Coamplification of Mycobacterium leprae genome sections by real-time PCR: Detection of the pathogen and the possibility of a semi-quantitative assessment of the bacterial load

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Aim. To develop a method for coamplification of single-copy genes and repetitive elements of the Mycobacterium leprae genome in the analysis of clinical material from leprosy patients with an assessment of the clinical significance of the study results.
Materials and methods. Skin scarification and biopsy samples from patient R. with a diagnosis of “A30.5 Leprosy. Multibacillary form. Lepromatous type. Active stage” were used as empirical material for the study. A search for M. leprae DNA in the clinical material was performed by the method of real-time PCR (RT-PCR) using primers and hydrolysis probes for the single-copy species-specific genes rpoB (encodes the β-subunit of bacterial RNA polymerase), sodA (encodes the superoxide dismutase enzyme) and mntH (encodes the manganese transport protein), as well as for RLEP — the non-coding repetitive element of the genome.
Results. Using various RT-PCR assays, consistent results were obtained concerning the presence or absence of M. leprae DNA in the studied clinical samples. The high sensitivity of PCR was confirmed for the detection of the repetitive element RLEP compared to the single-copy genes rpoB, sodA and mntH, which consists in reducing the number of amplification cycles (Ct) needed for exceeding the threshold fluorescence value of hydrolysis probes and leading to the maximum intensity of the fluorescence signal. When constructing standard graphs for calibrating the accumulation of a fluorescent signal for simultaneously analyzed portions of the M. leprae genome in dilutions from 1 to 1,000, significant differences in the results of co-amplification were noted depending on the quantitative presence of the DNA being detected.
Conclusion. Coamplification of M. leprae genome sections with varying degrees of copy number variation by the RTPCR method provides for effective detection of the M. leprae DNA in clinical material and forms a basis for a quantitative assessment of the bacterial load in skin scarification and biopsy samples.

About the authors

D. A. Verbenko

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: verbenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1104-7694

Cand. Sci. (Biol.), Acting Head, Department of the Laboratory Diagnostics of STIs and Dermatoses

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation



Russian Federation

A. E. Karamova

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3805-8489
Cand. Sci. (Med)., Head of the Department of Dermatology

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

Russian Federation

V. S. Solomka

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6841-8599
Dr. Sci. (Biol.), Deputy Director for Research

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

Russian Federation

A. A. Kubanov

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7625-0503
Dr. Sci. (Med.), Prof., Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Acting Director

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

Russian Federation

D. G. Deryabin

State Research Center of Dermatovenereology and Cosmetology, Ministry of Health of the Russian Federation

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2495-6694
Dr. Sci. (Biol.), Leading Researcher, Department of the Laboratory Diagnostics of STIs and Dermatoses

Korolenko str., 3, bldg 6, Moscow, 107076, Russian Federation

Russian Federation

References

  1. Fischer M. Leprosy — an overview of clinical features, diagnosis, and treatment. J Dutsch Dermatol Ges. 2017;15(8):801–827.
  2. Ridley D. S., Jopling W. H. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1966;34(3):255–273.
  3. МКБ 10 — Международная классификация болезней 10-го пересмотра. Версия: 2019. https://mkb-10.com/index.php?pid=174
  4. World Health Organization. Regional Office for South-East Asia, Global Leprosy Programme. Global leprosy strategy 2016–2020: monitoring and evaluation guide accelerating towards a leprosy-free world. New Delhi: WHO Regional Office for South East Asia; 2017. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/254907/9789290225492
  5. Образцова О. А. Молекулярно-биологические методы исследования в лабораторной диагностике лепры: эпидемиологический анализ, генетические детерминанты резистентности к антимикробным препаратам. Вестник дерматологии и венерологии. 2017;6:34–40.
  6. Cho S. N., Yanagihara D. L., Hunter S. W., Gelber R.H., Brennan P. J. Serological specificity of phenolic glycolipid 1 from M. leprae and use in serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1983;41(3):1077–1083.
  7. Duthie M. S., Balagon M. F., Maghanoy A., Orcullo F. M., Cang M., Dias R. F. et al. Rapid quantitative serological test for detection of infection with Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy. J Clin Microbiol. 2014:52(2):613–619.
  8. Fujiwara T., Hunter S. W., Cho S. N., Aspinall G. O., Brennan P. J. Chemical synthesis and serology of the disaccharides and trisaccharides of phenolic glycolipid antigen from leprosy bacillus and preparation of a disaccharide protein conjugate for serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1984;43(1):245–252.
  9. Santos A. R., De Miranda A. B., Sarno E. N., Suffys P. N., Degrave W. M. Use of PCR-mediated amplification of Mycobacterium leprae DNA in different types of clinical samples for the diagnosis of leprosy. J Med Microbiol. 1993;39(4):298–304.
  10. Martinez A. N., Talhari C., Moraes M. O., Talhari S. PCR-based techniques for leprosy diagnosis. From the laboratory to the clinic. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(4):e2655. doi: 10.1371/journal.pntd.0002655
  11. Pathak V. K., Singh I., Turankar R. P., Lavania M., Ahuja M., Singh V. et al. Utility of multiplex PCR for early diagnosis and household contact surveillance for leprosy. Diagn Microbiol Infect Dis. 2019;95(3):114855. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2019.06.0078
  12. Turankar R. P., Pandey S., Lavania M., Singh I., Nigam A., Darlong J. et al. Comparative evaluation of PCR amplification of RLEP, 16S rRNA, rpoT and SodA gene targets for detection of Mycobacterium leprae DNA from clinical and environmental samples. Int J Mycobacteriol. 2015;4(1):54–59.
  13. Azevedo M. C., Ramuno N. M., Fachin L. R., Tassa M., Rosa P. S., Belone A. F. et al. qPCR detection of Mycobacterium leprae in biopsies and slit skin smear of different leprosy clinical forms. Braz J Infect Dis. 2017;21(1):71–78. doi: 10.1016/j.bjid.2016.09.017
  14. Образцова О. А., Вербенко Д. А., Карамова А. Э., Семенова В. Г., Кубанов А. А., Дерябин Д. Г. Совершенствование ПЦР-диагностики лепры путем амплификации видоспецифичного повторяющегося фрагмента генома Mycobacterium leprae. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(8):511–516. doi: 10.18821/0869-2084-2018-63-8-511-516
  15. Woods S. A., Cole S. T. A family of dispersed repeats in Mycobactenium leprae. Mol Microbiol. 1990;4:1745–1751.
  16. Martinez A. N., Lahiri R., Pittman T. L., Scollard D., Truman R., Moraes M.O. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J Clin Microbiol. 2009;47(7):2124–2130.
  17. Chaitanya V. S., Cuello L., Das M., Sudharsan A., Ganesan P., Kanmani K. et al. Analysis of a novel multiplex polymerase chain reaction assay as a sensitive tool for the diagnosis of indeterminate and tuberculoid forms of leprosy. Int J Mycobacteriol. 2017;6(1):1–8.
  18. Banerjee S., Sarkar K., Gupta S., Mahapatra P. S., Gupta S., Guha S. et al. Multiplex PCR technique could be an alternative approach for early detection of leprosy among close contacts: a pilot study from India. BMC Infect Dis. 2010;10:252.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML

Copyright (c) 2019 Verbenko D.A., Karamova A.E., Solomka V.S., Kubanov A.A., Deryabin D.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».