The culture of equine adipose tissue-derived mesenchymal cells in serum-free media

全文:

Клетки, выделенные из разных источников тканей, таких как костный мозг (КМ), жировая ткань (ЖТ), пуповинная кровь (ПК), плацента, дентин пульпы зуба, дерма кожи, с фенотипом мезенхимных стволовых/стромальных клеток (МСК) у разных видов животных, в том числе и человека, демонстрируют схожие свойства при адаптации их к условиям культивирования. Это вытянутые веретенообразные клетки с фибробластоподобной морфологией, с круглым или овальным ядром, в котором хорошо визуализируются 2–4 ядрышка. Они обладают высокой адгезивной способностью, быстро прикрепляются ко дну культурального флакона, размножаются, образуя монослой, имеют клонообразующие способности и сохраняют во время длительного культивирования геномную стабильность при самообновлении (более  50–55 цитогенераций). До сих пор не найден специфический маркер (ген), экспрессия которого бы на транскрипционном или трансляционном уровнях, подтверждала их происхождение. Поэтому эти клетки оцениваются по транскриптому (комплексу мРНК) и/или иммунофенотипу (комплексу CD-маркеров), который характеризуется наличием поверхностных антигенов CD73, CD٩0, CD 10 5 и отсутствием CD4 5, CD34, CD 14, CD 1 1b, CD7٩a или CD 1٩ или антигенов комплекса гистосовместимости класса II (HLA II, лейкоцитарные антигены класса II человека). Основным критерием принадлежности клеток к популяции МСК остается функциональный тест in vitro – способность при индукции к дифференцировке в адипо-, остео- и хондрогенном направлениях. Эти клетки должны обладать прогениторными свойствами – дифференцироваться во все типы клеток костной, хрящевой и жировой тканей (Dominici et al., 2006; Bianco et al., 2008; Andrzejewska et al., 2019).

В последние годы МСК исследуются на предмет их потенциального клинического применения при различных заболеваниях, включая ортопедические травмы и воспалительные/иммуноопосредованные заболевания (Jones, McTaggart, 2008; Menard et al., 2020; Watanabe et al., 2021; Паюшина и др., 2022). Учитывая иммуномодулирующие и противовоспалительные свойства, Каплан (Caplan, 2017) предложил называть их медицинскими сигнальными клетками (medicinal signaling cells). Для лечения широкого спектра заболеваний разрабатываются клеточные, на основе МСК, (Wang et al., 2016) и неклеточные (кондиционированная среда, экзосомы) продукты (Huang, Lai, 2019; Han et al., 2022). Число клинических исследований, успешно завершивших фазу II и вошедших в фазу III, растет с каждым годом (Moll et al., 2019; Viswanathan et al., 2021). Чтобы получить терапевтически значимое количество МСК, необходимо адаптировать их к условиям in vitro и размножить. Микрооружение может оказать огромное влияние на свойства клеток. Стандартные условия их культивирования требуют наличия среды ДМЕМ с низким содержанием глюкозы ( 1 г/л), которую дополняют 10% сыворотки крови плодов коров (СКПК или FBS в англоязычной литературе) (Zuk et al., 2002; Тепляшин и др., 2005).

Ростовые среды на основе СКПК представляют потенциальную угрозу заражения клеток патогенами, такими как микоплазмы, вирусы и прионы; последние из перечисленных могут быть источником распространения трансмиссивной губчатой энцефалопатии. Сыворотка крови животных – самый нестабильный компонент питательной среды вследствие ее изменчивости от партии к партии (сохраняются проблемы, касающиеся ее сбора), а также ожидаемой нехватки в будущем, когда клеточная терапия будет использоваться более интенсивно. В качестве замены СКПК в среде для культивирования МСК человека, рассматривается лизат тромбоцитов (Gottipamula et al., 2013). Продемонстрировано, что добавление его в среду увеличивает пролиферацию МСК человека по сравнению со средой, которая содержит СКПК, и не влияет на экспрессию генов поверхностных антигенов клеток (Jung et al., 2012; Kinzebach, Bieback, 2013), кроме HLA-DR (Dam et al., 2021). С точки зрения вариабельности состава лизата тромбоцитов от партии к партии, возможного загрязнения патогенами, а также вероятности нехватки поставок в будущем, эта добавка имеет те же недостатки, что и сыворотка крови животных. Многие работники по-прежнему выращивают МСК в среде с добавлением СКПК. Международное общество клеточной терапии (ISCT) недавно обратилось к этому вопросу, стремясь к достижению соглашения по поводу заменителей сыворотки и бессывороточных сред (БС) для клеточной терапии (Karnieli at al., 2017).

Поиск условий культивирования, свободных от ксенобелков, для снижения вероятности возникновения иммунных реакций на чужеродные белки и передачи инфекционных заболеваний, позволил разработать для МСК человека подходящее микроокружение без сыворотки крови животных (Gottipamula et al., 2013; Bhat et al., 2021). Эти среды, например, StemPro®^MSC SFM XenoFree (Thrermo FS, США), StemMACS™ MSC Expansion Media Kit XF (Miltenyi Biotec, Германия), CellCor^TMCD^MSC (XCELL, Республика Корея) и другие содержат очищенные или рекомбинантные белки и синтетические пептиды. БС были разработаны для размножения МСК человека и изучены в такой же степени, как и среды на основе лизата тромбоцитов. Было продемонстрировано, что МСК человека пролиферируют в таких условиях и сохраняют способность к дифференцировке при индукции, однако имеются также сообщения об индуцированном старении клеток in vitro (Lee et al., 2022). Анализ данных, приведенных в вышеперечисленных источниках научной литературы по использованию БС для МСК человека, носят противоречивый характер. БС могут отличаться от партии к партии, их состав недоступен исследователям, что усложняет поиск наиболее подходящей среды для размножения МСК с целью создания клеточного продукта и их клинического применения. В соответствии с рекомендациями, опубликованными ISCT (Karnieli at al., 2017), крайне важно оценить влияние конкретных условий бессывороточного культивирования на конкретный тип МСК, предназначенных для клеточной терапии. В идеале переход на БС должен быть осуществлен на ранней стадии таких исследований, чтобы можно было изучить эффективность и механизм ее действия.

Опубликованные исследования по пригодности БС в основном сосредоточены на культивировании МСК(КМ) и МСК(ЖТ) человека. Бессыворотоная культура МСК крупных животных рассматривалась лишь в очень небольшом количестве исследований (Naskou et al., 2018; Hagen et al., 2022; Pilgrim et al., 2022). Аутологичные модели животных часто используются при трансляционной разработке терапии МСК для медицины человека, при этом было бы желательно работать с МСК, культивируемыми в сравнимых условиях культивирования, которые предназначены для оценки конечного клеточного продукта. Более того, клеточная терапия разрабатывается не только для медицины, но и для ветеринарии, что требует адекватных производственных процессов и одобрения регулирующих органов (Borjesson, Peroni, 2011). Поскольку клеточные продукты на основе МСК все чаще используются для лечения собак и лошадей (Victorova, Savchenkova, 2020; Platonova et al., 2021), производство этих клеток для клинического применения требует совершенствования систем культивирования для удовлетворения потребностей в их большом количестве и удалении ксенобелков.

Следует отметить, что в настоящее время имеется недостаточно данных по созданию БС для поддержания МСК животных. У лошадей МСК выделяют из разных источников тканей (Vidal et al., 2012; Коровина и др.,  20 1 5). Их функциональные свойства в значительной степени охарактеризованы (Коровина и др.,  20 17; de Schauwer et al., 2011), и накапливаются данные об успешном применении их в клеточной терапии лечения ортопедических заболеваний лошадей (Govoni, 2015; Jammes et al., 2023, Petrova, Vachkova 2023). В связи с этим поведение МСК лошадей в бессывороточных условиях культивирования представляет интерес.

Цель данного исследования заключалась в оценке коммерчески доступной БС MesenCult (STEMCELL Technologies, США) для культивирования МСК(ЖТ) лошадей.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Клетки и их культивирование. В работе использовали клетки с фенотипом, подобным МСК, полученные из ЖТ здоровых лошадей в возрасте  5 ±  2.5 лет, которые были охарактеризованы, заморожены на  2–3 пассажах культивирования и хранились в криобанке Лаборатории стволовых клеток ФНЦ Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии РАН (Москва). Одну ампулу клеток размораживали в один культуральный флакон с площадью роста  2 5 см² и после образования клеточного монослоя пересевали в два одинаковых флакона в соотношении  1:2 (0-й пассаж). Клетки 1-го флакона культивировали в обычных условиях (контроль), т. е. в среде Игла в модификации Дюльбекко (ДМЕМ; “ПанЭко”, Россия), которая содержала 1 г/л глюкозы, 10% СКПК (INTL KANG, Китай) и однократный раствор заменимых аминокислот (Gibco, Invitrogene, Life Technologies, США) без антибиотиков. Клетки 2-го флакона культивировали в БС MesenCult human (STEMCELL Technologies, США), как рекомендовано производителем. Среда MesenCult представляет собой стандартизированную базальную среду, в которую вносят дополнительно добавку MesenCult, стимулирующую размножение МСК человека in vitro.

Для культивирования клеток использовали стандартные культуральные флаконы с площадью посева  2 5 см² (SPL, Корея). Клетки пассировали в соотношении  1:5. Плотность клеток при пассировании составляла 5 · 10³ клеток на 1 см². Для отделения клеток от дна флакона при пассировании их обрабатывали 0.4%-ным раствором Версена (“ПанЭко”, Россия), а затем 0.25%-ным раствором трипсина (“ПанЭко”, Россия). Культивирование проводили в стандартных условиях при 37° С и  5٪ CO₂ в увлажненной атмосфере, меняя среду два раза в неделю. Клетки культивировали до 10-го пассажа включительно.

Оценка свойств МСК(ЖТ) в культуре. МСК оценивали по морфологии, адгезии ко дну культурального пластика, скорости и качеству формируемого клеточного монослоя, способности клеток к размножению.

Морфологический анализ клеток, растущих в разных средах, проводили на 4-е сут после посева, на 4-м и 10-м пассажах в окрашенных препаратах (краситель “Гимза”, “ПанЭко”, Россия) визуально с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.8. (htpp:www.zeiss.com)

Скорость формирования монослоя клеточных популяций, посеянных в одной и той же концентрации, оценивали по динамике изменения количества клеток, вплоть до момента образования ими  100٪-ного монослоя.

Продолжительность клеточного цикла в исследуемых МСК определяли на основании данных о времени удвоения числа клеток. Долю клеток в фазе G₀ не учитывали. Среднее время удвоения числа клеток рассчитывали по формуле t_d = t / log₂(N_t / N₀), где t_d − время удвоения числа клеток, t – время между начальным и конечным подсчeтом клеток, N₀ и N_t – число клеток в начале и конце эксперимента соответственно.

Митотический индекс для каждой популяции клеток рассчитывали в фазе логарифмического роста как отношение числа митозов к общему числу подсчитанных клеток, умноженное на  1000 (в ‰).

Способность клонообразования анализировали на  10-м пассаже культивирования клеток в разных средах. Для этого МСК пассировали при плотности  1 ⋅ 10³ в культуральные флаконы (25 см²). Эффективность клонообразования рассчитывали в процентах, как отношение числа сформированных клонов к общему числу посеянных клеток.

Кариотипический анализ МСК(ЖТ) лошади. Митоз МСК в логарифмической фазе роста блокировали  100-кратным раствором колхицина (“Биолот”, Россия) в конечной концентрации 0. 1 мкг/мл в течение 4 ч. Клетки снимали с субстрата как описано выше, осаждали высокоскоростным центрифугирование ( 500 g, 10 мин), затем проводили гипотоническую обработку смесью 0.075 М раствора КСl и 1%-ного раствора цитрата натрия. Клетки фиксировали (трижды) смесью метанола с ледяной уксусной кислотой (3 : 1) с последовательным их осаждением высокоскоростным центрифугированием (500 g, 10 мин). Клетки раскапывали на предметное стекло и окрашивали 1%-ным раствором Гимза для количественного кариотипического анализа. Для каждой группы МСК(ЖТ) лошади на  10-м пассаже оценивали не менее  20 метафазных пластинок.

Иммуноцитохимический анализ. Наличие поверхностных антигенов (АГ) на МСК(ЖТ) анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии на цитометре Epics Elite Cоulter (США). Для этого клетки на  10-м пассаже после культивирования в разных средах (стандартная и БС) снимали с субстрата 0. 2 5٪-ным раствором трипсина, считали, отмывали и аликвоты по  2 ∙  10⁵ клеток инкубировали с мышиными антителами против антигенов человека: CD3 1, CD34, CD٩0 (Becton Dickinson, США), в разведении  1:30 (PBS, дополненный 2% СКПК) при 4° С в течение 45 мин в темноте. В качестве вторых использовали анти-мышиные IgG, меченые FITC той же фирмы. Присутствие каждого антигена оценивали по результатам трех экспериментов.

Индукция адипо-, остео- и хондрогенной дифференцировок МСК(ЖТ). Способность МСК к дифференцировке в трех направлениях in vitro изучали с использованием наборов для дифференцировки StemPro^® (Gibco by Life Technologies, США). Клетки на 4-м и 10-м пассажах переносили в  24-луночные планшеты при плотности  1 ⋅ 10⁴ кл./см². По достижении 70–80%-ного монослоя питательную среду удаляли и добавляли соответствующую индукционную, которую меняли каждые 3–4 сут. Эффективность дифференцировки оценивали на 21 сут культивирования. Клетки фиксировали метанолом, охлаждeнным до –20° С (Macron Fine Chemicals, США) в течение 30 мин, и окрашивали специфическими красителями. Липидные включения в цитоплазме клеток при адипогенной дифференцировке выявляли визуально под микроскопом. Эффективность остеогенной дифференцировки анализировали по окраске карбонатов и фосфатов кальция методом серебрения по Ван Косса с помощью набора (Bio-Optica, Италия). Дифференцировку в хондрогенном направлении в монослое выявляли окрашиванием полисахаридов и муцинов альциановым синим (“БиоВитрум”, Россия), в сочетании с гематоксилином Гарриса (“Лабпоинт”, Россия).

Статистический анализ. Все эксперименты повторяли трижды. Полученные результаты представлены в виде средних значений и их стандартных отклонений. Статистические сравнения между экспериментальными группами проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при вероятности P < 0.01.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологический анализ. Морфологические различия между МСК(ЖТ) лошади на 4-е сут после посева в разные экспериментальные группы (стандартные условия культивирования (ДМЕМ с 10% СКПК) и БС MesenCult для МСК человека) не были обнаружены. Клеточные популяции представлены узкими веретенообразными клетками с фибробластоподобной морфологией (рис. 1а, б), которые имели овальное или круглое ядро, расположенное в центре, с 2–4 ядрышками и однородную незернистую цитоплазму. В условиях короткого (4 пассажа) и более длительного культивирования (10 пассажей) в клеточной популяции, находящейся в БС, изменений морфологии клеток не наблюдали (рис.  1г, е) по сравнению с контрольной группой (рис. 1в, д) соответственно.

Рис. 1. Морфология МСК(ЖТ) лошади, культивируемых в обычной среде (a, в, д) и БС MesenСult (б, г, е) на 4-е сут после посева (а, б) и на пассажах 4 (в, г) и 10 (д, е). Увел: об. 10×, ок. 10×.

Ростовые характеристики. В стандартных условиях культивирования на ранних пассажах среднее время удвоения популяции МСК(ЖТ) лошади составляло 4٦ ± 0.01 ч, митотический индекс – 34‰, а в среде MеsenСult эти показатели составляли 48 ± 0.03 и 33‰ соответственно. К 10-му пассажу эти показатели менялись незначительно. Так, время удвоения в стандартных условиях было 48 ± 0.07 с митотическим индексом 33‰, а в среде БС 4٦ ± ± 0.01 и 33‰ соответственно. По скорости роста МСК в двух экспериментальных группах не различалась между собой ни в одном временном интервале их размножения (P ≤ 0.01). При посеве клеток в плотности 2 · 10³ на см² они формировали 100%-ный монослой в обеих группах через 8 ± 0.001 сут культивирования.

Одной из характеристик МСК животных является способность их при низкой плотности посева образовывать клоны. Результаты наших исследований показали, что эффективность клонобразования МСК(ЖТ) не зависела от способа их культивирования в среде ДМЕМ с СПКП или в среде MesenСult и составляла 89 ± 0.1% и 87 ± 0.01% соответственно.

Кариотипический анализ. В табл.  1 представлены результаты кариотипического анализа, выполненные на 4-м и 10-м пассажах культивирования МСК в стандартных условиях (контроль) и БС MesenCult соответственно. Количественный анализ хромосом показал, что МСК(ЖТ) лошади, культивируемые в среде с сывороткой крови и без нее, сохраняли диплоидный набор хромосом. Анеуплоидия, полиплоидия и случайные потери числа хромосом не были обнаружены.

Таблица  1. Кариотипический анализ МСК(ЖТ) лошади на ранних и поздних пассажах культивирования в разных условиях

Иммунофенотипирование. При связывании с соответствующими меченными антителами МСК лошади окрашиваются на CD44, СD90, CD105 и не окрашиваются на CD31, CD34 и CD45. Ранее мы показали, что мышиные антитела против антигенов человека обладают специфичностью при выявлении экспрессии генов некоторых поверхностных антигенов (СD31, СD34, СD90) на МСК, выделенных из пуповинной крови (ПК) лошади (Коровина и др.,  20 17). Мы использовали мышиные антитела против антигенов человека, основываясь на результатах работы, в которой было проанализировано 37٩ мышиных антител против кластера молекул дифференцировки человека на межвидовую кросс-реактивность с лейкоцитами лошади и показана возможность их использования (Ibrahim et al., 2007). В связи с этим, не имея специфичных антител против антигенов лошади, мы окрашивали МСК(ЖТ), культивируемые в разных условиях на  10-м пассаже, антителами против тех же антигенов, что и МСК(ПК) лошади.

Как видно из результатов, представленных на рис. 2, МСК(ЖТ) лошади не окрашивались на CD34 (сиаломуцин) и CD31 (PECAM), которые выявляются на поверхности гемопоэтических стволовых и эндотелиальных клеток соответственно. Количество клеток с фенотипом CD90⁺ в условиях бессывороточного культивирования было сопоставимо с контролем и не менялось. Результаты показывают, что статистически значимых различий экспрессии одного из маркеров фенотипа МСК (CD90) не обнаружено (P ≤ 0.01). Ранее другими авторами (Shubert et al., 2018) было показано, что при культивировании МСК лошадей в БС (среде MACX) на 3-м пассаже доля клеток положительно окрашенных на CD29 и CD90 варьировала от ٦0.3 до 99.3% и от 5.21 до 36.7% соответственно. Клетки, культивируемые в DMEM, показали более стабильную популяцию с фенотипом CD90⁺ (86.2–99.5%).

Рис. 2. Гистограммы проточной цитометрии с использованием специфических антител, демонстрирующие количество клеток, несущих антигены CD31, CD34, CD90. Серым цветом выделены гистограммы, соответствующие контрольному окрашиванию клеток IgG, меченными FITC; белым – гистограммы, соответствующие окрашиванию специфическими АТ, меченными FITC.

Прогениторные свойства МСК(ЖТ) лошади. Из-за отсутствия панели специфичных антител против антигенов лошади в настоящих экспериментах оценивали влияние условий культивирования в присутствии и отсутствии СКПК на функциональные свойства МСК, а именно формировать при индукции клетки жировой, костной и хрящевой тканей. На  2 1-е сут культивирования МСК в среде, содержащей индукторы, которые направляют дифференцировку в направлении жировой ткани, наблюдали формирование адипоцитов с липидными везикулами как в клетках, культивируемых в стандартных условиях, так и в БС MesenСult (рис. 3а, б). При индукции МСК(ЖТ) в остеогенном направлении на  2 1-е сут окраска методом серебрения по Косса выявила наличие солей кальция в межклеточном пространстве в обеих группах, которые окрашивались в черный цвет (рис. 3в, г), а при индукции в хондрогенном направлении в это же время отмечали формирование клеточных пучков, которые окрашивались альциановым синим в синий цвет (рис. 3д, е). Таким образом, МСК(ЖТ) лошади in vitro сохраняли свои прогениторные свойства при индукции к дифференцировке независимо от способа их культивирования в течение  10 пассажей.

Рис. 3. Способность МСК(ЖТ) лошади формировать клетки жировой (а, б), костной (в, г) и хрящевой (д, е) тканей при индукции к дифференцировке после культивирования в течение 10 пассажей в стандартной среде и БС. Увел.: об. 20×, ок. 10×.

Результаты наших экспериментов показали, что МСК(ЖТ) лошади могут быть размножены в коммерчески доступной среде MesenCult, не содержащей СКПК, которая предназначена для культивирования МСК человека (www.stemcell.com). МСК сохраняли единообразную морфологию, характерную для этого типа клеток, на протяжении  10 пассажей и экспрессию гена поверхностного антигена CD90, сопоставимую с контрольной группой (P ≤ 0.01), а также при индукции были способны к дифференцировке в адипо-, остео- и хондрогенном направлениях.

В настоящее время сообщений о результатах, демонстрирующих возможность использования такой среды для поддержания клеток с фенотипом МСК других видов животных недостаточно. Высказывается предположение, что требования к условиям культивирования в БС являются видоспецифичными (Schubert et al., 2018). Это указывает на необходимость оптимизации БС для МСК соответствующих видов животных. Так, имеются данные о подержании без ксенобелков МСК(ЖТ) собак и лошадей, которые не теряют свои прогениторные свойства (Clark et al., 2016). Однако удаление СКПК из систем культивирования МСК собак и лошадей привело к снижению пролиферации этих клеток и изменению их иммуномодулирующих свойств in vitro. МСК лошади секретировали значительно меньше простагландина  2 (PGE2) и утрачивали способность ингибировать секрецию интерферона γ (IFNγ) активированными Т-лимфоцитами, в то время как у МСК(ЖТ) собак такого влияния не выявлено (Clark et al., 2016). Требуются дополнительные исследования для перехода к условиям размножения МСК животных в БС. Следует отметить, что в большинстве исследований на МСК животных, включая человека, не всегда проводился анализ влияния той или иной БС на экспрессию генов поверхностных антигенов, подтверждающих иммунофенотип МСК. Прогениторные свойства МСК после бессывороточного культивирования также оценивали в разной степени и эти данные тоже носят противоречивый характер (Lee et al., 2022; Chen et al., 2023).

В связи с этим предпринимаются попытки с помощью подбора комбинаций факторов роста разработать свою БС, способную поддерживать пролиферацию и клонообразующую способность МСК определенного вида in vitro. В результате такого подбора была создана БС, пригодная для культивирования МСК(ЖТ) собак (Devireddy et al., 2019), в которой характеристики роста клеток были сопоставимы с характеристиками, полученными в стандартной среде ДМЕМ, содержащей 10% СКПК. Кроме того, наличие поверхностных белков на клеточной поверхности и прогениторный потенциал МСК(ЖТ) собак в БС и в стандартных условиях также были схожими. Однако коммерческая БС, разработанная для культивирования МСК человека, не способствовала росту МСК(ЖТ) собак. В этой работе (Devireddy et al., 2019), продемонстрировано, что требования к факторам роста для выделения и размножения МСК(ЖТ) собак отличались от требований, предъявляемых к росту МСК(ЖТ) человека. Например, bFGF и TGF-β 1 способствуют росту МС(ЖТ) человека в культурах с БС. bFGF также поддерживает рост МСК(ЖТ) собак, в то время как TGF-β 1 негативно влияет на эти клетки и снижает клеточную пролиферацию.

Анализ научных данных, полученных другими коллективами, показал, что условия бессывороточного культивирования МСК интенсивно изучаются применительно к человеку (Gottiparmula et al., 2013; Oikonomopoulos et al., 2015; Bui et al., 2021) лошади и собаке (Pilgrim et al, 2022). При этом используются БС, большинство из которых коммерчески доступны, поэтому их составы не раскрыты и не могут сравниваться. Расшифровка компонентов БС все еще редко встречается в литературе. Осложняет оценку перспективности использования этих сред неоднородность клеточных популяций МСК из-за отсутствия стандартных методов их выделения различными группами, что уменьшает возможность сопоставлять результаты. Кроме того, существенным сдерживающим фактором является как отсутствие специфических антител против антигенов лошади, так и отсутствие гена-маркера, экспрессия которого была бы специфична именно для этих клеток.

Таким образом, результаты проведенных нами исследований показывают, что размножение МСК лошади в БС MesenCult, предназначенной для культивирования МСК человека, возможно, так как клетки хорошо к ней адаптируются и сохраняют свойства, характерные для них при культивировании в среде ДМЕМ с СКПК: морфологию, скорость роста, время удвоения и митотический индекс, клонообразующие способности, диплоидный набор хромосом, высокую долю клеток с фенотипом CD90 и низкое с фенотипом CD31, CD34, способности к дифференцировке в адипо-, остео- и хондорогенном направлениях. МСК(ЖТ) лошади демонстрировали стабильные характеристики после культивирования в течение 10 пассажей в БС, что обеспечивает многообещающую основу для их дальнейшего использования. Наши результаты подчеркивают важность контроля качества, включая функциональные анализы, всех отдельных образцов МСК, которые будут использоваться в доклинических исследованиях или ветеринарной терапии.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа финансировалась за счет средств бюджета ФНЦ – Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко РАН (тема FGUG- 20 2 2-00 10). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Автор работы заявляет, что у нее нет конфликта интересов.

作者简介

I. Savchenkova

编辑信件的主要联系方式.
Email: s-ip@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件

附件文件

动作

1. JATS XML

下载

2. Fig. 1. Morphology of equine MSCs (AT) cultured in normal medium (a, c, d) and MesenCult BS (b, d, e) on the 4th day after seeding (a, b) and at passages 4 (c, d) and 10 (d, e). Magnification: vol. 10×, approx. 10×.

下载 (1MB)

索引源数据

3. Fig. 2. Histograms of flow cytometry using specific antibodies, demonstrating the number of cells bearing the antigens CD31, CD34, CD90. Histograms corresponding to control staining of cells with FITC-labeled IgG are shown in gray; histograms corresponding to staining with specific FITC-labeled AB are shown in white.

下载 (224KB)

索引源数据

4. Fig. 3. The ability of equine MSCs (AT) to form cells of adipose (a, b), bone (c, d) and cartilage (d, e) tissues upon induction of differentiation after culturing for 10 passages in standard medium and BS. Magnification: 20× ob., 10× approx.

下载 (944KB)

索引源数据