Concentration and composition of circulating vesicles of adipocytic origin in patients with colon polyps and colorectal cancer

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Extracellular vesicles (EVs) are a heterogeneous population of membrane particles less than 1 μm in size, secreted by various cell types. Most EVs circulating in human blood are particles of platelet, leukocyte, erythrocyte and endothelial origin. The composition of circulating adipocyte EVs in various pathological conditions has been virtually unknown. Small EVs from the blood plasma of patients with colorectal cancer (CRC) and colon polyps with obesity or metabolic syndrome were isolated by ultrafiltration with double ultracentrifugation. To study the composition of adipocyte EVs, immunoprecipitation in combination with Western blotting and flow cytometry were used. Vesicle fractions (FABP4- and CD11b-immunoprecipitated EVs, as well as EVs contained in the supernatant after removal of CD11b-positive EVs) contained a complex of adipocyte markers (FABP4, PPAR-γ and perilipin 1). EVs of monocyte-macrophage origin precipitated on CD11b-coated particles in CRC patients without obesity were characterized by combined overexpression of FABP4 and perilipin 1, while such overexpression was not typical for CRC patients with metabolic syndrome or obesity. The fraction of truly adipocyte vesicles (supernatant after removal of CD11b-positive EVs) was characterized by the presence in all patients of a complex of adipocyte markers with predominant expression of FABP4 in both patients with metabolic syndrome/metabolically healthy obesity and patients without metabolic disorders. To correctly characterize circulating EVs of patients without obesity, it is first necessary to remove the fraction of CD11b-positive monocyte-macrophage EVs from EV preparations by immunoprecipitation or similar methods, and in the supernatant after removal/sorption of precipitated EVs, the composition of adipocyte vesicles can be studied using a set of markers (FABP4, PPAR-γ, perilipin 1, etc.). Moreover, in patients with metabolic disorders, taking into account the insignificant expression of FABP4 in CD11b-immunoprecipitated EVs, preliminary depletion of vesicle preparations is apparently not so necessary.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

У большинства больных колоректальным раком (КРР) опухоль развивается на фоне так называемого «метаболически здорового ожирения» или метаболического синдрома (более чем у 70% больных), ключевым патогенетическим моментом которого является гиперинсулинемия. Сходные метаболические изменения также характерны для больных с полипами толстой кишки, а в случае развития аденоматозных полипов или ворсинчатых аденом толстой кишки такие гистологические находки однозначно трактуются как предраковые изменения [1, 2]. Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой гетерогенную популяцию мембранных частиц размером менее 1 мкм, секретируемую различными типами клеток. Большинство циркулирующих в крови человека ВВ являются частицами тромбоцитарного, лейкоцитарного, эритроцитарного и эндотелиального происхождения. Доказательства наличия в циркуляции ВВ адипоцитарного происхождения в крайне незначительном количестве у практически здоровых людей представлены в работах Catherine и соавт. [3] и Callie и соавт. [4]. Состав циркулирующих адипоцитарных ВВ при различных патологических состояниях практически не изучен, а большинство работ по этой тематике выполнены на моделях in vitro [3]. Везикулы различного состава могут секретироваться как адипоцитами, так и стромальными клетками жировой ткани. Предлагаемые кандидаты-маркеры везикул адипоцитарного происхождения (ý- рецепторы, активируемые пролифераторами пероксисом (PPAR ý), белок, связывающий жирные кислоты 4 (FABP4), преадипоцитарный секреторный фактор (PREF1) и перилипин 1 не являются строго специфичными для клеток жировой ткани, синтезируются также некоторыми иммунными клетками, в том числе макрофагами жировой ткани [3–7]. Таким образом, с использованием вышеперечисленных маркеров удается обычно выделить смешанную фракцию адипоцитарных и моноцитарно-макрофагальных ВВ.

Целью исследования было изучение концентрации и состава циркулирующих адипоцитарных везикулах у больных с метаболическими нарушениями и без метаболических нарушений.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач была сформирована группа больных КРР n = 20

 (13 женщин и 7 мужчин, T2-4N0-2M0, средний возраст 59.6 ± 1.60 лет), имеющих метаболический синдром или метаболически здоровое ожирение по критериям IDF (2007). Измерялись и рассчитывались антропометрические параметры: обхват талии, обхват бедер, индекс массы тела. Уровень глюкозы, общего холестерина, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и триглицеридов в плазме крови исследовали на биохимическом анализаторе Torus 1220, Dixion (Россия) после 16-часового голодания. Индекс инсулинорезистентности рассчитывался по формуле: HOMA-IR = уровень глюкозы натощак (ммоль/л) х уровень инсулина натощак (мкЕд/мл)/22.5. В качестве групп сравнения были сформированы группы больных с аденоматозными полипами или ворсинчатыми аденомами толстой кишки с метаболическим синдромом или метаболически здоровым ожирением (ПТК) (n = 15, 8 мужчин и 7 женщин, средний возраст 54.2 ± 2.20 года) и группа больных КРР с нормальной массой тела (n = 10, 5 мужчин и 5 женщин, T2-4N0-2M0, средний возраст 60.6 ± 1.91 лет), не имеющих метаболических нарушений. Всем пациентам проводилась магнитнорезонансная томография на МРT-сканере MAGNETOM ESSENZA 1,5 T (Siemens, Эрланген, Германия) с поверхностно-фазированной катушкой Body Matrix и эндоскопическое исследование с забором материала для гистологического исследования.

Изоляция ВВ. Малые ВВ из плазмы крови больных выделены методом ультрафильтрации с двойным ультрацентрифугированием (ультрацентрифуга OptimaXP, Beckman Coulter). Фракционирование клеток крови (около 18 мл венозной крови, стабилизированной ЭДТА) выполнялось на высокоскоростной центрифуге с угловым ротором при 4 °C в течение 20 мин при ускорении 1000g (TGL-24MC, Drawell, Китай). Полученную при первом центрифугировании плазму повторно центрифугировали при 4°C, 20 мин, 13000g. Супернатант разводилия PBS и фильтровали через фильтры с диаметром пор 220 нм (Minisart high flow 16553-K, Sartorius, Германия). Фильтрат подвергался ультрацентрифугированию дважды на ультрацентрифуге с бакет-ротором (Optima XPN 80, Beckman Coulter, США), 4°C, 90 мин, 100 000g. Полученные аликвоты малых ВВ хранили при –80°C.

Электронная микроскопия, NTA анализ и проточная цитометрия. Для подтверждения морфологии выделенных частиц проводилась трансмиссионная электронная микроскопия. Изолированные частицы адсорбировались в течение 1 мин на медных сетках, покрытых карбонизированной пленкой. Затем сетки подвергались воздействию в течение 5-10 сек 0.5% уранилацетата. Препараты были изучены на микроскопе Jem1400 (Jeol, Япония). Распределение и концентрация выделенных везикул изучены с помощью метода анализа траекторий наночастиц (nanoparticle tracking analysis, NTA) с использованием прибора NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Великобритания). Для оптимизации измерений образцы везикул разводились PBS в пропорциях 1:100, 1:1000 и 1:10000. Анализировались средний гидродинамический диаметр (размер везикул, их распределение) и концентрация везикул. Для подтверждения везикулярной природы выделенных частиц исследовали уровень тетраспанинов CD81, СD63 и гликопротеина CD24 методом проточной цитометрии с использованием методологии сорбции везикул на латексных частицах. Цитометрия выполнена на приборе Cytoflex (Beckman Coulter, США), полученные данные анализировались с помощью программы CytExpert 2.0 Software. Медиана интенсивности флуоресценции (MFI) ВВ была проанализирована по сравнению с изотипическими и отрицательными контролями.

Оценка белка в препаратах ВВ. В работе использовался флюориметрический метод оценки белка с флюорескамином (https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/Fluorescamine-protocol.pdf). Для определения белка 10 мкл препаратов везикул смешивали с 3 мкл лизирующего буфера (0.25 М Tris-HCl, 8%SDS, 0.2M DTT, pH6,8) на льду (10 мин), кипятили при 95 градусов в течение 10 мин. После центрифугирования при 12000 g в течение 10 мин весь надосадок смешивали с 3 мкл раствора флюорескамина (3 мг/мл, CAS 38183, BLD Pharm, Shanghai, China) в DMSO. Измерение проводили на ридере Agilent BioTek Cytation 1 Cell Imaging Multimode Reader (Biotek, CША), длина волны возбуждения — 365 нм, длина волны эмиссии — 470 нм. Предварительно строили калибровку с использованием водных стандартов трипсина (трипсин кристаллический порошок лиофил., 10мг фл, Россия).

Иммунопреципитация везикул и Вестерн блоттинг. Для исследования состава циркулирующих адипоцитарных везикул выполнена иммунопреципитация на предварительно отмытых в PBS альдегидных латексных частицах, покрытых антителами к FABP4 и СD11b. Пять микролитров 3×105 альдегид-сульфатных латексных частиц диаметром 4 мкм (4%, A37304, “Invitrogen”, США) отмывали дважды по 100 мкл 0.1M MES-буфером pH 5.5 (3000g, 15 мин, комнатная температура) и ресуспендировали в 25 мкл MES-буфера. Затем к частицам добавляли по 3 мкг моноклональных антител против CD11b (E-AB-F10081A, Elabscience, USA) и FABP-4 (FAB693Hu01, Cloud-Clone Corp., Китай) и инкубировали при комнатной температуре в течение 14 ч при перемешивании. Аликвоты выделенных из крови ВВ (около 35 мкг белка) инкубировали с комплексами антитело-латексные частицы (3 мкл отмытых комплексов) при комнатной температуре в течение 2 ч, шейкер 400 rpm. Далее образцы центрифугировали при 600g, 4С, 15 мин. Фракции в осадках представляли собой иммунопреципитированные ВВ моноцитарно-макрофагатьного происхождения и общую фракцию FABP4-позитивных ВВ плазмы крови. Эти фракции и супернатант ВВ после удаления СD11b-позитивных ВВ были лизированы (0.05 М Tris-HCl, pH 7.4; 0.15 М NaCl, 1% Triton X-100, 1% SDS) в присутствии смеси ингибиторов протеолиза (леупептин, пепстатин, апротинин) в течение полутора часов, при +4°C, далее образцы подвергали обработке ультразвуком на установке Sonopuls mini20 (Банделин, Германия) с ультразвуковым датчиком MS1 в течение 90 сек. во льду. После центрифугирования (13 000 g, 15 мин), экстракты протеинов были нормализованы по белку. Электрофорез проводился в 12.5% SDS-PAAG, для нанесения использовался стандартный нередуцирующий буфер. Разделенные электрофорезом белки переносили на PVDF мембрану (Immobylon, Millipore, США). Мембрану блокировали 1X раствором iBind (Invitrogen, США). Окрашивание первичными и вторичными антителами выполнено с использованием устройства iBind Western Device (Thermo Scientific, США) в течение 3-3.5 ч [8]. В работе использовали следующие моно- и поликлональные антитела: антитело к CD63 (СSB-MA004950A0, Cusabio, Китай) разведение 1:3000), антитело к FABP4 (MA5-29255, Invitrogen, CША) разведение 1:2000, антитело к PPAR gamma (AF6284, Affinity Biosc., Китай) разведение 1:2000, антитело к перилипину 1 (DF7602, Affinity Biosc., Китай) разведение 1:2000, HRP-коньюгированные антикроличьи и антимышиные антитела (Cloud-Clone Corp., Китай), разведение 1:3000. Далее мембрану инкубировали с системой детектирования Affinity ECL субстрат для Вестерн блоттинга (KF8001, Affinity Biosc., Китай). Визуализацию осуществляли на системе ChemiDoc Touch (Bio-Rad, США). Плотность полос оценивали с помощью компьютерной программы ImageLab. Полученные результаты стандартизировали по уровню CD63 в ВВ и уровню соответствующих протеинов в ВВ больных с полипами толстой кишки с метаболическими нарушениями. В качестве стандарта молекулярной массы использовали MagicMark XP Western Protein Standard (LC5603, Life Technologies, США).

Статистическая обработка.

Для всех видов анализа статистически значимыми считались различия при уровне значимости р < 0,05. Проверка нормальности распределения исследуемых выборок проводилась с использованием критерия Шапиро–Уилка. В таблице и на рисунках данные представлены как медианы с интерквартильным размахом. Для оценки значимости различий в выборках использовал критерий Краскал–Уоллиса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделенные ВВ при трансмиссионной электронной микроскопии визуализировались как округлые мембранные структуры размером не более 220 нм. Также в препаратах присутствовали немембранные структуры обычно размером не более 100 нм — “не-везикулы”. Выделенные везикулы экспрессировали CD9, СD81, CD63, CD24. Средняя концентрация циркулирующих ВВ у больных ПТК и КРР значимо не отличалась и составила 25.1 ± 2.33 × 109 и 24.0 ± 4.92 × 109 частиц/мл крови, соответственно. Cредний размер везикул у больных ПТК с полипами составил 95.3±11.1 нм, у больных КРР — 96.2 ± 9.70 нм (рис. 1).

 

Рис. 1. Идентификация изолированных ВВ. (a) — ТЭМ показала наличие везикул с типичной морфологией и отсутствие везикул размером более 220 нм. На вставках показаны малые ВВ. Масштабные линии соответствуют 100 нм. Электронная микроскопия, отрицательное окрашивание уранилацетатом; (b) — данные анализа NTA для ВВ, изолированных из плазмы крови больных КРР и ПТК (CRC and CP). Ось абсцисс представляет собой размер частиц (нм), ось ординат — концентрацию частиц (частиц/мл), вспомогательная ось — кумулятивная частота (%). (c) — Экспрессия CD63, CD81 и CD24 на CD9-положительных sEV КРР и ПТК плазмы крови. Показаны репрезентативные средние значения интенсивности флуоресценции (MFI), каждое измерение выполнялось трижды. Для изотипического контроля (гистограмма справа) меченные комплексы частицы-антитело к CD9-sEV инкубировали с мышиным FITC IgG1 контрольным изотипом или FITC IgG2a контрольным изотипом. Показан один из репрезентативных изотипических контролей. В качестве отрицательного контроля к латексным частицам, меченным антителами CD9 (гистограмма слева), ничего не добавляли. Так же ставили отрицательный контроль, когда покрытые частицы инкубировали с антителами, коньюгированными с FITC без добавления везикул (гистограмма в центре).

 

Образцы ВВ пяти больных из всех групп были использованы для анализа концентрации, среднего размера везикул и общего белка во фракциях ВВ до иммунопреципитации, в супернатантах после иммунопреципитации на анти-CD11b латексных частицах и после последовательной иммунопреципитации на анти- CD11b и анти-FABP4 латексных частицах (рис. 2). Максимальная концентрация везикул отмечена у больных КРР с метаболическим синдромом. Концентрация везикул у больных с ПТК c метаболическим синдромом практическим в 2 раза ниже, а у больных с КРР без метаболических нарушений — в 8 раз ниже по сравнению с больными с КРР с синдромом, p < 0.05, n = 5 (рис. 2а). Во всех группах концентрация везикул несколько снижалась при удалении везикул моноцитарно-макрофагального ряда методом иммунопреципитации и далее снижалась крайне незначительно после удаления из супернатанта еще и FABP4-позитивных ВВ. Аналогичная динамика выявлена и для белка ВВ (рис. 2c).

 

Рис. 2. Концентрация, размер ВВ и уровень общего белка во фракциях и супернатанте при иммунопреципитации. (a) — концентрация ВВ в препаратах: 1 — до иммунопреципитации, 2 — в супернатанте после иммунопреципитации CD11b-позитивных ВВ, 3 — в супернатанте после последовательной иммунопреципитации CD11b-позитивных и FABP4-позитивных ВВ у больных КРР с метаболическими нарушениями (CRC+МS) (темные боксы), у больных ПТК с метаболическими нарушениями (СP+MS) (штрихованные боксы), и больных КРР без метаболических нарушений (CRC without MS) (светлые боксы). * — различия достоверны по сравнению с концентрацией ВВ у больных CP+MS и CRC without MS, p < 0.05. (b) — средний размер везикул у больных в супернатантах до и после иммунопреципитации; (с) — концентрация белка в образцах ВВ больных в супернатантах до и после иммунопреципитации, ** — различия достоверны по сравнению с концентрацией белка в везикулах у больных CRC without MS, p < 0.05. (d) — данные анализа NTA в образцах циркулирующих ВВ больных до иммунопреципитации (слева) и после иммунопреципитации СD11b-позитивных ВВ (справа). Ось абсцисс представляет собой размер частиц (нм), ось ординат — концентрацию частиц (частиц/мл), вспомогательная ось — кумулятивная частота (%).

 

После удаления везикул моноцитарно-макрофагального происхождения фракции по размеру становятся более гомогенными по размеру частиц (рис. 2d), а средний размер везикул несколько уменьшался у больных с ПТК с метаболическими нарушениями и у больных КРР без метаболических нарушений. До иммунопреципитации средний размер везикул у больных ПТК с метаболическими нарушениями и у больных КРР без метаболических нарушений составил 95.3 ± 11.0 нм и 106.7 ± 6.04 нм, соответственно, а после иммунопреципитации — 77.7 ± 4.00 нм и 91.7 ± 5.02 нм, соответственно, p < 0.05, n = 5. В тоже время, у больных КРР с метаболическими нарушениями средний размер везикул до и после иммунопреципитации практически не изменился, 91.0 ± 2.51 нм и 92.7 ± 3.05 нм, соответственно, p > 0.05, n = 5 (рис. 2d).

Уровень FABP4, перилипина 1 и PPAR-ý во фракциях циркулирующих ВВ у больных с метаболическими нарушениями и без них представлен на рисунке 3. Видно, что все фракции циркулирующих везикул содержат комплекс адипоцитарных маркеров (FABP4, PPARý и перилипин 1). Необходимо отметить, что преципитированные на CD11b-покрытых частицах ВВ моноцитарно-макрофагального происхождения у больных КРР без ожирения характеризовались сочетанной гиперэкспрессией FABP4 и перилипина 1, в то время как для больных КРР с метаболическим синдромом или ожирением о такая гиперэкспрессия была нехарактерна (рис.3b). Истинно адипоцитарные везикулы, как мы полагаем, находятся преимущественно в препаратах после удаления из них везикул моноцитарно-макрофагального происхождения. Эта фракция характеризовалась наличием у всех больных комплекса адипоцитарных маркеров с преимущественной экспрессией в ней FABP4 как у больных с метаболическим синдромом/метаболически здоровым ожирением, так и больных без метаболических нарушений (рис. 3с).

 

Рис. 3. Уровни FABP4, перилипина-1 и PPAR-ý во фракциях циркулирующих ВВ после иммунопреципитации ВВ на латексных частицах, покрытых антителами к FABP4 (a), к CD11b (b) и в супернатанте после удаления ВВ моноцитарно-макрофагального происхождения (c) у больных КРР без метаболических нарушений (светлые столбцы) и КРР с метаболическими нарушениями (штрихованные столбцы) по сравнению с больными с полипами толстой кишки с метаболическими нарушениями (CP). RU — условные единицы. Дорожки 1, 2, 3 — больные КРР без метаболических нарушений, 4-7 — больные КРР с метаболическими нарушениями, 8-10 — полипы толстой кишки с метаболическими нарушениями (3а, 3b). Дорожки 1, 2 — больные КРР без метаболических нарушений, 3-5 — больные КРР с метаболическими нарушениями, 6-7 — полипы толстой кишки с метаболическими нарушениями (3с). Вестерн блоттинг. * — различия достоверны по сравнению с группой больных КРР без метаболических нарушений, p < 0.05, n = 20.

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проблема как качественной, так и количественной идентификации циркулирующих ВВ адипоцитарного происхождения обусловлена, с одной стороны, известным фактом, что несколько типов клеток жировой ткани, включая адипоциты, макрофаги, мезенхимальные стволовые клетки и эндотелиальные клетки жировой ткани секретируют везикулы, которые, в свою очередь, действуют паракринным или эндокринным образом, опосредуют межклеточные и межорганные взаимосвязи [9]. С другой стороны, ранее было показано, что неассоциированные с жировой тканью моноциты и макрофаги, например, макрофаги ткани легких, селезенки, макрофаги атеросклеротических бляшек, а также, например, высокоспециализированные клетки крипт тонкого кишечника — клетки Панета также экспрессируют классические адипоцитарные маркеры, везикулы от которых могут находиться в циркуляции [10–12].

Аналогичная предлагаемой методика ранее использовалась для характеристики ВВ адипоцитарного происхождения, находящихся в циркуляции у человека, где были представлены убедительные данные, что сочетание CD9, FABP4, PPAR-ý, адипонектина и перилипина 1 в выделенных из плазмы крови ВВ с наибольшей вероятностью детектирует именно ВВ адипоцитарного происхождения [3]. FABP4 является переносчиком жирных кислот, который преимущественно экспрессирован на адипоцитах и макрофагах. Он связывает длинноцепочечные жирные кислоты и ретиноевую кислоту, а также транспортирует их в ядро. FABP4 является популярным и часто используемым маркером ВВ адипоцитарного происхождения, имеющим определенные преимущества перед другими кандидатными маркерами (адипонектин, PPAR-ý, перилипин 1) такие как, высокая концентрация и поверхностная локализация маркера на ВВ, позволяющая использовать удобный и высокопроизводительный метод проточной цитометрии для детекции таких везикул [4, 13, 14]. Хотя нельзя исключать, что FABP4 как секретируемый белок, присутствующий в плазме крови в растворимом виде, сорбируется также в так называемой “короне” ВВ [4]. Анализ ВВ, выделенных из ex vivo культур эксплантатов жировой ткани человека, выявил как адипонектин-положительные, так и адипонектин-отрицательные подгруппы с помощью дифференциального ультрацентрифугирования в сочетании с иммуноблоттингом. Однако, поскольку адипонектин в везикулах детектировался иммуноблоттингом, остается неизвестным, находится ли адипонектин на поверхности или внутри адипоцитарных ВВ [15, 16]. Уровень циркулирующих ВВ, позитивных по перилипину 1 резко увеличился как у мышей с диет-индуцированным ожирением, так и у пациентов с ожирением. Кроме того, у людей с ожирением уровень перилипин-позитивных циркулирующих ВВ положительно коррелировал с уровнем инсулина в плазме и индексом инсулинорезистепнтности HOMA-IR. Это также нацеливает в перспективе на возможность использования перилипин-1-позитивных ВВ как биомаркера инсулинорезистентности, однако этот маркер может быть определен только иммуноблоттингом [6]. Используя FABP4 в качестве маркера для идентификации адипоцитарных ВВ в кровотоке, Hubal и соавт. обнаружили, что содержание микроРНК в циркулирующих адипоцитарных ВВ, нацеленных на различные гены в каноническом пути передачи сигналов, опосредованного рецептором инсулина, значительно изменилось через 1 год после бариатрической хирургии. Эти изменения были связаны с уменьшением инсулинорезистентности, что позволяет предположить, что FABP4-положительные ВВ могут быть полезны для мониторинга метаболического статуса пациентов с ожирением после хирургического вмешательства [14].

Фракция супернатанта ВВ после удаления из нее CD11b- позитивных ВВ в нашем исследовании с большой долей вероятности представляет фракцию, содержащую ВВ преимущественно адипоцитарного происхождения. Cудя по полученным данным в этой фракции во всех клинических группах уровень FABP4 был несколько выше по сравнению с другими адипоцитарными маркерами, однако все изученные адипоцитарные маркеры присутствовали в этой фракции ВВ (рис.3с). При анализе фракции СD11b-иммунопреципитированных ВВ выявлено, что также у всех пациентов эта фракция содержит комплекс маркеров FABP4, перилипин 1 и PPAR-ý, однако соотношение белков различно. У больных КРР с нормальной или сниженной массой тела уровень FABP4 в этой фракции в 24 раза выше по сравнению с больными с ПТК с метаболическим синдромом или ожирением и практически в 19 раз выше по сравнению с КРР с метаболическим синдромом или ожирением (рис. 3b). Из этого следует, что у больных без метаболических нарушений, по-видимому, для более корректной характеристики циркулирующих ВВ сначала из препаратов ВВ необходимо удалить методом иммунопреципитации или аналогичными методиками фракцию CD11b-позитивных моноцитарно-макрофагальных ВВ, а в супернатанте после удаления/cорбции преципитированных ВВ можно изучать состав адипоцитарных везикул, например, используя предлагаемый набор маркеров. Причем у больных с метаболическими нарушениями с учетом незначительной экспрессии FABP4 в составе CD11b-иммунопреципитированных ВВ, по-видимому, предварительная деплеция препаратов везикул не столь необходима.

При выполнении проточной цитометрии с укрупнением везикул на латексных или магнитных частицах для изучения циркулирующих адипоцитарных везикул наиболее перспективно и логично использовать покрытые антителами к FABP4 частицы или при работе по методологии прямой детекции ВВ — после выполнения калибровки с калибровочными частицами — окрашивать ВВ комплексом антител, включающим FABP4 antibody, как в исследовании Gustafson с соавт. [4].

ВКЛАДЫ АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (Н.В.Ю., И.В.К.), сбор данных (О.В.Ч., К.Д.Н., А.Ю.Д.), обработка данных (Д.А.С., Е.С.К.), экспериментальные работы (Е.С.К., Н.В.Ю., Д.А.С., Е.А.С., А.Е.Г.) написание и редактирование манускрипта (Н.В.Ю., И.В.К.).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Исследование проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией и одобрено Этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ (протокол №5 от 10 февраля 2019 г.). Информированное согласие было получено от всех пациентов, участвовавших в исследовании.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-00085, https://rscf.ru/project/23-25-00085/

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы приносят благодарность Татьяне Александровне Штам, старшему научному сотруднику группы клеточных и биомедицинских технологий НИЦ “Курчатовский институт”, ПИЯФ, Санкт-Петербург, канд биол. наук за выполнение блока работы анализ траектории частиц выделенных везикул.

×

About the authors

N. V. Yunusova

Siberian State Medical University, Department of Biochemistry and Molecular Biology with a course of clinical laboratory diagnostics

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

D. A. Svarovsky

Siberian State Medical University, Department of Biochemistry and Molecular Biology with a course of clinical laboratory diagnostics

Author for correspondence.
Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

E. S. Kolegova

Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

O. V. Cheremisina

Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

D. N. Kostromitsky

Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

I. V. Kondakova

Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

E. A. Sidenko

Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

A. Yu. Dobrodeev

Cancer Research Institute, Tomsk National Research Medical Center

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Tomsk

A. E. Grigor’eva

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of Russian Academy of Science

Email: svarovsky.d.a@gmail.com
Russian Federation, Novosibirsk

References

  1. Yunusova NV, Kondakova IV, Kolomiets LA, Afanas'ev SG, Kishkina AY, Spirina LV (2018) The role of metabolic syndrome variant in the malignant tumors progression. Diabetes Metab Syndr. 12(5):807–812. https://doi.org/10.1016/j.dsx.2018.04.028.
  2. Borisov AV, Zakharova OA, Samarinova AA, Yunusova NV, Cheremisina OV, Kistenev YV. (2022) A Criterion of Colorectal Cancer Diagnosis Using Exosome Fluorescence-Lifetime Imaging. Diagnostics (Basel). 12(8):1792. https://doi.org/10.3390/diagnostics12081792
  3. Connolly KD, Wadey RM, Mathew D, Johnson E, Rees DA, James PE (2018) Evidence for Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles in the Human Circulation. Endocrinology. 159(9):3259–3267. https://doi.org/10.1210/en.2018-00266
  4. Gustafson CM, Shepherd AJ, Miller VM, Jayachandran M (2015) Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6:10. https://doi.org/10.1186/s13293-015-0028-8
  5. Furuhashi M (2019) Fatty Acid-Binding Protein 4 in Cardiovascular and Metabolic Diseases. J Atheroscler Thromb. 26(3):216–232. https://doi.org/10.5551/jat.48710
  6. Eguchi A, Lazic M, Armando AM, Phillips SA, Katebian R, Maraka S, Quehenberger O, Sears DD, Feldstein AE (2016) Circulating adipocyte-derived extracellular vesicles are novel markers of metabolic stress. J Mol Med (Berl). 94(11):1241–1253. https://doi.org/10.1007/s00109-016-1446-8
  7. DeClercq V, d'Eon B, McLeod RS (2015) Fatty acids increase adiponectin secretion through both classical and exosome pathways. Biochim Biophys Acta 1851(9):1123–1133. https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2015.04.005
  8. Yunusova N, Kolegova E, Sereda E, Kolomiets L, Villert A, Patysheva M, Rekeda I, Grigor'eva A, Tarabanovskaya N, Kondakova I, Tamkovich S (2021) Plasma Exosomes of Patients with Breast and Ovarian Tumors Contain an Inactive 20S Proteasome. Molecules. 26(22):6965. https://doi.org/10.3390/molecules26226965
  9. Huang Z, Xu A (2021) Adipose Extracellular Vesicles in Intercellular and Inter-Organ Crosstalk in Metabolic Health and Diseases. Front Immunol. 12:608680. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.608680
  10. Persson J, Degerman E, Nilsson J, Lindholm MW (2007) Perilipin and adipophilin expression in lipid loaded macrophages. Biochem Biophys Res Commun. 363(4):1020–1026. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2007.09.074
  11. Namgaladze D, Kemmerer M, von Knethen A, Brüne B (2013) AICAR inhibits PPARγ during monocyte differentiation to attenuate inflammatory responses to atherogenic lipids. Cardiovasc Res. 98(3):479–487. https://doi.org/10.1093/cvr/cvt073
  12. Su X, Yan H, Huang Y, Yun H, Zeng B, Wang E, Liu Y, Zhang Y, Liu F, Che Y, Zhang Z, Yang R (2015) Expression of FABP4, adipsin and adiponectin in Paneth cells is modulated by gut Lactobacillus. Sci Rep. 5:18588. https://doi.org/10.1038/sreP18588
  13. Kralisch S, Ebert T, Lossner U, Jessnitzer B, Stumvoll M, Fasshauer M. (2015) Adipocyte fatty acid-binding protein is released from adipocytes by a non-conventional mechanism. Int J Obes (Lond). 38(9):1251–1254. https://doi.org/10.1038/ijo.2013.232
  14. Hubal MJ, Nadler EP, Ferrante SC, Barberio MD, Suh JH, Wang J, Dohm GL, Pories WJ, Mietus-Snyder M, Freishtat RJ (2017) Circulating adipocyte-derived exosomal MicroRNAs associated with decreased insulin resistance after gastric bypass. Obesity (Silver Spring). 25(1):102–110. https://doi.org/10.1002/oby.21709
  15. Kranendonk ME, Visseren FL, van Balkom BW, Nolte-'t Hoen EN, van Herwaarden JA, de Jager W, Schipper HS, Brenkman AB, Verhaar MC, Wauben MH, Kalkhoven E (2014) Human adipocyte extracellular vesicles in reciprocal signaling between adipocytes and macrophages. Obesity (Silver Spring). 22(5):1296–1308. https://doi.org/10.1002/oby.20679
  16. Phoonsawat W, Aoki-Yoshida A, Tsuruta T, Sonoyama K (2014) Adiponectin is partially associated with exosomes in mouse serum. Biochem Biophys ResCommun 448:1–266. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.04.11447

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Identification of isolated EVs. (a) TEM showed the presence of vesicles with typical morphology and the absence of vesicles larger than 220 nm. Insets show small EVs. Scale bars represent 100 nm. Electron microscopy, negative staining with uranyl acetate; (b) NTA assay data for EVs isolated from CRC and CP plasma. The abscissa axis represents particle size (nm), the ordinate axis represents particle concentration (particles/mL), and the minor axis represents cumulative frequency (%). (c) Expression of CD63, CD81, and CD24 on CD9-positive CRC and CP plasma sEVs. Representative mean fluorescence intensities (MFIs) are shown; each measurement was performed in triplicate. For isotype controls (right histogram), labeled anti-CD9-sEV particle-antibody complexes were incubated with mouse FITC IgG1 isotype control or FITC IgG2a isotype control. One representative isotype control is shown. As a negative control, nothing was added to CD9 antibody-labeled latex particles (left histogram). A negative control was also set up where coated particles were incubated with FITC-conjugated antibodies without the addition of vesicles (center histogram).

Download (421KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Concentration, size of EVs, and total protein level in fractions and supernatant during immunoprecipitation. (a) — EV concentration in preparations: 1 — before immunoprecipitation, 2 — in supernatant after immunoprecipitation of CD11b-positive EVs, 3 — in supernatant after sequential immunoprecipitation of CD11b-positive and FABP4-positive EVs in patients with CRC with metabolic disorders (CRC+MS) (dark boxes), in patients with PTC with metabolic disorders (CP+MS) (shaded boxes), and CRC patients without metabolic disorders (CRC without MS) (light boxes). * — differences are significant compared to EV concentration in patients with CP+MS and CRC without MS, p < 0.05. (b) — average vesicle size in patients in supernatants before and after immunoprecipitation; (c) — protein concentration in EV samples from patients in supernatants before and after immunoprecipitation, ** — differences are significant compared to protein concentration in vesicles from patients with CRC without MS, p < 0.05. (d) — NTA analysis data in circulating EV samples from patients before immunoprecipitation (left) and after immunoprecipitation of CD11b-positive EV (right). The abscissa axis represents particle size (nm), the ordinate axis represents particle concentration (particles/ml), and the auxiliary axis represents cumulative frequency (%).

Download (279KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Levels of FABP4, perilipin-1, and PPAR-ý in circulating EV fractions after EV immunoprecipitation on latex particles coated with antibodies to FABP4 (a) and to CD11b (b) and in the supernatant after removal of EV of monocyte-macrophage origin (c) in patients with CRC without metabolic disorders (light columns) and CRC with metabolic disorders (shaded columns) compared to patients with colon polyps with metabolic disorders (CP). RU — arbitrary units. Lanes 1, 2, 3 — CRC patients without metabolic disorders, 4-7 — CRC patients with metabolic disorders, 8-10 — colon polyps with metabolic disorders (3a, 3b). Lanes 1, 2 — CRC patients without metabolic disorders, 3-5 — CRC patients with metabolic disorders, 6-7 — colon polyps with metabolic disorders (3c). Western blotting. * — differences are significant compared to the group of CRC patients without metabolic disorders, p < 0.05, n = 20.

Download (156KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».