПК с Tyr и Ind изучалось методами УФ-, ИК-, ¹³С ЯМР- спектроскопии, поляриметрии и элементного анализа. Для водного раствора Tyr характерны два максимума поглощения при 224 и 275 нм, которые относятся к π–π^*-переходам ароматического кольца (рис. 1). При добавлении ПК к раствору Tyr наблюдаются коротковолновый сдвиг и увеличение интенсивности обеих полос поглощения (ПП). В УФ-спектре Ind присутствуют две ПП π–π^*-переходов ароматической системы – при 212 и 270 нм (рис. 2). При добавлении ПК к раствору Ind происходит батохромный сдвиг длинноволновой ПП при 270 нм, сопровождающийся гиперхромным эффектом обеих ПП. Такой характер изменения УФ-спектров соответствует протеканию реакции комплексообразования [24].

 

Рис. 1. Электронные спектры поглощения водных растворов ПК (1), Tyr (2), смеси ПК и Tyr (3); C _ПК = 1.0×10⁴ моль/л, С_Tyr = 1.0×10^–4 моль/л, рН 7.0, l = 1.0 см, 25 °С

 

Рис. 2. Электронные спектры поглощения водных растворов ПК (1), Ind (2), смеси ПК и Ind (3); C_ПК = 1.0×10^–4 моль/л, С_Ind = 1.0×10^–4 моль/л, рН 7.0, l = 1.0 см, 25 °С

 

Факт образования комплексных соединений ПК-Tyr и ПК-Ind подтверждается данными ¹³С ЯМР и ИК-спектроскопии. Анализируя данные табл. 1, можно отметить уменьшение химсдвигов ядер ¹³С Ind в комплексе ПК-Ind практически для всех сигналов, кроме С³ и С⁹, линии которых значительно смещаются в сторону слабого поля. Незначительные химсдвиги атомов углеродов ароматического фрагмента индольного кольца (С⁴–С⁷) свидетельствуют о неучастии последнего в связывании с ПК. В ИК-спектре ПК-Ind наиболее значительные изменения зафиксированы для n(С=О) ПК (уменьшение интенсивности и высокочастотный сдвиг на 6 см^–1 до 1741 см^–1) и пиррольного атома азота Ind (уменьшение интенсивности и высокочастотный сдвиг на 9 см^–1 до 3396 см^–1). Кроме того, наблюдается уширение ПП n(–ОН) ПК, а также высокочастотный сдвиг ПП n(С–О) и n(С–С) колебаний пиранозного кольца полисахарида на 6–8 см^–1.

 

Таблица 1. Значения химических сдвигов ¹³С СH_n-групп индивидуальных веществ и их комплексов

№С	Ind	Комплекс ПК- Ind	Δd, м.д.	Tyr	Комплекс ПК-Tyr	Δd, м.д.
С1	–	–	–	157.23	163.00	5.77
С2	135.80	135.20	–0.60	116.43	116.35	–0.08
С3	126.8	127.37	0.57	130.70	130.72	0.02
С4	120.48	120.48	0	127.00	127.03	0.03
С5	121.71	121.67	–0.04	130.70	130.72	0.02
С6	119.51	119.49	–0.04	116.43	116.35	–0.08
С7	111.68	111.64	–0.04	–	–	–
С8	125.71	125.68	–0.03	37.90	37.61	–0.29
С9	102.0	103.64	1.64	56.93	56.83	–0.10
С11	–	–	–	176.00	175.45	–0.55

 

Опираясь на спектральные данные, структуру комплексного соединения ПК-Ind можно представить следующей схемой:

 

 

При смешении ПК с Tyr в спектре ¹³С ЯМР наибольший сдвиг на 5.77 м.д. в сторону слабого поля наблюдается для сигнала атома углерода С(1) ароматического кольца, непосредственно связанного с гидроксильной группой. Также можно отметить значительный сдвиг сигнала углерода карбоксильной группы С¹¹ на 0.55 м.д. (табл. 1). В ИК-спектре комплекса ПК-Tyr интенсивность ПП n(С=О) ПК и ПП n(С=О в СОО^–) Tyr резко уменьшается и сдвигается в область больших и меньших длин волн соответственно на 4 и 9 см^–1. Также происходит низкочастотный сдвиг ПП n(–ОН) в области 3600–3000 см^–1 и высокочастотный сдвиг ПП n(С–О) и n(С–С) пиранозного кольца на 4–8 см^–1. Очевидно, формирование комплексов ПК-Tyr протекает через координацию одной молекулы аминокислоты и одного углеводного звена полисахарида с образованием между ними межмолекулярных связей с участием кислородсодержащих функциональных групп основной цепи ПК и карбоксильной и гидроксильной групп Tyr с образованием следующей структуры:

 

 

Методом мольных отношений определены состав, константы устойчивости и термодинамические характеристики комплексов (табл. 2). Согласно данным метода мольных отношений, ПК образует с МА комплексы состава 1:1 (рис. 3). Из данных табл. 2 видно, что в зависимости от температуры процесса устойчивость системы ПК-Trp выше примерно в 1.5–3 раза по сравнению с комплексом ПК-Ind, что может свидетельствовать об основополагающем вкладе индольного фрагмента триптофана в данный параметр. Дополнительная стабилизация комплекса ПК-Trp достигается за счет образования водородных связей посредством карбоксильной группы Trp с гидрокси-функциями ПК [21] согласно следующей структуре:

 

 

Таблица 2. Термодинамические характеристики и константы устойчивости комплексов

Образец	T, °К	bк ˟10–3, л моль–1	–∆Hº, кДж/моль	∆Sº, Дж/(мольК)	–∆Gº, кДж/моль
ПК-Phe [20]	273 297 313	0.6 ±0.1 0.2±0.1 0.1±0.1	25.7±2.0	–41.6±2.0	13.5±1.0
ПК-Tyr	273 298 313	9.2±1.0 3.6±0.5 2.3±0.5	24.2±2.0	–11.4±1.0	20.9±2.0
ПК-Ind	273 298 313	4.0±0.4 2.2±0.2 1.1±0.2	24.8±1.0	–19.5±1.0	19.1±1.0
ПК-Trp [21]	273 298 313	7.5±0.2 6.7±0.2 1.7±0.1	8.2±1.0	9.5±1.0	21.0±1.0

 

Рис. 3. Кривые насыщения смеси ПК с МА. ПК+Ind (1), ПК+Tyr (2); C_ПК = 1.0×10^–4моль/л, C_МА = 1.0×10^–4моль/л, 25 °С, l = 1.0 см, растворитель – вода

 

Выявлены следующие особенности влияния строения Tyr на взаимодействие с ПК. Во-первых, присутствие гидроксильной группы в Tyr является благоприятным для связывания с ПК и определяется ее участием в образовании Н-связей с карбонильной функцией ПК, что отражается на большей устойчивости ПК-Tyr по сравнению с ПК-Phe (табл. 2). Во-вторых, можно предположить, что, в отличие от Tyr, фенилаланин не связывает макромолекулы между собой [20], а взаимодействует с каждым звеном в полимерной цепочке, приводя к структуре вида:

 

 

Силы взаимодействия между МА и пектином могут включать гидрофобные силы, ван-дер-ваальсово и электростатическое взаимодействие, водородные связи и т.п. Для выбора действующих сил можно использовать термодинамические параметры реакций связывания [25]. Отрицательные значения как ΔН, так и ΔS в случае всех полимерных комплексов, кроме системы ПК-Trp, показывают, что в связывании полисахарида с МА, помимо электростатических сил, определяющую роль играют силы Ван-дер-Ваальса и водородные связи, причем процесс является энтальпийно благоприятным (табл. 2). В случае системы ПК-Trp положительное значение ΔS может указывать на определяющий вклад не только электростатических сил и водородных связей, но и гидрофобных сил, причем это связывание является процессом, протекающим под влиянием энтропии (табл. 2). Величина ΔG, рассчитанная по уравнению Вант-Гоффа, имеет отрицательное значение для всех систем, что свидетельствует о самопроизвольном протекании процесса комплексообразования во всем изученном температурном интервале.

Выявление связи термических характеристик комплексов с их строением может быть крайне важным для понимания их стабильности. Процесс термического разложения является многостадийным и для большинства модифицированных пектинов (МП) включает две стадии термической деструкции, кроме ПК-Ind, для которого наблюдается четыре стадии разложения. На первом этапе, до 100 °С, для всех МП происходит обезвоживание, при этом удаляется адсорбционная вода. На втором этапе, в основном, происходят декарбоксилирование и деструкция по гликозидным связям. Как следует из табл. 3, по общей величине потери массы (Δm₅₀₀) в области температур до 500 °С термическая стабильность комплексов понижается в следующем ряду: ПК-Phe>ПК-Trp>ПК-Tyr>ПК-Ind. Полученные результаты показывают, что ПК, модифицированный структурным аналогом Trp – индолом, характеризуется более низкими температурами разложения, т.е. его термическая стабильность существенно ниже, чем комплекса ПК-Trp. Начало термической деструкции ПК-Tyr проявляется при более высоких температурах, чем ПК-Phe (табл. 3), вероятно, вследствие присутствия гидроксильной группы в молекуле тирозина, которая стабилизирует пектиновый комплекс. Анализ полученных результатов показывает, что введение МА в полимерную матрицу приводит к заметному повышению термической устойчивости полисахарида и замедлению процесса его разложения в области температур до 500 °С (табл. 3).

 

Таблица 3. Термические свойства образцов

Образец	Ступень	Т1, оС	Т2, оС	Δm, %	Tmax на ДТГ, оС	Δm500, %
ПК	1	60.5	348.7	63.6	230.3	99.9
	2	349.1	493.0	36.3	474.1
ПК-Ind	1	37.3	142.9	15.1	109.3	96.9
	2	143.2	262.2	35.8	172.0
	3	263.6	405.7	19.6	226.8
	4	406.1	491.6	26.5	449.2
ПК-Trp	1	71.4	261.4	37.7	216.3	79.3
	2	261.1	498.6	41.6	466.2
ПК-Tyr	1	181.6	272.4	35.8	160.0 239.4	85.2
	2	313.2	498.6	49.4	452.7
ПК-Phe	1	47.2	208.7	30.3	190.9	75.9
	2	209.4	497.9	45.7	232.0

Обозначения: Т₁ – температура начала ступени, Т₂ – температура конца ступени, Δm – потеря массы, Т_max – температура, соответствующая максимальной скорости разложения образца, °С.

 

Таким образом, доказано образование межмолекулярных комплексов яблочного пектина с Ind и Tyr. Были выявлены следующие особенности влияния строения и свойств модификаторов на комплексообразование с ПК. Во-первых, присутствие индольного фрагмента в молекуле Trp является благоприятным для связывания с ПК и определяется участием атома азота в образовании донорно-акцепторной связи с карбонильной группой полисахарида. Во-вторых, присутствие гидроксильной группы в молекуле Tyr способствует стабилизации комплекса с ПК за счет образования Н-связей с карбонильной функцией полисахарида, что отражается на большей устойчивости комплекса ПК-Tyr по сравнению с системой ПК-Phe. Выявленные закономерности влияния строения модифицирующих агентов на комплексообразование дают возможность прогнозировать устойчивость комплексов. Результаты исследования могут использоваться при моделировании процессов адресной доставки лекарственных препаратов.

Статья подготовлена в рамках выполнения программы ФНИ государственных академий на 2022–2024 гг.: Госзадание «Развитие фундаментальных основ управления структурой полимеров и кинетикой процесса в каталитической полимеризации, направленной модификации синтетических и биогенных полимеров, и получение полимерных систем для биомедицинских приложений» № 1021062311391-0-1.4.4.

Анализы (измерения и расчеты) выполнены на оборудовании ЦКП «Химия» УфИХ РАН и РЦКП «Агидель» УфИЦ РАН.

About the authors

Р. Х. Мударисова

Уфимский федеральный исследовательский центр РАН

Author for correspondence.
Email: mudarisova@anrb.ru
Russian Federation, Уфа

О. С. Куковинец

Уфимский университет науки и технологий

Email: mudarisova@anrb.ru
Russian Federation, Уфа

С. В. Колесов

Уфимский федеральный исследовательский центр РАН

Email: mudarisova@anrb.ru
Russian Federation, Уфа

И. В. Новоселов

Уфимский государственный нефтяной технический университет

Email: mudarisova@anrb.ru
Russian Federation, Уфа

References

Supplementary files