Изменение активности Na⁺/K⁺-АТФазы и липидного состава жабр горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Salmonidae) Белого моря в ходе нерестовой миграции

Full Text

Горбушу Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum, 1792) дальневосточного происхождения интродуцировали в водоёмы Белого моря Кольского п-ова начиная с 1956 г., в настоящее время она успешно адаптировалась к новым условиям обитания (Гордеева и др., 2015; Веселов и др., 2016; Алексеев и др., 2019). Следствием интродукции на северо-западе России стало появление многочисленных естественных популяций горбуши как в России (в реках бассейнов Белого и Баренцева морей), так и в ряде государств Северной Европы – в Норвегии (Sandlund et al., 2019), Исландии и Великобритании¹. Горбуша – самый короткоживущий представитель семейства лососёвых (Salmonidae) – характеризуется двухлетним жизненным циклом и способностью быстро адаптироваться к меняющимся условиям среды. По этой причине горбуша оказалась высоко инвазивным видом (Paulsen, 2022) и хорошо адаптировалась к условиям Арктики.

Нерестовая миграция – это генетически запрограммированный процесс, в ходе которого горбуша после нагула в морской среде мигрирует в пресную воду рек вверх по течению, причём время вхождения в реки зависит от физиологических особенностей, связанных с осморегуляцией рыб (Birnie-Gauvin et al., 2021). Осморегуляторные механизмы горбуши позволяют ей выдерживать значительные изменения солёности среды. Осмотическая регуляция у костистых рыб осуществляется в основном специализированными клетками жабр – ионоцитами (Inokuchi et al., 2022). Ключевую роль в работе ионоцитов играет мембраносвязанный фермент Na⁺/K⁺-АТФаза (NKA) (Folmar, Dickhoff, 1980; Hwang et al., 2011; McCormick, 2013), который состоит из двух субъединиц (α и β), по-разному реагирующих на осмотические и солёностные изменения (Liao et al., 2009; Madsen et al., 2009).

Функционирование NKA обусловлено физико-химическим состоянием мембран, которое в свою очередь в значительной степени определяется особенностями структурной организации липидного бислоя, присутствием в мембране определённых фосфолипидов (Habeck et al., 2015), особенно фосфатидилсерина (Schuurmans Stekhoven et al., 1994; Haviv et al., 2013), а также количеством холестерина (Cornelius, 2008) и полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) (Biochemistry …, 2002). Изменение физиологического состояния и гормонального статуса у интродуцированной горбуши в ходе нерестовой миграции из Белого моря в р. Кереть исследовано в работе Павлова с соавт. (2022). В нашей работе основное внимание уделено биохимическим изменениям в жабрах горбуши, выполняющих, как указывалось выше, важную осморегуляторную роль у рыб при смене солёности среды обитания, как это имеет место при нерестовых миграциях.

Цель работы – изучить динамику активности NKA и содержания структурных липидных компонентов мембран в жабрах горбуши в ходе нерестовой миграции из морской среды через эстуарий в пресную воду р. Индёра Кольского п-ова.

 

Таблица 1. Длина и масса (M ± m) горбуши Oncorhynchus gorbuscha в выборках из разных участков р. Индёра 10–15.08.2021 г.

Участок	Самцы			Самки
	SL, см	Масса, г	n	SL, см	Масса, г	n
Эстуарная часть:
– морская	42.0 ± 1.0а	765 ± 58б, в, г	5	42.0 ± 0.9	991 ± 83г	8
– прибрежная	44.7 ± 1.4	1150 ± 150в	6	42.6 ± 1.0	1099 ± 123	6
Предэстуарная зона реки	45.9 ± 0.8а, д	1145 ± 155б	5	42.8 ± 0.3д	1067 ± 48	6

Примечание. M ± m – среднее значении и его ошибка, SL – стандартная длина тела, n – число особей, экз. Одинаковые буквы (^а–д) указывают на достоверные различия по U-критерию Манна–Уитни при p: ^{а, в, г} < 0.05, ^{б, д} < 0.01.

 

Материал и методика

Исследование проведено в преднерестовый период горбуши (10–15.08.2021 г.) на её взрослых особях из трёх различных участков р. Индёра: морской части эстуария (солёная вода температурой 19.2°C, полный прилив), 66°14′12.0″ с. ш., 37°08′58.8″ в. д.; прибрежной части эстуария (распреснённая вода, 16.8°C, полный прилив), 66°14′28.6″ с. ш., 37°08′55.8″ в. д.; непосредственно водотока – его предэстуарной зоны в районе пресноводных нерестилищ (16.3°C), 66°14′34.6″ с. ш., 37°08′55.8″ в. д.

Вылов горбуши в морской и прибрежной частях эстуария осуществляли ставной сетью длиной 30 м, высотой 1.8 м, ячеёй 60 мм. От момента контакта рыбы с сетью и до её помещения в садок проходило не более 1–3 мин. Отлов горбуши в районе нерестилищ на предэстуарных плёсах и порогах р. Индёра проводили кастинговой сетью ячеёй 25 мм, контакт рыбы с орудием лова не превышал 1–2 мин.

После вылова рыб помещали в садки до накопления необходимой выборки. Садки располагали в трёх соответствующих локализации поимок точках: в открытом море, западнее эстуария р. Индёра (солёная вода); в прибрежной части эстуария (распреснённая вода); в предэстуарной части реки (пресная вода). Число рыб в каждой группе составляло 11–13 экз. (табл. 1). Гонады изученных особей были III и IV стадий зрелости, все рыбы имели признаки нерестовых изменений.

После накопления в проточных садках рыб переносили в три 127-литровые бочки, заполненные водой, солёность которой соответствовала месту вылова: 1) вода из Белого моря (солёность 32‰); 2) смесь пресной и солёной воды в соотношении 1:1; 3) пресная вода. В бочках рыб выдерживали 2–11 ч (одновременно не более 5 экз.), аэрацию осуществляли компрессором Sera air 275R (SERA, Германия). Для усыпления горбушу по одной перемещали на 4–5 мин в 30-литровые ёмкости, наполненные водой соответствующей солёности с добавлением гвоздичного масла (20 капель). Затем рыб умерщвляли, взвешивали на электронных весах URM Astra 3 (URM, Китай) и измеряли их длину мерной лентой, после проводили вскрытие, вырезали жабры, которые помещали в жидкий азот и до начала анализа хранили в лаборатории при – 80°C.

Все манипуляции проводили согласно методическим рекомендациям по использованию рыб при проведении исследований (Guidelines …, 2014). Вылов производителей горбуши проведён согласно Разрешению № 51 2021 03 2021 от 19.06.2021 г., выданному Североморским территориальным управлением Федерального агентства по рыболовству.

Дальнейшие исследования выполняли на базе лаборатории экологической биохимии ИБ КарНЦ РАН и с использованием оборудования Центра коллективного пользования КарНЦ РАН.

Определение активности Na⁺/K⁺-АТФазы (КФ 3.6.1.3) проводили в осадке после гомогенизации и центрифугирования образцов (200 мг ткани жаберных лепестков) (Елаев, Семенов, 1974). Осадок ресуспендировали в буфере для гомогенизации в соотношении 1: 3 (г/мл) и добавляли 2%-ный раствор дезоксихолата натрия до конечной концентрации 0.2%. Приготовленный раствор выдерживали на холоде в течение 2 ч. Сус- пензию центрифугировали 30 мин при 15 000 g (12 800 об/мин). В полученном супернатанте проводили ферментативную реакцию в инкубационной среде (субстратный буфер) и в контрольной среде без Na⁺ и K⁺ в присутствии ингибитора уабаина (10^–4 М). Инкубационная среда для определения активности фермента содержала 0.01 М NaCl, 0.02 М KCl, 0.002 M MgCl₂ и субстрат 3 мM АТФ в буфере Трис-НСl (рН 7.55). В контрольный буфер Трис-НСl (рН 7.55) без солей добавляли уабаин до конечной концентрации 10^–3 М. В результате гидролиза АТФ под действием АТФазы накапливается неорганический фосфат. Реакцию проводили 30 мин при 37°C и останавливали добавлением равного объёма 10%-ной трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования в течение 20 мин при 6000 g (8000 об/мин) в надосадочной жидкости определяли количество неорганического фосфата (Pi) по величине экстинкции по калибровочной кривой (Kahovcová, Odavić, 1969). Активность NKА в условных единицах оценивали по разности Pi субстратной среды и контрольной среды в присутствии уабаина за 30 мин реакции в расчёте на концентрацию белка (мкг Pi/мг белка).

Анализ содержания белка в исследуемом материале проводили согласно методу Бредфорда (Bradford, 1976). В качестве стандарта для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин в физрастворе.

Анализ состава липидов. Липиды экстрагировали по методу Фолча (Folch et al., 1957). Состав липидов отдельных классов определяли с использованием высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Фракционирование общих липидов проводили на пластинах HPTLC Silicagel 60 F254 (Merck, Германия). В качестве элюента использовали смесь гексан: диэтиловый эфир: уксусная кислота (32.0: 8.0: 0.8 по объёму) (Olsen, Henderson, 1989). Качественное и количественное определение липидных компонентов проводили в денситометре TLC Scanner 4 (CAMAG, Швейцария) на дейтериевой лампе при длине волны 350 нм в режиме адсорбции (Handloser et al., 2008). Идентификацию липидных классов осуществляли по стандартам соответствующих компонентов (Sigma-Aldrich, США).

Фракционный состав фосфолипидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (Arduini et al., 1996) на хроматографе Стайер (“Аквилон”, Россия). В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил: метанол: гексан: фосфорная кислота (918.0: 30.0: 30.0: 17.5 по объёму). Для идентификации использовали стандартные растворы фосфолипидов (Sigma-Aldrich, США).

Определение жирнокислотного состава проводили методом газожидкостной хроматографии. Метиловые эфиры жирных кислот (ЖК) получали в результате прямого метанолиза (с метанолом и хлористым ацетилом в качестве катализатора реакции) (Цыганов, 1971). Полученные метиловые эфиры ЖК разделяли на хроматографе Agilent 7890A (Agilent technologies, США) на капиллярной колонке HP-88 (Phenomenex, США), подвижная фаза – азот.

Статистическая обработка результатов. Значения показателей в пробах соответствовали распределению, отличному от нормального: p < 0.05 (тест Колмогорова–Смирнова). Для определения различий между группами по изученным показателям использовали U-критерий Манна– Уитни, а при определении различий в содержании липидов и их жирных кислот применяли также критерий Краскела–Уоллиса (рost-hoc тест Тьюки).

 

Средние значения активности Na⁺/K⁺-АТФазы (■) и концентрации белка (□) в жабрах горбуши Oncorhynchus gorbuscha из разных участков р. Индёра в ходе нерестовой миграции 10–15.08.2021 г.: (I) – стандартная ошибка среднего. Отличия от соответствующего показателя у рыб из морской части эстуария по U-критерию Манна–Уитни достоверны при p: ** < 0.01, *** < 0.001.

Результаты

Значения концентраций белка в тканях жабр горбуши в исследованных группах достоверно не различались (рисунок). Активность NKA в жабрах горбуши из речной зоны и из прибрежной части эстуария оказалась достоверно ниже, чем таковая у рыб из морской части эстуария. Межполовые различия по изученным показателям не обнаружены.

Содержание липидов и жирных кислот в жабрах горбуши приведено в табл. 2. Выявлено повышение содержания моноацилглицеринов (МАГ) и диацилглицеринов (ДАГ), линолевой (ЛК – 18:2n-6) и эйкозапентаеновой (ЭПК – 20:5n-3) кислот, а также снижение содержания фосфатидилсерина (ФС) и величины отношения насыщенных жирных кислот (НЖК) к полиненасыщенным жирным кислотам (ПНЖК) в жабрах горбуши, выловленной в прибрежной части эстуария, по сравнению с морской. В жабрах рыб из пресной воды, по сравнению с таковыми из морской среды, содержание триацилглицеринов (ТАГ), ЛК, ЭПК и докозагексаеновой (ДГК – 22:6n-3) кислоты повышено, а стеариновой (18:0) кислоты и значение соотношения НЖК/ПНЖК снижено.

Обсуждение

Результаты показали, что в ходе нерестовой миграции при снижении солёности среды активность NKA в жабрах горбуши снижается. Ранее подобный эффект обнаружен в жабрах кеты O. keta из залива о-ва Хонсю в экспериментах, моделирующих нерестовую миграцию (Uchida et al., 1997). Снижение активности NKA может приводить к уменьшению проницаемости жаберного эпителия для ионов и связано с дифференциальной регуляцией изоформ этого фермента и с изменением числа ионоцитов. Так, субъединица α1a NKA лососёвых преимущественно экспрессируется в пресной воде, а α1b – в морской (McCormick et al., 2009). Можно полагать, что изменение активности АТФ-активируемого мембранного ионного насоса при изменении солёности окружающей среды свидетельствует об участии NKА в регуляции промежуточного метаболизма и в поддержании ионного баланса клеток.

Высокую пластичность горбуши и её приспособляемость к изменяющейся солёности окружающей среды ранее мы показали в исследовании происходящей вскоре после выклева покатной миграции ранней молоди вида (Немова и др., 2021). Такая адаптивная реакция горбуши была связана с изменением уровня кортизола – гормона, регулирующего водно-солевой обмен. Горбуша и кета относятся к видам, для которых характерна ранняя смолтификация, они приобретают устойчивость к солёной среде ко времени выхода из гнёзд и в основной своей массе вскоре после рассасывания желточного мешка скатываются в море (Sackville et al., 2012; Gallagher et al., 2013; McCormick, 2013). В настоящей работе изучена активность NKA (фермента осморегуляции) у особей горбуши на стадии, предшествующей нересту, после которого происходит гибель производителей (Смирнов, 1975; Heard, 1991). Дегенерация органов у горбуши и её посленерестовая гибель во многом обусловлены избыточной концентрацией кортизола в плазме крови (Cook et al., 2011; Campbell et al., 2021). Известно также, что в начале нерестовой миграции самки нерки O. nerka имеют относительно высокие уровни кортизола, которые не меняются в течение репродуктивного периода (Kubokawa et al., 1999; Campbell et al., 2021). Однако полученные в нашем исследовании значения активности NKA близки к выявленным ранее у молоди горбуши (Немова и др., 2021). Это может свидетельствовать о нормальном функционировании осморегуляторной системы у горбуши в процессе нерестовой миграции.

 

Таблица 2. Содержание липидов (M ± SD) в жабрах горбуши Oncorhynchus gorbuscha из разных участков р. Индёра 10–15.08.2021 г.

Показатель	Эстуарная часть		Предэстуарная зона реки
	морская	прибрежная
Общие липиды и липиды основных классов, % сухой массы
Общие липиды	9.45 ± 1.92	12.21 ± 3.05*	11.13 ± 2.53
Фосфолипиды	1.93 ± 0.33	2.00 ± 0.21	2.12 ± 0.63
Холестерин	1.48 ± 0.26	1.69 ± 0.18	1.62 ± 0.36
Эфиры холестерина	1.89 ± 0.34	2.30 ± 0.48	2.22 ± 0.65
Моноацилглицерины	0.21 ± 0.06	0.28 ± 0.06*	0.21 ± 0.06
Диацилглицерины	0.25 ± 0.10	0.48 ± 0.25*	0.34 ± 0.17
Триацилглицерины	1.61 ± 0.85	2.91 ± 2.21	2.35 ± 1.28*
Свободные жирные кислоты	1.04 ± 0.22	1.19 ± 0.22	1.11 ± 0.32
Неидентифицированные липиды	1.03 ± 0.25	1.36 ± 0.30	1.15 ± 0.30
Фосфолипиды, % сухой массы
Фосфатидилинозитол	0.04 ± 0.02	0.03 ± 0.02	0.04 ± 0.03
Фосфатидилсерин	0.09 ± 0.04	0.05 ± 0.03*	0.07 ± 0.04
Фосфатидилэтаноламин	0.09 ± 0.06	0.08 ± 0.06	0.09 ± 0.11
Фосфатидилхолин	1.04 ± 0.30	1.20 ± 0.36	1.36 ± 0.58
Лизофосфатидилхолин	0.62 ± 0.18	0.60 ± 0.32	0.54 ± 0.29
Сфингомиелин	0.04 ± 0.03	0.03 ± 0.03	0.02 ± 0.02
Неидентифицированные фракции	0.01 ± 0.01	0.01 ± 0.01	0
Жирные кислоты, % общей суммы жирных кислот
14:0	2.75 ± 0.63	2.88 ± 0.74	2.90 ± 0.54
16:0	32.56 ± 4.35	27.54 ± 8.52	29.80 ± 6.64
16:1n-7	4.00 ± 1.01	3.83 ± 0.68	4.57 ± 1.10
18:0	12.61 ± 2.55	9.88 ± 4.12	10.05 ± 2.94**
18:1n-9	25.32 ± 1.38	24.33 ± 3.18	24.73 ± 1.88
18:1n-7	4.64 ± 0.41	4.10 ± 0.65	4.60 ± 0.45
18:2n-6	0.64 ± 0.20	1.02 ± 0.35*	0.85 ± 0.27*
18:3n-6	0.17 ± 0.05	0.24 ± 0.16	0.18 ± 0.09
18:3n-3	0.58 ± 0.11	0.74 ± 0.25	0.60 ± 0.16
20:1n-9	3.16 ± 1.87	5.04 ± 3.88	4.31 ± 2.43
20:1n-7	1.05 ± 0.38	0.96 ± 0.48	0.97 ± 0.35
20:4n-6	0.55 ± 0.19	0.95 ± 0.45	0.79 ± 0.41
20:5n-3	0.60 ± 0.22	1.75 ± 1.45**	1.50 ± 1.37**
22:1n-11	2.09 ± 2.36	4.37 ± 4.32	3.46 ± 2.74
22:1n-9	0.49 ± 0.32	0.86 ± 0.44	0.66 ± 0.40
22:6n-3	1.11 ± 0.67	2.81 ± 2.92	2.29 ± 2.08*
Жирные кислоты основных классов, % общей суммы жирных кислот
НЖК	50.31 ± 5.77	42.88 ± 12.75	45.17 ± 8.89
МНЖК	44.86 ± 5.63	47.79 ± 9.73	47.18 ± 7.00
n-3 ПНЖК	3.47 ± 1.09	7.12 ± 4.95**	5.83 ± 4.17*
n-6 ПНЖК	1.36 ± 0.27	2.21 ± 0.38**	1.82 ± 0.57*
ПНЖК	4.83 ± 1.23	9.33 ± 5.02	7.65 ± 4.63
Соотношение жирных кислот отдельных классов
n-3/n-6 ПНЖК	2.60 ± 0.76	3.23 ± 2.24	3.03 ± 1.23
НЖК/ПНЖК	11.11 ± 3.44	5.99 ± 3.61**	7.74 ± 4.23*

Примечание. Отличия от соответствующих показателей у рыб из морской части эстуария достоверны по: *U-критерию Манна–Уитни, **критериям Манна–Уитни и Краскела–Уоллиса; НЖК, МНЖК, ПНЖК – соответственно насыщенные, мононенасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты. Приведены только доминирующие ЖК; содержание неуказанных минорных ЖК (12:0, 15:0, 17:0, 20:0, 22:0, 24:0, 14:1, 15:1, 16:1n-9, 16:1n-11, 18:1n-11, 20:1n-11, 24:1n-9, 20:3n-3, 20:4n-3, 22:5n-3) составляло 0.01–1.40% суммы ЖК, различия в их содержании у рыб из исследуемых мест сбора были недостоверны.

 

Модуляция активности NKA частично обусловлена также изменениями физико-химических свойств мембраны в результате липидобелковых взаимодействий. Большинство фосфолипидов при формировании бислоя взаимодействуют с интегральными мембранными белками (Contreras et al., 2011). Примечательно, что в кристаллических структурах фермента NKА наблюдаются три места для локализации ФС, фосфатидилэтаноламина и сфингомиелина (Habeck et al., 2015). В своей работе указанные авторы показали также, что стабильность NKA в наибольшей степени зависит от специфического взаимодействия с ФС, в то же время другие авторы (Haviv et al., 2013) установили, что сфингомиелин ингибирует активность NKA, а фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин дестабилизируют этот фермент.

Содержание ФС в жабрах горбуши достоверно уменьшается при переходе из морской в прибрежную, распреснённую часть эстуарной зоны (табл. 2). Одновременное уменьшение содержания ФС и снижение активности NKA (рисунок) в жабрах горбуши при нерестовой миграции может быть связано со стабилизирующим действием ФС на NKA вследствие уменьшения конформационной подвижности молекул NKA в липидном бислое (Hayashi et al., 1989; Shinji et al., 2003; Habeck et al., 2015). В литературе имеется большое количество информации о влиянии различных сочетаний фосфолипидов с насыщенными и ненасыщенными жирными кислотами и холестерина на активность NKA в протеолипосомных системах (Esmann, Marsh, 2006; Cornelius, 2008; Cornelius et al., 2015; Habeck et al., 2015).

Регуляция активности ферментов, встроенных в мембраны, при этом может быть связана с изменением микровязкости мембран, которая в свою очередь обусловлена содержанием НЖК и ПНЖК в составе фосфолипидов (Biochemistry …, 2002). Морские организмы содержат большое количество ПНЖК, особенно высокополиненасыщенных жирных кислот: ЭПК и ДГК (Tocher, 2003; Murzina et al., 2020, 2022). У рыб основными физиологически активными ПНЖК являются арахидоновая кислота (20:4n-6) и её метаболический предшественник – ЛК, а также ЭПК и ДГК.

Повышение содержания таких физиологически важных ПНЖК, как ЛК, ЭПК и ДГК, в жабрах горбуши при перемещении из морской части эстуария в зону нереста сопровождается снижением активности NKA. Некоторые данные литературы свидетельствуют о подавлении активности NKA при увеличении количества ПНЖК в составе мембранных липидов (Ahmed, Thomas, 1971). К микровязкости липидного окружения чувствительны только те мембранные ферменты, при работе которых происходит изменение их конформации (Kang, Leaf, 1996). Методом электронного парамагнитного резонанса показано влияние спин-меченых липидов на конформационную подвижность или на взаимодействие субъединиц NKА (Esmann, Marsh, 2006).

В составе липидов жабр горбуши из реки и прибрежной части эстуария наряду с повышением физиологически активных ПНЖК (ЛК, ЭПК и ДГК) отмечено повышенное содержание МАГ и ДАГ, а также ТАГ (только у горбуши из пресной воды). МАГ и ДАГ являются метаболическими предшественниками не только для синтеза ТАГ, но и для синтеза фосфолипидов (ФС, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин) (Biochemistry …, 2002). Повышение уровня ТАГ у горбуши из пресной воды предполагает активацию синтеза этих высокоэнергетических липидов, которые могут расходоваться на энергоёмкие процессы, в том числе на поддержание водно-солевого обмена и двигательную активность при миграциях рыб.

Таким образом, снижение активности NKA и изменение липидного состава клеточных мембран в жабрах являются механизмами, посредством которых горбуша адаптируется к изменению солёности среды. Эффективная осморегуляция позволяет горбуше поддерживать осмотическое постоянство внутренней среды при нерестовой миграции из моря в реку и реализовать репродуктивную стратегию.

Финансирование работы

Исследование профинансировано из средств государственного бюджета, выделенных по государственным заданиям КарНЦ РАН FMEN-2022–0006 и FMEN-2022–0007.

 

¹ Pettit H. 2017. Britain’s native salmon are under threat from a pink rival that escaped into the sea from Russian farms (https://www.dailymail.co.uk/sciencetech/article-4829918/Britain-s-native-salmon-threat-pink-rival.html. Version 06/2023).

About the authors

Е. И. Кяйвяряйнен

Институт биологии Карельского научного центра РАН

Email: nlrend@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

Н. Н. Фокина

Институт биологии Карельского научного центра РАН

Email: nlrend@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

Н. Л. Рендаков

Институт биологии Карельского научного центра РАН

Author for correspondence.
Email: nlrend@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

Д. А. Ефремов

Институт биологии Карельского научного центра РАН

Email: nlrend@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

Н. Н. Немова

Институт биологии Карельского научного центра РАН

Email: nlrend@mail.ru
Russian Federation, Петрозаводск

References

Supplementary files