Role of apoptosis-associated proteins p53 and bcl-2 in the pathogenesis of nervous system diseases

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Согласно данным, опубликованным в 2012 г., ежегодные затраты на обследование и лечение заболеваний головного мозга превышают стоимость всех других заболеваний вместе взятых, включая сердечно-сосудистые болезни, злокачественные новообразования и диабет. Эти затраты будут расти по мере старения населения, поскольку именно возраст является основным фактором риска нейродегенеративных заболеваний. Более молодые категории населения поражают другие заболевания нервной системы, среди которых расстройства аутистического спектра (РАС), шизофрения и умственная отсталость. Крайние возрастные категории уязвимы для эпилепсии, для депрессии возраст значения почти не имеет.

Всемирная организация здравоохранения пришла к выводу, что на заболевания головного мозга приходится примерно треть общего бремени болезней в Европе. Разработка лекарств против них затруднена, а имеющиеся препараты чаще всего могут лишь отсрочить начало заболевания или облегчить симптомы. Одной из основных проблем здесь является отсутствие идентифицированных мишеней для лекарств, поскольку молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе ряда заболеваний нервной системы, изучены не до конца. Чтобы изменить это, необходимы большие усилия по изучению этиологии и патогенетических механизмов нарушений как развивающегося, так и взрослого мозга [1].

Дегенеративные процессы и гибель нейронов являются важными признаками различной патологии ЦНС: от нейродегенеративных заболеваний и эпилепсии, до последствий травм. Выделяют более 12 типов клеточной гибели, среди которых внутренний и внешний апоптоз, онкоз, некроптоз, партанатоз, ферроптоз, сармоптоз, аутофагия, аутоз, автолиз, параптоз, пироптоз, фагоптоз и переход митохондриальной проницаемости. Несмотря на десятилетия исследований и тысячи статей, роль каждого из них до конца еще не раскрыта [2].

В патогенезе многих заболеваний нервной системы, среди которых эпилепсия, особенно фармакорезистентная, наибольшее значение имеет апоптоз нейронов и глиальных клеток головного мозга, роль которого и будет рассмотрена [3].

Целью данной работы была оценка роли апоптоз-ассоциированных белков р53 и Bcl-2 в патогенезе различных заболеваний нервной системы, острых и хронических, и поиск общих закономерностей изменений их экспрессии и коэкспрессии в нервной системе при патологии. Несмотря на значительное количество работ, посвященных изменению уровня данных белков при различных неврологических проблемах, в настоящее время нет работ, обобщающих уже полученные данные. В связи с этим мы представляем анализ современных исследований, как экспериментальных, так и клинических, представляющих данные о механизмах апоптоза при различных заболеваниях нервной системы, и особое внимание уделено роли проапоптотического белка р53 и антиапоптотического Bcl-2.

Апоптоз в патогенезе заболеваний нервной системы

Рассмотрим примеры некоторых заболеваний и роль апоптоза в их патогенезе.

Ишемический инсульт, вызванный артериальной окклюзией, является распространенным типом инсульта, который входит в число наиболее частых причин инвалидности и смертности во всем мире. Для уменьшения его последствий необходимо быстрое нейропротекторное вмешательство, но точные механизмы гибели нейронов остаются неизученными, что ограничивает разработку лекарств. Основной проблемой терапии инсульта является поиск эффективного нейропротектора [4]. В патогенезе ишемического инсульта участвуют несколько путей клеточной гибели, включая апоптоз, опосредуемый внутренним и внешнерецепторным путями, некроптоз, аутофагию, ферроптоз, партанатоз, фагоптоз и пироптоз. При возникновении инсульта нарушается транспорт кислорода, глюкозы и других субстратов. Нейроны при этом переходят от аэробного окисления к анаэробному, а потребление АТФ быстро превышает его синтез. Падение его концентрации в нейронах снижает ионные градиенты, а также ухудшает приток Na⁺/Ca²⁺ и отток K⁺. Нарушение работы ионных каналов вызывает деполяризацию нейронов и высвобождает огромное количество возбуждающих нейротрансмиттеров, таких как глутамат. Впоследствии Ca²⁺ запускает внутренний путь апоптоза, а также некоторые другие цитоплазматические и ядерные события, ведущие нейрон к гибели. Перегрузка Ca²⁺ запускает активацию кальпаина, а одним из основных субстратов кальпаина является антиапоптотический белок Bcl-2. Во время ишемии в нейронах также имеет место повреждение ДНК, ответом на которое становится активация р53. При восстановлении кровотока после ишемии образуется большое количество активных форм кислорода (АФК), что также запускает апоптоз. Нарушения проницаемости гематоэнцефалического барьера и сигнальные молекулы, такие как цитокины, высвобождаемые астроцитами, микроглией и олигодендроцитами, запускают воспалительные каскады, продолжающие работу дни и недели после ишемии. Активация иммунных клеток во время воспаления может инициировать внешний путь апоптоза через TNF-α/β, лиганд Fas (FasL) и рецептор-лиганд, индуцирующий апоптоз, связанный с TNF (TRAIL-R) [5, 6].

Несмотря на значительный прогресс в изучении шизофрении, этиология и патофизиология этого сложного заболевания остаются неясными. Большинство причин имеют наследственный характер, но нельзя отрицать и роль других факторов, таких как материнские инфекции, недоедание, употребление каннабиса и психосоциальный стресс. Есть предположение, что шизофрения может включать ограниченный нейродегенеративный процесс, который начинает проявляться с появлением клинических симптомов. В его основе может лежать апоптоз. Большинство посмертных и нейровизуализационных исследований больных шизофренией показало небольшие изменения в структуре мозга. Среди них уменьшение коры, снижение числа синапсов, плотности дендритных отростков и уменьшение длины дендритов без масштабной потери нейронов. Аналогичные изменения происходят в гиппокампе. Однако исследования также показывают региональное и послойное снижение плотности пирамидных и непирамидных нейронов в коре и гиппокампе. Эти изменения носят прогрессивный характер на разных стадиях шизофрении. Основная потеря серого вещества при этом происходит не за счёт гибели нейронов целиков, а локально — в синапсах, дендритах, аксонах. Апоптоз участвует в патогенезе шизофрении, но не является основным патогенетическим фактором [7]. Одним из факторов риска шизофрении признаны дефекты митохондрий, как наследственные, так и приобретённые, но связанные с воспалительными и апоптотическими процессами в нейронах. Гипофункция митохондрий нарушает синаптическую передачу, метаболизм кальция и активность потенциалов действия, что приводит к аномальной работе нейронов [8].

Молекулярный патогенез расстройств аутистического спектра (РАС) до сих пор так же неясен, как и в случае с шизофренией. До сих пор полностью не раскрыты функциональные и молекулярные изменения в мозге пациентов с РАС. Тем не менее, РАС приводят к значительной смертности среди детей, проблемам с социализацией, общением и поведенческими нарушениями. В мозге больных обнаружены следующие изменения: чрезмерный рост аксонов и дендритов, гибель гранулярных клеток, снижение количества, атрофия клеток Пуркинье в мозжечке, аберрантная миелинизация. К таким изменениям может привести патологическая активация нейровоспалительных и апоптотических путей. Имеющиеся данные позволяют предположить, что клеточный стресс, окислительный стресс и апоптоз могут способствовать развитию аутистического фенотипа [9, 10]. С помощью методов транскриптомики выявлены аберрантные синаптические, метаболические, пролиферационные, иммунные механизмы, сигнальные каскады апоптоза, участвующие в патогенезе РАС. Такие изменения характерны и для наследственных заболеваний, предрасполагающих к аутизму, таких как синдром Ретта и ломкая Х-хромосома. В наибольшей степени поражаются мозжечок и лобная кора. Исследования мозга больных показывают снижение уровней экспрессии антиапоптотических белков, либо увеличение экспрессии проапоптотических белков в лобной коре головного мозга и мозжечке при РАС [11].

Недавние исследования показали, что митохондриальная дисфункция, нарушение регуляции нейровоспалительных и апоптотических путей участвуют в патофизиологии большого депрессивного расстройства [12]. Cеквенирование РНК из образцов периферической крови десяти подростков с большим депрессивным расстройством и десяти здоровых подростков из контрольной группы, выявило 18 930 дифференциально экспрессируемых генов, среди которых были гены, участвующие в апоптозе [13].

Апоптоз нейронов и глиальных клеток головного мозга имеет большое значение в патогенезе эпилепсии, особенно её лекарственно-устойчивых форм. С каждым припадком апоптоз вызывает нарастающие повреждения головного мозга, что особенно проявляется в гиппокампе, приводя, в том числе, к развитию лекарственной устойчивости и множеству когнитивных нарушений [14]. В патогенезе эпилепсии задействованы как внешнерецепторный путь апоптоза, активируемый связыванием лигандов с малой молекулярной массой и рецепторов клеточной смерти семейства фактора некроза опухоли (TNF), таких как TNFR1, Fas (CD95), DR4 (TRAIL рецептор 1), DR5 (TRAIL рецептор 2), так и внутренний, митохондриальный, основанный на регуляции проницаемости внешней мембраны митохондрий с помощью белков семейства Bcl-2. При этом активация внешнего пути часто предшествует внутреннему. В этих каскадах задействованы каспазы-3 и -7. Повышение их уровня в эпилептических очагах после судорог не оставляет сомнений в вовлечённости апоптоза в эпилептогенез [15]. Показано, что после судорог возникают многочисленные структурные и функциональные аномалии митохондрий в нейронах, которые в дальнейшем также могут вызывать судороги [16]. Роль апоптоза показана при посттравматической эпилепсии, которая характеризуется развитием отсроченных неспровоцированных припадков после черепно-мозговой травмы и занимает до 20% в общей статистике заболеваемости. Несмотря на значительные усилия, предпринятые для понимания её патогенеза и повышения эффективности лечения, часто эта форма эпилепсии не поддаётся терапии имеющимися препаратами. Как и в случае эпилепсии другого генеза, во время судорог происходит апоптоз нейронов. Более того, повторные приступы повреждают нейроны и вызывают их гибель и вторичную потерю. Исследования выявили типичные признаки апоптоза в поврежденных отделах мозга, такие как повышенные уровни экспрессии каспазы-3 и Bax [17].

Нейродегенеративные расстройства характеризуются прогрессирующей потерей определенных популяций нейронов. Апоптоз участвует в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Гентингтона, боковой амиотрофический склероз.

Болезнь Паркинсона — прогрессирующее неврологическое расстройство, характеризующееся дофаминергической нейродегенерацией в черной субстанции мозга. Семейные формы болезни Паркинсона связаны с мутациями в генах, в большинстве случаев она является идиопатической. Для болезни Паркинсона характерны патологические тельца Леви в нейронах, возникающие в результате агрегации α-синуклеина, который локализуется пресинаптически, особенно в нервных окончаниях. Кроме того, α-синуклеин локализуется в митохондриальной мембране, что приводит к окислительному стрессу и активации внутреннего пути апоптоза. Апоптоз рассматривается как механизм потери дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона, о чем свидетельствует идентификация апоптотических клеток и фрагментация ДНК, сверхэкспрессия активной каспазы-8, -9 и -3, повышенные уровни проапоптотических белков и снижение уровней антиапоптотических белков в дофаминергических нейронах [18].

Болезнь Альцгеймера считается основной формой деменции у пожилых людей. Патологически она характеризуется накоплением β-амилоидных бляшек, нейрофибриллярных клубков и накоплением гиперфосфорилированного тау-белка. Как и в случае с болезнью Паркинсона, β-амилоид накапливается на внешней мембране митохондрий нейронов, запуская окислительный стресс и активируя внутренний каскад апоптоза. В мозге пациентов была обнаружена фрагментация ДНК с помощью метода TUNEL, сниженная экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2, сверхэкспрессия проапоптотического белка BAX и наличие активированной каспазы-3 в нейронах с нейрофибриллярными клубками [18].

Болезнь Гентингтона — это аутосомно-доминантное нейродегенеративное заболевание, которое характеризуется прогрессирующим нарушением координации произвольных движений, а также поведенческими и когнитивными нарушениями. Она вызвана аномальным увеличением числа тринуклеотидных повторов CAG в гене, кодирующем белок гентингтин, следствием чего является дегенерация ГАМКергических нейронов неостриатума у пациентов. Мутантный гентингтин индуцирует апоптоз нейронов и является субстратом для каспазы-3, которая расщепляет его на более мелкие нейротоксичные пептиды, и нарушает равновесие между проапоптотическими и антиапоптотическими молекулами, может взаимодействовать с митохондриями, вызывая их дисфункцию. При болезни Гентингтона показана характерная для апоптоза фрагментация ДНК (TUNEL) [18].

Боковой амиотрофический склероз поражает мотонейроны коры и передних рогов спинного мозга, в результате наблюдается прогрессирующий паралич всех конечностей, дыхательной и глоточной мускулатуры, что приводит к смерти в течение 3–5 лет после начала заболевания. У 20 % пациентов выявлена мутация гена, кодирующего супероксиддисмутазу. Таким образом, патогенез заболевания включает перегрузку нейронов кальцием и окислительный стресс, приводящий к нарушению функции митохондрий и активации внутреннего пути апоптоза. Как и в случае других нейродегенеративных заболеваний, здесь выявлены фрагментация ДНК, активация каспазы-9, сверхэкспрессия BAX и снижение экспрессии Bcl-2 [18].

p53 и апоптоз нейронов

Фактор транскрипции и супрессор опухолей р53 — тетрамерный фосфопротеин, который управляет рядом основных клеточных функций, включая транскрипцию генов, синтез и репарацию ДНК, регуляцию клеточного цикла, старение и гибель клеток. Этот белок является одним из ключевых модуляторов реакции клеток на стресс, активация которого запускает апоптоз в различных типах клеток, в число которых входят и нейроны. Р53 относится к обширному семейству генов, таких как р63 и р73. Все они имеют много общего: ключевые функциональные домены, включая N-концевой домен трансактивации, C-концевой домен олигомеризации и консервативный ДНК-связывающий домен. При сверхэкспрессии р63 и р73 могут брать на себя часть функций р53, активируя те же гены-мишени и индуцируя апоптоз. Однако их роль в апоптозе нейронов до конца не ясна. В отличие от р53, который не играет явной роли в нормальном развитии, р63 необходим для развития некоторых тканей, например, эпителия, а р73 функционирует преимущественно в центральной нервной системе (ЦНС), в укороченной форме p73b выполняя антиапототическую функцию. При обсуждении роли р53 в гибели клеток головного мозга важно различать апоптоз, возникающий в ответ на повреждение или травму, и гибель клеток, происходящую во время нейрогенеза и в норме во взрослом мозге [19].

Р53 — эволюционно консервативный белок, ген которого появился около 600-800 миллионов лет назад у первых многоклеточных животных, и его пути опосредуют подавление опухолевого роста посредством информированного, регулируемого и интегрированного набора ответов на изменения окружающей среды, приводящие либо к гибели клеток, либо к поддержанию клеточного гомеостаза [20]. Белки p53 и MDM2 образуют центральный узел этого пути, который получает стрессовые сигналы через MDM2 и реагирует через p53, модулируя и изменяя множество других путей и функций в клетке. Концентратор MDM2-p53 является одним из хабов, на котором сходятся множество сигнальных путей, чем обусловлена его много функциональность, выходящая за простой запуск апоптоза. Это узел обеспечивает адекватную реакцию клетки стресс различного генеза. По крайней мере, 14 различных сигналов стресса передают информацию MDM2 в узле пути MDM2–p53. Для этих путей характерна избыточность, повышающая надёжность. Он останавливает клеточный цикл как в фазе G1, так и G2, что являются прекрасным примером избыточности путей внутри концентратора MDM2-p53 [21]. Метаболические пути — это еще один большой набор сетей, с которыми активно работает p53. Он запускает транскрипцию TP53-индуцированного регулятора гликолиза и апоптоза (TIGAR), белка, который снижает гликолитическую активность и уровни АФК во время онкогенеза. p53 также индуцирует SCO2 (цитохромоксидазу 2), которая регулирует митохондриальное дыхание. Паркин, белок, кодируемый p53-регулируемым геном в митохондриях, опосредует митофагию после повреждения ДНК и останавливает активность АФК [22]. p53 индуцирует некоторые сестрины, которые дополнительно связывают его с регуляцией АФК и передачей сигналов mTOR. Гены, регулируемые р53, кодирующие PTEN, β-субъединицу 5'-АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK) и туберин (TSC2), регулируют мишень комплекса рапамицина 1 (mTORC1) и mTORC2 у млекопитающих, которые, в свою очередь, играют центральную роль в эффективной трансляции и регуляции роста и деления клеток. Таким образом, для p53 характерны обширные связи с клеточным циклом и метаболическими процессами, а также избыточность способов воздействия на них, что необходимо учитывать при рассмотрении роли этого белка при апоптозе в норме и патологии. Из-за многообразия функций его нельзя рассматривать в отрыве от других происходящих в клетке событий [23].

 

Рис. 1. Роль р53 в апоптозе нейронов.

 

Экспрессия p53 повышена в повреждённых нейронах на моделях острых повреждений, таких как ишемия и эпилепсия, а также в образцах ткани головного мозга, полученных на животных моделях и у пациентов с хроническими нейродегенеративными заболеваниями. Однако не факт, что активация р53 приведёт нейроны к гибели, о чем свидетельствует мышиная модель синдрома Ангельмана, где активность р53 оказывала сублетальное воздействие на нейроны, кульминацией которого не являлась их гибель [24]. Хронический окислительный стресс активировал р53 до уровня, при котором активность каспаз отмечалась лишь в аксонах и дендритах, способствуя их истончению и деградации синапсов [25]. Дефицит р53 или его ингибирование защищает нейроны от широкого спектра острых токсических воздействий, таких как фокальная ишемия [26], гипоксия, ионизирующее излучение [27], введение каиновой кислоты [28], повреждающих ДНК агентов, глутамата. Однако лишённые р53 нейроны мозжечка всё равно гибнут при переносе в среду с низким содержанием калия или воздействии растительного нейротоксина метилазоксиметанола, а постнатальные нейроны коры и гиппокампа не выдерживают действия антибиотика стауроспорина [29].

Концентрация р53 в нейронах быстро нарастает в ответ на повреждения, включая окислительный и метаболический стрессы, гипоксию, гипогликемию, нарушение трофики, избыток кальция в клетках и вирусные инфекции (рис. 1). Общим местом всех этих состояний, объединяющим различные пути передачи сигналов стресса, и инициирующим р53-опосредованный апоптоз, может служить окислительное повреждение ДНК. Окислительное повреждение ДНК специфично. При нём наблюдается модификация оснований гидроксильными радикалами (8-гидрокси-20-дезоксигуанозин), расщепление N-гликозидных связей дезоксинуклеотидов с образованием апурин-апиримидиновых сайтов (AP-сайтов) и разрывы. Оно затрагивает и белки репарации, усиливая повреждения ДНК [30]. Иногда для активации р53 достаточно разрушения ядрышка, что и было предложено в качестве ключевого механизма для интеграции известных стимулов активации p53, но в нейронах подобного не выявлено. При активации р53 подвергается ряду посттрансляционных модификаций, повышающих его стабильность или аффинность связывания ДНК, в числе которых фосфорилирование N-концевых остатков, фосфорилирование по остаткам серина или треонина, ацетилирование остатков в С-концевой области, поли(ADP) рибозилирование, модификация убиквитиноподобным белком SUMO [31]. Модификации р53 могут различаться между популяциями нейронов, зависеть от тяжести повреждений и возраста. За этим следует активация генов, кодирующих проапоптотические белки Bax, BH3, PUMA, Apaf-1, p53 AIP1, PERP, Noxa, и транскрипционная репрессия генов выживания, таких как Bcl2 и IAPs (рис. 1). В дополнение к транскрипционной активации, вызывающей гибель клетки, р53 может прямо запускать апоптоз, действуя на уровне митохондрий. Как фактор транскрипции р53 изучен хорошо, но его роль в апоптозе нейронов не ограничивается этим. В p53-опосредованном апоптозе могут участвовать механизмы, независимые от транскрипционной активности р53. Они могут включать пролонгированную активацию механизмов репарации ДНК, транслокацию Fas-рецепторов на клеточную мембрану, активацию каспаз и транслокацию p53 в митохондрии. Кроме того, р53 может локально действовать в синапсах, опосредуя митохондриальную дисфункцию и синаптическую дегенерацию в ответ на повреждение ДНК, окислительные или эксайтотоксические воздействия. Это может иметь важное значение при различных нейродегенеративных заболеваниях, но точный механизм инициации p53-опосредованной митохондриальной дисфункции в синапсах еще предстоит раскрыть. Возможно, он связан с взаимодействием р53 и антиапоптотического белка семейства Bcl-2 Bcl-xL. Ведущая роль р53 в инициации нейронального апоптоза показана на примере действия его ингибиторов, предотвращающих гибель клеток, антисмысловых олигонуклеотидов или нокаута гена [32].

р53 в нервной системе функционирует как в физиологических условиях, при формировании и развитии ЦНС, так и при неврологических расстройствах, таких как инсульт, болезни Альцгеймера и Паркинсона, синдром Ангельмана, черепно-мозговые травмы, боковой амиотрофический склероз, аутизм, спиноцеребеллярная атаксия и эпилепсия [33].

Апоптоз нейронов играет важную роль в патофизиологии ишемического повреждения головного мозга и его последствиях. После инсульта р53 быстро накапливается в пострадавшей области мозга, где активирует апоптоз нейронов посредством как транскрипционно-зависимых, так и независимых программ. Он быстро перемещается в митохондрии и взаимодействует с проапоптотическими белками семейства Вcl-2, такими как Bcl-xL, которые активируют митохондриальный путь апоптоза, с более высокой эффективностью, чем если бы р53 выступал в своей обычной роли фактора транскрипции. Этот процесс занимает не более часа. Так как выживаемость нейронов, особенно чувствительных к ишемии, прямо пропорциональна времени, прошедшему с момента активации сигнальных каскадов апоптоза, в случае запуска его митохондриального пути шансы клеток выжить после инсульта невелики [34].

Ген-супрессор опухоли p53 человека (TP53) считается геном-кандидатом предрасположенности к шизофрении из-за своих функций в развитии нервной системы. Кроме того, он расположен в области хромосомы 17P13.1, регионе, мутации в которой часто связаны с шизофренией. В исследовании восьми полиморфизмов в этом гене у европейцев обнаружены связи между вариантами заболеваемостью шизофренией на примере 266 пациентов из Торонто, 264 здоровых людей и 162 нуклеарных семей из Португалии. С пациентами проводился структурный клинический опрос для уточнения анамнеза. Затем из образцов их крови была выделена ДНК и проведено генотипирование восьми полиморфизмов в TP53 [35]. Изучение полиморфизмов BstUI в экзоне 4 и MspI в сайтах рестрикции интрона 6 гена p53 методом ПЦР RFLP с использованием ДНК, выделенной из периферической крови у 100 пациентов с шизофренией, 100 — раком легких и 100 здоровых людях контрольной группы выявило существенные различия в частотах генотипов и аллелей [36].

При аутизме наблюдаются незначительное повышение уровней р53, в частности, в клетках Пуркинье и гранулярных клетках мозжечка, подтверждённое вестерн-блоттингом и иммуногистохимическим методом [11].

Кроме того, повышенная экспрессия факторов апоптоза, в том числе белка р53, обнаружена в мозге у пациентов с синдромом Дауна.

Исследования методом вестерн-блоттинга удаленного участка гиппокампа у пациентов с трудноизлечимой височной эпилепсией выявили активацию биохимических путей, связанных с р53-зависимым апоптозом. Уровни p53 у больных превышали таковые в контрольных образцах. Иммуногистохимические методы показали локализацию р53 в ядрах нейронов и глии [37]. Методами иммунофлуоресценции, иммуногистохимии и вестерн-блоттинга отмечалась повышенная экспрессия р53 в ядрах нейронов области СА3 гиппокампа крыс, которым вводили пентилентетразол внутрибрюшинно, по сравнению с контрольной группой, при этом в зубчатой извилине гиппокампа таких различий не было [38]. В образцах мозга пациентов с фокальной лекарственно-устойчивой эпилепсией экспрессия проапоптотического белка р53 в коре головного мозга и белом веществе эпилептического очага и перифокальной зоны была повышена по сравнению с людьми без эпилепсии, что было оценено с помощью вестерн-блоттинга [39].

Подавление р53 прямым или косвенными способами может уменьшить апоптоз, вызванный эпилептическими припадками. Перспективным направлением в настоящее время считается воздействие на микроРНК. МикроРНК широко экспрессируются в ЦНС и играют важную роль в патогенезе ряда неврологических расстройств, включая эпилепсию. Во множестве исследований отмечено нарушение экспрессии различных микроРНК в затронутом эпилепсией гиппокампе по сравнению с контролем [40].

Было бы ошибкой считать ингибирование р53 универсальным методом борьбы с эпилепсией, в ряде случаев может наступить ухудшение. Это показал эксперимент с эпилептическим статусом у мышей дикого типа и животных с недостатком р53. Анализ электроэнцефалограммы (ЭЭГ) во время эпилептического статуса, индуцированного введением каиновой кислоты в область миндалевидного тела, показал, что у генетически модифицированных мышей с дефицитом р53 судороги длились значительно дольше по сравнению с животными дикого типа по данным электроэнцефалографии. Тем не менее, гибель нейронов в зоне CA3 гиппокампа и неокортексе была значительно снижена через 72 часа у мышей с дефицитом p53. При этом повреждение гиппокампа у них было сопоставимым [41].

Болезнь Альцгеймера — форма деменции, которая проявляется потерей памяти, когнитивными дисфункциями, изменениями личности вследствие появления бляшек β-амилоида (Aβ), нейрофибриллярных клубков, нейровоспаления и потери нейронов. В мозге пациентов наблюдается повышенная экспрессия р53 в глиальных клетках и в нейронах височной коры. Он же участвует в дегенерации нейронов мозжечка и амилоидогенном процессе его старения. К основным признакам болезни Паркинсона относятся содержащие α-синуклеин тельца Леви, утрата дофаминергических нейронов чёрной субстанции и атрофия серого вещества. При посмертном исследовании мозга больных в нём обнаруживается высокое содержание р53. Р53 участвует в патогенезе семейных форм болезни. Сверхэкспрессия р53 ослабляет митохондриальный перенос Ca²⁺, вызывая дисфункцию митохондрий и прогрессирование заболевания. Активация р53 в ответ на нейродегенеративный стресс тесно связана с дегенерацией дофаминергических нейронов, сопровождающейся митохондриальной дисфункцией, выработкой АФК, аномальной агрегацией белков и нарушением аутофагии [42].

Болезнь Гентингтона — наследственное заболевание нервной системы, результат умножения CAG повтора свыше 36 копий в открытой рамке считывания гена HTT, кодирующего белок гентингтин с неизвестной функцией. Для этой болезни характерно позднее проявление. Атрофия полосатого тела и потеря нейронов приводит к появлению психиатрических симптомов. Мутантный белок M-Htt присоединяется к p53 и усиливает ядерный p53 и транскрипционную активность. Ингибирование р53 и усиление активности SIRT1 ресвератролом являются важными механизмами нейропротекции в борьбе с симптомами болезни согласно результатам исследования экспрессии miR-34a, b и c у мышей линии R6/2 в мозге, печени и скелетных мышцах [43].

р53 можно рассматривать как основной фактор нейродегенерации, вызванной метамфетамином [44].

Таким образом, для описанных заболеваний нервной системы (эпилепсии, шизофрении, расстройствах аутистического спектра, болезни Альцгеймера и Гентингтона и др.) характерна патологическая гибель нейронов и глиальных клеток, в основном путём апоптоза, и р53 играет здесь ведущую роль (Рис. 3). Экспериментальные данные указывают на него как на перспективную мишень для лекарственных препаратов, но в каждом отдельном случае требуется дополнительное исследование, так как существуют другие механизмы апоптоза, кроме р53-зависимого, и другие формы гибели клеток. Подавление апоптоза при эпилепсии, например, может способствовать выживанию аберрантных нейронов, прогрессированию болезни и развитию лекарственной устойчивости, либо привести клетки на более опасный путь некроза.

Bcl-2 и апоптоз нейронов

В 1988 году было обнаружено, что белок Bcl-2 (B Cell Lymphoma/Leukaemia 2) массой 26 кДа способствует развитию злокачественных опухолей, не давая их клеткам погибнуть, но при этом не усиливая пролиферацию. Единственным белком, с которым Bcl-2 имел гомологию, был белок вируса Эпштейна-Барр (EBV), известный как BHRF1. Появление молекулярных технологий в 1970-х и 1980-х годах имело решающее значение для исследований функции Bcl-2, а клонирование мышиного гомолога Bcl-2 в 1987 году позволило начать его исследование на животных. Ген Bcl-2 был идентифицирован в результате исследования хромосомной транслокации t(14;18), которая обнаруживается почти во всех фолликулярных лимфомах [45].

Впоследствии было показано, что экспрессия Bcl-2 может защищать клетки от стресса, вызванного различными факторами, в числе которых тепловой шок, различные цитотоксические агенты, такие как метотрексат, и ионизирующее излучение. Затем были открыты и другие белки со сходным строением. Белки семейства Bcl-2 эволюционно консервативны и имеют общие домены гомологии Bcl-2 (BH). Гены Bcl-2 возникли, по-видимому, у предка многоклеточных до разделения стрекающих и двустороннесимметричных животных и были идентифицированы даже у пластинчатых и губок, при этом их нет и не было у гребневиков, а некоторые нематоды их вторично утратили. Семейство Bcl-2 состоит из двух групп белков, одна из которых имеет α-спиральную складку Bcl-2 и присутствует у губок, пластинчатых, стрекающих и двустороннесимметричных животных, а вторая — BH3 отсутствует у пластинчатых и губок [46].

Функционально их можно разделить на антиапоптотические, проапоптотические и дивергентные (BH3). Проапоптотические Bax-подобные белки создают поры во внешней мембране митохондрий, что приводит к высвобождению цитохрома с в цитоплазму, активации каспаз и, далее, к гибели клеток (рис. 2). Антиапоптотические белки, как Bcl-2, связывают и ингибируют подмножество доменов BH3, непосредственно вызывая олигомеризацию Bax или BAK. Группа BH3 объединяет белки со слабовыраженной гомологией последовательностей по сравнению с Bcl-2 [47]. Многие из этих белков широко распространены и экспрессируются в нервной системе развивающихся и взрослых организмов.

Из-за первоначально обнаруженной способности Bcl-2 защищать клетки от гибели часто забывают, что это обширное семейств белков, которые также играют важную роль в поддержании функций клеток, не связанных с апоптозом. К ним относятся участие в регуляции таких процессов, как продолжение клеточного цикла, работа митохондрий, аутофагия, внутриклеточная концентрация кальция, метаболизм глюкозы и липидов, а также развёрнутый белковый ответ на различные стимулы. В дополнение к этим установленным альтернативным функциям делаются дальнейшие открытия, обнаруживающие всё новые функции данного белка. Из-за этого усиление или уменьшение экспрессии Bcl-2 не всегда напрямую соотносится с уровнями апоптоза и нужно рассматривать другие белки и их молекулярные пути [48].

Bcl-2 играет двойную роль в поддержании динамического баланса между выживанием и гибелью раковых клеток. Было показано, что Bcl-2 задерживает переход фазы G0/G1 в S, регулируя митохондриальные метаболические пути для производства более низких уровней АТФ и АФК. Однако подробные молекулярные механизмы, с помощью которых Bcl-2 регулирует клеточный цикл, остаются неизвестными. Влияние Bcl-2 на регуляцию клеточного цикла было обнаружено путём мониторинга экспрессии Bcl-2 и P27. Протеомный анализ клеток, сверхэкспрессирующих Bcl-2, выявил 169 белков с повышенным уровнем экспрессии и 120 белков с пониженным уровнем с диапазоном отклонения от нормы в 1,5 раза. В основном они связаны с работой рибосом и окислительным фосфорилированием. Дифференциально экспрессируемые белки, участвующие в окислительном фосфорилировании, объясняют большую часть эффектов Bcl-2. Bcl-2 потенциально действует на уровне трансляции, оказывая влияние на белки или ферменты дыхательной цепи митохондрий и рибосомы, тем самым регулируя клеточный цикл. Однако детальные механизмы непрямой регуляции клеточного цикла Bcl-2 неясны [49]. Уклонение от апоптоза посредством сверхэкспрессии Bcl-2 вместе с бесконтрольным делением было признано отличительной чертой злокачественных опухолей.

 

Рис. 2. Роль белков семейства Bcl-2 в апоптозе нейронов.

 

Показана физиологическая роль Bcl-2 и Bcl-x в выживании нейронов. Они защищают нейроны от целого спектра токсических воздействий [50]. Bcl-2 широко экспрессируется в развивающемся и зрелом мозге, где участвует в регуляции путей окислительного стресса [51]. Несмотря на высокие уровни экспрессии мРНК и белка Bcl-2 как в клетках-предшественницах нейронов, так и в постмитотических нейронах эмбрионального мозга, дефицит Bcl-2 не вызывает каких-либо необратимых изменений и развитие идёт нормально, без значительного усиления запрограммированной гибели нейронов. При дефиците Bcl-2 наблюдается усиленная потеря мотонейронов, симпатических нейронов и сенсорных нейронов в раннем постнатальном периоде, оценка экспрессии Bcl-2 проводилась иммуногистохимическим методом [52]. В постнатальном периоде уровень Bcl-2 снижается в большинстве областей мозга, за исключением тех, где продолжается нейрогенез, но и там он падает с возрастом. Помимо нейронов, здесь он также экспрессируется микроглией. В периферической нервной системе его экспрессия остаётся высокой на протяжении всей жизни [53].

Однако экспрессия Bcl-2 изменяется при многих состояниях, для которых характерна быстрая или отсроченная гибель нейронов, а также нейродегенерация. Во многих случаях описано снижение уровней антиапоптотических белков Bcl-2 с увеличением уровней проапоптотических белков или без него в поражённых областях мозга. В других случаях при тех же патологических состояниях описывается повышенная экспрессия антиапоптотических генов и их белков, что может просто отражать реакцию выжившей популяции клеток [54].

Активация сигнального пути ERK1/2/CREB/BCL-2 противомалярийным препаратом артемизином улучшала состояние переживших ишемический инсульт мышей. Артемизинин ослаблял выработку АФК, потерю мембранного потенциала митохондрий, снижал концентрацию медиаторов апоптоза, окислительного стресса и нейровоспаления, а также ускорял восстановление двигательных функций у животных. Данные были получены на клетках линии РС12 и C57BL/6J (E18), а также на биоптатах нервной ткани мышей линии C57BL/6J. Оценка производилась с помощью анализа жизнеспособности (MTT — колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток), цитотоксичности, оценки апоптоза с помощью окрашивания Hoechst 33342, FACS, также оценивали активность каспазы-3, внутриклеточных АФК с помощью DCFH-DA, измерения митохондриального мембранного потенциала, вестерн-блоттинга, окрашивания по Нисслю и анализа TUNEL [55]. С помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией было также показано, что микроРНК-21 (миР-21) снижала гибель нейронов, защищала выжившие клетки от ишемического повреждения, что подтверждено TUNEL, и улучшала неврологические функции за счет ингибирования передачи сигналов p53/Bcl-2/Bax [56].

 

Рис. 3. Изменения уровней р53 и Bcl-2 при различных заболеваниях нервной системы.

 

Антиапоптотический белок Bcl-2 был первым регуляторным фактором апоптоза, изученным у больных шизофренией с помощью вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа. Исследования выявили сниженные на более чем 25% уровни Bcl-2 в височной коре головного мозга при шизофрении по сравнению с контролем. Более того, Bcl-2 обладает независимыми от апоптоза нейротрофическими свойствами на уровне дендритов. В совокупности эти данные позволяют предположить, что низкие уровни Bcl-2 могут способствовать снижению плотности коры при шизофрении. Соотношение Bax/Bcl-2 при шизофрении обычно увеличено на 50% по сравнению с контрольной корой. Считалось, что более высокое соотношение Bax/Bcl2 отражает более высокую восприимчивость к проапоптотическим стимулам, но полноценно запуститься апоптозу не дают низкие уровни каспазы-3 и -9. При шизофрении обнаружены изменения экспрессии 12 из 44 апоптотических генов. Из них семь имели повышенную регуляцию, четыре из которых были проапоптотическими (JNK, каспаза-2, Bid, Rip) и три — антиапоптотическими (Bcl-2, Bcl-X, MDM-2). Из пяти генов с пониженной регуляцией все были проапоптотическими (Bax, каспаза-8, гранзим B, MEKK1, c-myc) [7].

Сообщалось о снижении уровня Bcl-2 в образцах мозжечка, лобной и теменной коры больных аутизмом [11].

Низкая экспрессия Bcl-2 отмечалась у пациентов с большим депрессивным расстройством, не получавших лечения. Изучение полиморфизмов в его гене у 178 пациентов с резистентной к лечению депрессией, 612 пациентов с поддающейся лечению, а также 725 здоровых людей из контрольной группы подтверждает гипотезу о том, что Bcl-2 может играть важную роль в определении результатов лечения антидепрессантами, и этот результат может иметь диагностическое значение [57].

В нескольких исследованиях сообщалось о повышении уровней Bcl-2 в материале височных долей пациентов с эпилепсией, как взрослых, так и детей, особенно в случае фармакорезистентной эпилепсии. Изучение тканей коры пациентов с мезиальной височной эпилепсией демонстрирует, что повышенные уровни проапоптотических белков Bax и каспаза-9 и повышенные уровни антиапоптотических белков, таких как Bcl-2, связаны с активацией внутреннего пути апоптоза, который опосредован чрезмерным высвобождением глутамата и повышенным сродством N-метил-D-аспартатных рецепторов (NMDArs) к нему. Анализ методом вестерн-блотинга ткани височной коры головного мозга показал значительное увеличение уровней белка Bcl-2 у людей с лекарственно-устойчивыми формами эпилепсии. Также экспрессия Bcl-2 положительно связана с продолжительностью, частотой и тяжестью эпилептических припадков [58]. Кроме Bcl-2, в поражённом эпилепсией мозге наблюдается усиленная экспрессия другого антиапоптотического белка — Bcl-xL. Для этого, используя вестерн-блоттинг и иммуногистохимию, авторы оценили экспрессию bcl-2, bcl-xL, bax, каспазы-1 и каспазы-3 в образцах височной коры у пациентов, перенесших операцию височной лобэктомии по поводу некупируемой эпилепсии (n = 19). Неэпилептическая посмертная ткань из банка мозга служила в качестве контроля (n = 6) [59]. Неизвестно, является ли это защитной реакцией, хотя экспериментальное введение Bcl-2 защищает нейроны и глиальный компонент от апоптоза. Повреждение головного мозга после судорог может быть причиной появления ряда белков в спинномозговой жидкости или плазме. Повышенные уровни в сыворотке крови Bcl-2, высвобождающегося после гибели нейронов либо вследствие периферических реакций на судороги, были зафиксированы у детей с трудноизлечимой височной эпилепсией и коррелировали с продолжительностью заболевания, его тяжестью и частотой судорог. Также было обнаружено, что IQ больных детей ниже, чем в контрольной группе, и отрицательно коррелирует с уровнем Bcl-2 в сыворотке. В данном случае уровни Bcl-2 в сыворотке являются хорошим маркером тяжести судорог и нарушения когнитивных функций. В настоящее время неизвестно, оказывает ли повышенный уровень Bcl-2 в сыворотке пациентов какой-либо защитный эффект на мозг [60]. По данным исследования сыворотки крови 65 пациентов с эпилепсией и 30 здоровых добровольцев, высокие уровни Bcl-2 связаны с когнитивной дисфункцией, отмечавшейся у 18 пациентов. Время и частота эпилептических припадков у пациентов с когнитивной дисфункцией были достоверно выше, чем у пациентов без таковой. Когнитивную функцию оценивали с помощью Монреальской формы когнитивной оценки, и в течение 6 ч после приступа брались анализы крови для измерения скорости гидролиза сывороточного аденозинтрифосфата (АТФ), аденозиндифосфата (АДФ), аденозинмонофосфата (АМФ), активности фосфодиэстеразы (ФДЭ) и уровней сывороточного NSE, S100B и Bcl-2 [61].

Уровни Bcl-2 положительно коррелируют с продолжительностью эпилепсии, тяжестью приступов и их частотой, притом у пациентов с неконтролируемыми приступами они выше, что показало изучение сыворотки крови методом иммуноферментного анализа у 30 детей и подростков (средний возраст 8.03 и 14.49 года) с идиопатической эпилепсией фокальной или генерализованной. При этом они были сопоставимы у пациентов с разными типами приступов. Помимо антиапоптотического белка Bcl-2, эта же закономерность наблюдалась у проапоптотического белка Fas [62]. Нужно отметить, что многие заболевания ЦНС сопровождаются судорожными припадками, не только эпилепсия (прионные заболевания, синдром Дауна, некоторые виды деменции и др.), и каждый припадок может приводить к выраженной нейродегенерации [63, 64].

Насколько эффективно Bcl-2 выполняет свою функцию, неясно, однако анализ его экспрессии при склерозе гиппокампа вследствие височной эпилепсии показал, что увеличение соотношения Bcl-2/Bax в нейронах и глиальных клетках в образцах гиппокампа 27 пациентов с лекарственно-устойчивой височной эпилепсией, где белки интереса выявляли иммуногистохимическим методом, не предотвращает экспрессию активной каспазы-3 глией и гранулярными нейронами, но в полях СА активная каспаза-3 не обнаруживалась [65]. В настоящее время при эпилепсии доступные противосудорожные препараты ограничены по своим механизмам действия и воздействуют лишь на симптомы эпилепсии, не затрагивая её причин, в большинстве случаев, остающихся в тени, особенно если заболевание уже устойчиво к лекарствам. Однако в основе патогенеза эпилепсии, независимо от причин, лежат общие механизмы, включающие в себя нарушение экспрессии различных апоптоз-ассоциированных молекул, элементы нейровоспаления, пересекающиеся с другими патологическими состояниями, например, злокачественными новообразованиями и аутоиммунными заболеваниями. Воздействие на аналогичные механизмы при раке привело к разработке новых способов лечения, несмотря на не меньшую лекарственную устойчивость и скорость её приобретения изменёнными дисфункциональными клетками. Тот же подход может оказаться эффективным при эпилепсии.

Экспрессия Bcl-2 снижена при различных нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Паркинсона, Альцгеймера, Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, а уровни проапоптотических членов этого семейства, таких как Bax, напротив, высоки как в посмертных образцах от пациентов, так и в моделях трансгенных животных [18].

Анализ литературы позволяет предположить, что Bcl-2 не играет в головном мозге столь значимой роли, и его экспрессия снижается в процессе онтогенеза, в отличие от периферической нервной системы. При многих заболеваниях (шизофрения, расстройства аутистического спектра, нейродегенеративные заболевания и др.) отмечено снижение уровня экспрессии Bcl-2 (рис. 3). При эпилепсии же многие авторы наблюдают повышение уровней Bcl-2 как в мозге, так и в сыворотке крови и спинномозговой жидкости (рис. 3). Таким образом, можно предположить, что белок Bcl-2 как терапевтическая мишень менее перспективен, чем р53.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гибель нейронов и глиальных клеток широко распространена в норме и патологии, и имеет большое значение для функционирования нервной системы из-за ограниченной способности к пролиферации взрослых нейронов млекопитающих, в том числе человека. Механизмы апоптоза при различных патологиях ЦНС, как, например, инсульт и болезнь Альцгеймера, недостаточно изучены, поэтому в настоящее время нет эффективных методов и средств нейропротекции при патологии.

Анализ данных литературы показывает, что в основе различных заболеваний нервной системы лежат общие механизмы дисрегуляции апоптоза с чрезмерной активацией проапоптотических белков, таких как р53, и снижением экспрессии антиапоптотических, обеспечивающих выживание клеток, как Bcl-2, а также дефектами митохондрий. Выявление этих общих молекулярных механизмов может помочь разработать эффективные методы лечения и снижения последствий множества заболеваний, от депрессии до эпилепсии и деменций. Однако, по данным исследований, эти закономерности не являются абсолютными и не работают в некоторых случаях, что ставит вопросы о роли апоптоза и наличии не связанных с р53 и Bcl-2 механизмов, отвечающих за выживание и гибель клеток.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа была выполнена в соответствии с тематическим планом прикладных научно-исследовательских работ по Гос.заданию ФГБУ НКЦТ им. С.Н. Голикова ФМБА России и при поддержке Гос.задания ИЭФБ РАН 075-00264-24-00.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

ВКЛАД АВТОРОВ

Идея работы и планирование обзора (А.А.К. и Е.Д.Б.), сбор и анализ литературных данных (А.А.К. и Е.Д.Б.), написание и редактирование манускрипта (А.А.К. и Е.Д.Б.).

About the authors

E. D. Bazhanova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences; Golikov Research Center of Toxicology

Author for correspondence.
Email: bazhanovae@mail.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg; Saint-Petersburg

A. A. Kozlova

Golikov Research Center of Toxicology

Email: bazhanovae@mail.ru
Russian Federation, Saint-Petersburg

References

Supplementary files