Hypochlorous acid – a potential secondary messenger in the process of neutrophils’ respiratory burst development

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Hypochlorous acid and hypochlorite ions are formed in the halogenating cycle of myeloperoxidase, localized mainly in neutrophils, and play a primary role in antimicrobial protection. The paper presents the results of a study of the effect of exogenous HOCl/OCl– in micromolar concentrations on the mechanisms of the “respiratory burst” formation by neutrophils stimulated to phagocytosis. It is shown that this oxidizer is capable of stimulating the functional activity of neutrophils, which is expressed in an increase in the yield of reactive oxygen and chlorine species (ROСS) and secretory degranulation of cells. Enhancement of the “respiratory burst” is associated with activation of NADPH oxidase, PI-3K, MAP kinase ERK1/2 and a decrease in the contribution of intracellular myeloperoxidase to ROСS production by neutrophils. It was found that HOCl/OCl– in the studied concentrations is capable of inhibiting myeloperoxidase activity. It is suggested that hypochlorous acid should be considered as a new potential secondary messenger regulating neutrophil functions.

Full Text

Принятые сокращения: АФКХ – активные формы кислорода и хлора; МПО – миелопероксидаза; СБСРЭ – сбалансированный буферный солевой раствор Эрла; ФИ-3К – фосфатидилинозитол-3-киназа; ФМА – форбол-12-миристат-13-ацетат; ХЛ и Люм-ХЛ – хемилюминесценция и люминолзависимая ХЛ соответственно; АВАН – гидразид 4-аминобензойной кислоты; DPI – хлорид дифенилениодония; PI – йодистый пропидий.

Хлорноватистая кислота и ионы гипохлорита (HOCl/OCl–) образуются в галогенирующем цикле гемсодержащих пероксидаз млекопитающих, важнейшей из которых является миелопероксидаза (МПО) (донор: Н2О2-оксидоредуктаза, EC 1.11.1.7), локализованная преимущественно в нейтрофилах (Arnhold, Malle, 2022). Стимуляция нейтрофилов к фагоцитозу сопровождается усилением генерации супероксидных анион-радикалов (O2−) НАДФН-оксидазой этих клеток (Zeng et al., 2019). Под действием супероксиддисмутазы O2− спонтанно трансформируется в пероксид водорода, который в реакции, катализируемой МПО, взаимодействует с хлорид-ионами с образованием HOCl/OCl–. Хлорноватистая кислота является высокореакционным интермедиатом и участвует в реакциях хлорирования и окисления, модифицируя или фрагментируя белки, ДНК, липиды и другие соединения (Prütz, 1996; Panasenko et al., 2007; Winter et al., 2008; Andrés et al., 2022). Благодаря этим свойствам, HOCl уничтожает патогены. Однако, гиперпродукция HOCl может приводить к цитотоксическим эффектам в отношении клеток хозяина и провоцировать воспаление, которое является причиной развития ряда патологий, таких как сердечно-сосудистые (Teng et al., 2017; Ndrepepa, 2019), ревматоидные (Fernandes et al., 2012; Leopold, Schiller, 2024), нейродегенеративные и др. (Ray, Katyal, 2016; Pravalika et al., 2018). Выявлено, что в очаге воспаления количество МПО, секретируемой накопленными нейтрофилами, достигает 1–2 мМ (Weiss, 1989; Kettle, Winterbourn, 1994; Hampton et al., 1998), а в интерстициальной жидкости воспаленных тканей фагоциты продуцируют до 25–50 мМ/ч HOCl (Ulfig, Leichert, 2021). В результате МПО и ее основной продукт HOCl в высоких концентрациях регулируют ряд событий в очаге воспаления посредством структурной модификации биологически важных молекул или их деструкции.

Молекулярные механизмы цитодеструктивного и регуляторного действия хлорноватистой кислоты в высоких концентрациях при воспалении активно изучаются, но остается до конца невыясненной роль этого соединения в низких концентрациях в процессах метаболизма. В настоящее время доказано участие пероксида водорода в процессах сигнализации (Gamaley et al., 1994; Kulahava et al., 2007; Ткачук и др., 2012; Sies, 2017; Fichman et al., 2024). Следует отметить, что уже существуют данные о способности HOCl выполнять функцию сигнальной молекулы. Показано, что экзогенная хлорноватистая кислота усиливает образование супероксидных анион-радикалов и индуцирует апоптоз в опухолевых клетках (Bauer, 2018; Семенкова и др., 2024), вызывает транслокацию транскрипционных факторов в ядро Т-лимфоцитов (Schoonbroodt et al., 1997), активирует белки-супрессоры опухолей и тем самым регулирует рост клеток (Vile et al., 1998), контролирует активность металлопротеиназ (Fu et al., 2004; Wang et al., 2022).

Ранее нами установлено, что для стимулированных адгезией нейтрофилов, подвергшихся воздействию нетоксичных концентраций NaOCl, характерно нарушение клеточной подвижности, изменение формы и размеров клеток, происходит реорганизация цитоскелета, обусловленная перераспределением F-актина (Kuznetsova et al., 2017). Это позволяет предположить, что хлорноватистая кислота в микромолярных концентрациях может влиять на функциональную активность нейтрофилов.

Цель настоящей работы заключалась в изучении механизмов влияния экзогенной хлорноватистой кислоты в микромолярных концентрациях на формированние респираторного взрыва нейтрофилами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Реактивы. В работе использовали: декстран-500, гистопак-1077, люминол, среду RPMI-1640, пептид fMLP (N-формилметионил-лейцил-фенилаланин), пероксид водорода, гипохлорит натрия, PD-98059 (2-(2-амино-3-метоксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-он), DPI (хлорид дифенилениодония), ABAH (гидразид 4-аминобензойной кислоты), LY294002 (2-(морфолин-4-ил)-8-фенил-4H-1-бензопиран-4-он), LPS (липополисахарид В), ФМА (форбол-12-миристат-13-ацетат), ФГА (фитогемагглютинин), GSH (восстановленный глутатион), бактерии Micrococcus lysodeikticus, МПО, Triton Х-100, Hepes (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), PI (йодистый пропидий) (все реагенты фирмы Sigma, США); ТМБ (3,3’,5,5’-тетраметилбензидин; Carl Roth, Германия); суспензию латекса для фагоцитоза (1.5 мкм; “ПанЭко”, Россия). Компоненты для приготовления фосфатного (PBS), фосфат-цитратного буферных растворов, а также сбалансированного буферного солевого раствора Эрла (СБСРЭ) получены от фирм “Анализ Х” (Белоруссия) и “Реахим” (Россия).

Нейтрофилы выделяли из гепаринизированной крови кроликов и здоровых людей в градиенте плотности гистопака-1077 по стандартной методике (Böyum, 1976). Клетки суспендировали в среде RPMI-1640 (рН 7.4). Полученные суспензии хранили при температуре тающего льда. Жизнеспособность клеток, оцениваемая с помощью трипанового синего, составляла 95–97%. Перед изучением функциональной активности клетки переводили в раствор СБСРЭ, рН 7.4.

Рабочие растворы гипохлорита натрия (NaOCl) готовили из его коммерческого 5%-го раствора путем разбавления раствором 0.15 М NaCl перед началом эксперимента. Концентрацию гипохлорит-ионов определяли спектрофотометрически по поглощению OCl– при 290 нм и рН 12 (молярный коэффициент экстинкции ε290 = = 350 М–1 см–1) (Morris, 1966). Конечное значение pH в экспериментах было примерно таким же, как pKa для HOCl (7.5), поэтому предполагается, что в растворе присутствуют примерно равные количества HOCl и OCl–. К контрольным образцам добавляли соответствующее количество 0.15 М NaCl.

Регистрация активных форм кислорода и хлора (АФКХ). Генерацию АФКХ нейтрофилами человека изучали методом люминол-зависимой хемилюминесценции (Люм-ХЛ) на биохемилюминометре БХЛ-1 (БГУ, Белоруссия) с использованием системы сбора и обработки данных “Юнихром” (“Новые аналитические системы”, Белоруссия). Люм-ХЛ нейтрофилов кролика регистрировали на люмиагрегометре (P.I.C.A.) (Chrono-log Corporation, США). Концентрация люминола составляла 20 мкмоль/л, нейтрофилов в суспензии – 1 млн/мл. Нейтрофилы стимулировали к фагоцитозу добавлением к суспензии клеток в СБСРЭ 0.1 мкМ fMLP или 25 мкг/мл LPS, или 5 мкг/мл ФМА, или 20 мкл суспензии латекса, или адгезией к поверхности кварцевого стекла. NaOCl добавляли к суспензии клеток в СБСРЭ до внесения стимулятора и люминола. Пробоподготовку и регистрацию Люм-ХЛ проводили при температуре 37 °С. Интенсивность свечения выражали в усл. ед. На рисунках представлены усредненные зависимости интегральной интенсивности ХЛ по данным не менее 5 независимых экспериментов. Интегральную интенсивность определяли как площадь под кинетической кривой интенсивности ХЛ люминола в суспензии нейтрофилов, рассчитанной с момента начала стимуляции в течение 10 мин регистрации. Светосумму рассчитывали численным интегрированием кривой интенсивности с использованием метода прямоугольников (программа Excel 2000).

Использование ингибиторов. Влияние NaOCl на процессы внутриклеточной сигнализации в нейтрофилах определяли с помощью специфических ингибиторов компонентов сигнальных путей, вовлеченных в генерацию АФКХ: DPI для НАДФН-оксидазы; АВАН для МПО; вещество PD-98059 для МАР-киназы ERK1/2; вещество LY-294002 для фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ-3K). NaOCl вносили в суспензию клеток за 10 мин до введения ингибиторов, на 20 мин, затем нейтрофилы стимулировали адгезией и регистрировали Люм-ХЛ.

Секреторную дегрануляцию определяли по выходу лизоцима из клеток (Shugar, 1952). Активность лизоцима в супернатанте оценивали по скорости лизиса клеточных стенок бактерий Micrococcus lysodeikticus спектрофотометрически при длине волны 450 нм на спектрофлуориметре СМ 2203 (“Солар”, Минск, Белоруссия). Предварительно свежеизолированные нейтрофилы обрабатывали NaOCl в соответствующей концентрации и инкубировали в СБСРЭ рН 7.4 в течение 15 мин при температуре 37 °С.

Пероксидазную активность МПО определяли по скорости окисления ТМБ пероксидом водорода в присутствии МПО в окрашенный продукт – 3,3’,5,5’-тетраметилбензидиндиимин (Pulli et al., 2013). В фосфат-цитратный буферный раствор (рН 5.0) добавляли МПО (2 ед./мл), NaOCl в концентрации из диапазона 1–100 мкМ и инкубировали 10 мин при 37 °С. Затем вносили 1.6 мМ TMБ. Реакцию инициировали добавлением 0.3 мМ Н2О2, через 5 мин реакцию останавливали добавлением 2 н раствора серной кислоты. Оптическую плотность регистрировали на спектрофлуориметре СМ2203 при длине волны 450 нм. Для расчета концентрации продукта ферментативной реакции использовали ɛ = 5.9 × 104 М–1 cм–1.

Жизнеспособность клеток оценивали флуоресцентным методом с использованием йодистого пропидия (PI; длина волны возбуждения и регистрации соответственно 530 и 640 нм) на спектрофлуориметре СМ 2203. Суспензию нейтрофилов (1 млн/мл в СБСРЭ) контрольную и содержащую NaOCl (5–100 мкМ) инкубировали в течение 15 мин при 37 °С. Затем к образцам добавляли 10 мкМ раствора PI. Клетки перемешивали, выдерживали в течение 5 мин и измеряли интенсивность флуоресценции Fd1. Затем клетки разрушали с помощью 10%-ного раствора тритон Х-100 и регистрировали интенсивность флуоресценции Ft1. Жизнеспособность клеток определяли по формуле:

Ft1−Ft2−Fd1−Fd2Ft1−Ft2⋅100%,

где Fd1, Ft2 – параметры интенсивности флуоресценции PI в клеточной суспензии в отсутствие (Fd1) и в присутствии (Ft1) тритона Х-100, Fd2 и Ft2 – параметры интенсивности флуоресценции PI в СБСРЭ в отсутствие (Fd2) и в присутствии (Ft2) тритона Х-100 соответственно (Kato et al., 1999).

Статистическая обработка результатов. Использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA). Различия между контрольной и экспериментальной группами анализировали с помощью теста Даннета. Результаты представлены в виде среднего значения из трех и более независимых экспериментов и его стандартного отклонения. Различия считали достоверными при Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследовано действие гипохлорита натрия на усиленную люминолом ХЛ стимулированных ФМА нейтрофилов крови кролика (рис. 1). Установлено, что характер действия NaOCl зависит от его концентрации. В низкой концентрации (5–10 мкМ) наблюдается усиление ХЛ; как правило, введение 5–10 мкМ NaOCl сопровождается усилением интенсивности свечения в максимуме в 2.5–3 раза соответственно по сравнению с контролем. Следовательно, в низких концентрациях экзогенный гипохлорит оказывает синергический (стимулирующий) эффект: в сочетании с агонистом (ФМА) резко усиливает ХЛ в системе стимулированные нейтрофилы–люминол. При более высоких концентрациях NaOCl (20–40 мкМ) наблюдается практически полное снижение интенсивности свечения (рис. 1, кривые 4, 5). По-видимому, тушение Люм-ХЛ в суспензии нейтрофилов гипохлоритом натрия в концентрации свыше 20 мкМ свидетельствует о подавлении функциональной активности самих клеток.

 

Рис. 1. Кинетические кривые интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов кролика, стимулированных ФМА в контроле (1) и при действии гипохлорита натрия (2–5) соответственно в конечных концентрациях 1, 10, 20 и 40 мкМ. ФМА (5 мкг/мл) вводили в суспензию нейтрофилов (106 клеток в 1 мл) сразу после люминола (20 мкМ). Время предварительного инкубирования клеток с гипохлоритом натрия 5 мин. Iн, (%) – нормированная интенсивность ХЛ: в контроле (1) в максимуме интенсивность свечения принята за 100%. Представлены усредненные зависимости интенсивности ХЛ по данным 10 независимых экспериментов; разброс данных представлен среднеквадратичной ошибкой средней величины.

 

Подобный эффект был зарегистрирован нами при изучении влияния NaOCl на способность нейтрофилов крови человека генерировать АФКХ. Как видно из рис. 2, преинкубирование нейтрофилов в течение 10 мин с NaOCl приводит к значительному повышению интенсивности Люм-ХЛ при стимуляции к фагоцитозу как специфическими (fMLP, LPS), так и неспецифическими (латекс и адгезия) стимуляторами (рис. 2а, б), что свидетельствует об усилении генерации АФКХ. Увеличение интенсивности ХЛ клеток по сравнению с контролем наблюдается в диапазоне концентраций NaOCl от 7.5 до 75 мкМ (а в случае стимуляции адгезией – до 50 мкМ). Так, при добавлении 15 мкМ NaOCl к суспензии клеток за 30 мин до начала их адгезии к поверхности стекла интегральная интенсивность Люм-ХЛ повышается более чем в 3 раза по сравнению с контролем. При использовании других стимуляторов фагоцитоза выход Люм-ХЛ повышался в 1.5–2 раза.

 

Рис. 2. Зависимость суммарной интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов человека, стимулированных латексом и адгезией (а), а также fMLP и LPS (б), от концентрации NaOCl. Интегральная интенсивность ХЛ клеток в присутствии (ΣIХЛ) и в отсутствие (ΣIХЛО) NaOCl измерена в течение 10 мин с момента добавления люминола. Концентрация fMLP – 0.1 мкМ, LPS – 25 мкг/мл. Время предварительного инкубирования нейтрофилов с NaOCl 10 мин. Результаты представлены как средние значения и их стандартные отклонения.

 

Известно, что NaOCl сам индуцирует ХЛ люминола (Рощупкин и др., 2006). При этом NaOCl, вносимый в раствор этого индикатора, вызывает кратковременную вспышку ХЛ, длительность которой не превышает 3–5 с.

Чтобы исключить вклад в ХЛ нейтрофилов свободнорадикальных продуктов, образуемых при взаимодействии люминола с NaOCl, нами изучена зависимость максимальной интенсивности ХЛ, возникающей в реакции окисления люминола NaOCl в исследуемом диапазоне концентраций. Как показано на рис. 3, свечение практически не регистрируется при концентрации гипохлорита натрия от 1.5 до 45 мкМ.

 

Рис. 3. Зависимость максимальной интенсивности хемилюминесценции (Imax) от концентрации гипохлорита натрия (NaOCl) в реакции окисления им люминола. Результаты представлены как средние значения и их стандартные отклонения.

 

Дальнейшее повышение концентрации NaOCl до 150 мкМ приводило к увеличению выхода радикальных продуктов. Причем, зарегистрированная в первые 3–5 с максимальная интенсивность ХЛ была в десятки раз выше, чем в системе NaOCl–люминол–нейтрофилы. Следовательно, представленные на рис. 1 и 2 данные не связаны с прямым взаимодействием люминола с NaOCl, а обусловлены изменением функциональной активности нейтрофилов.

Образование АФКХ в нейтрофилах при их стимуляции к фагоцитозу сопряжено с активацией мембранных рецепторов, что в дальнейшем приводит к запуску процессов внутриклеточной сигнализации, включающих сборку НАДФН-оксидазного комплекса и усиление транслокации МПО к плазматической мембране (Zeng et al., 2019). Как уже отмечалось, некоторые типы активных форм кислорода, в частности Н2О2, играют роль вторичных мессенджеров в формировании функционального отклика клеток (Kulahava et al., 2007; Ткачук и др., 2012). Нами изучено влияние на генерацию АФКХ специфических ингибиторов ферментов, участвующих в процессах трансдукции активационного сигнала в нейтрофилах, до и после их предварительного инкубирования с 15 мкМ NaOCl (рис. 4).

 

Рис. 4. Влияние ингибиторов ферментов на степень ингибирования люминол-зависимой ХЛ нейтрофилов крови человека в присутствии (светлые столбики) и в отсутствие (темные столбики) NaOCl (15 мкМ). Клетки стимулировали адгезией к поверхности стекла. Время предварительного инкубирования нейтрофилов с NaOCl – 30 мин, время регистрации ХЛ – 10 мин; температура – 37 °С, рН 7.4. Показаны ингибиторы: НАДФН-оксидазы (DPI, 1 мкМ); миелопероксидазы (АВАН, 50 мкМ); фосфатидилинозитол-3-киназы (LY-294002, 3.5 мкМ) и МАР-киназы ERK1/2 (PD-98059, 25 мкМ). По вертикали указана степень ингибирования ХЛ ((ΣI0 – ΣIi) / ΣI0) · 100%), где ΣI0 и ΣIi – суммарная интенсивность свечения клеток в отсутствие и в присутствии ингибитора соответственно. Результаты представлены как средние значения и их стандартные отклонения.

 

После обработки клеточной суспензии гипохлоритом натрия степень ингибирования продукции АФКХ нейтрофилами возрастает при подавлении активности НАДФН-оксидазы с помощью DPI, ФИ-3К – веществом LY-294002 и ERK1/2 – веществом PD-98059. При этом степень ингибирования АФКХ значительно снижается при блокировании активности МПО с помощью АВАН. Из этих данных следует, что преинкубирование нейтрофилов с 15 мкМ NaOCl приводит к перераспределению вклада ферментов, продуцирующих активные метаболиты: уменьшается продукция хлорноватистой кислоты ферментом МПО и увеличивается образование супероксидных анион-радикалов НАДФН-оксидазой, что приводит к увеличению выхода пероксида водорода в результате дисмутации O2−.

Обработка клеток, предварительно инкубированных со специфическими ингибиторами ФИ-3К и ЕRK1/2, а также NaOCl, приводит к значительному повышению степени ингибирования ХЛ, что свидетельствует об увеличении вклада этих белков в генерацию АФКХ нейтрофилами по сравнению с контролем. Увеличение вклада ФИ-3К и ЕRK1/2 в усиленное под действием NaOCl образование АФКХ свидетельствует о модификации сигнальных путей с вовлечением этих ферментов в формирование респираторного взрыва. Известно, что ФИ-3К участвует в активации НАДФН-оксидазы, способствует перераспределению F-актина и секреторной дегрануляции (Hirsch et al., 2000; Paclet et al., 2022). ERK1/2 также усиливает секреторную дегрануляцию нейтрофилов (Hu et al., 2015). Как показано нами ранее, в первые минуты действия на нейтрофилы 15 мкМ NaOCl происходит опосредованная перераспределением F-актина реорганизация цитоскелета, изменяется форма и размеры клеток, повышается их адгезивность (Kuznetsova et al., 2017).

Важным свойством стимулированных к фагоцитозу нейтрофилов является секреторная дегрануляция. В результате этого процесса из клеток во внеклеточное пространство выделяется содержимое азурофильных гранул, включающих лизоцим, МПО, кислые гидролазы, эластазу и другие ферменты, которые обеспечивают уничтожение чужеродного материала (Lacy, 2006). На рис. 5 показано влияние NaOCl на секрецию лизоцима из нейтрофилов. Видно, что инкубирование клеток с 1.5–5 мкМ NaOCl в течение 15 мин не влияет на выход лизоцима во внеклеточную среду, тогда как в диапазоне концентраций этого окислителя от 7.5 до 50 мкМ секреция лизоцима дозозависимо усиливается, что также подтверждает стимулирующее действие гипохлорита натрия на нейтрофилы.

 

Рис. 5. Влияние гипохлорита натрия на секрецию лизоцима из нейтрофилов крови человека. Время инкубирования клеток с NaOCl – 15 мин. Секрецию лизоцима оценивали по скорости лизиса клеточных стенок бактерий Micrococcus lysodeikticus. Результаты представлены как средние значения и их стандартные отклонения.

 

Усиление секреторной дегрануляции нейтрофилов под действием NaOCl приводит к повышению выхода МПО во внеклеточную среду. При этом оценка вклада этого фермента в продукцию АФКХ внутри клеток (см. рис. 4) указывает на его снижение. Увеличение выхода ферментов из клеток может быть связано с цитодеструкцией. Чтобы исключить цитодеструктивное действие NaOCl, мы изучили его влияние на жизнеспособность клеток с использованием PI. Как видно из табл. 1, через 15 мин после добавления NaOCl в концентрации от 5 до 100 мкМ жизнеспособность нейтрофилов по сравнению с контролем уменьшается не более, чем на 12.8 ± 3.2%. Из этого следует, что зарегистрированное нами усиление генерации АФКХ нейтрофилами после добавления NaOCl (рис. 2) в диапазоне концентраций 7.5–75 мкМ обусловлено стимулирующим действием гипохлорита на функциональную активность клеток и не связано с его цитотоксичностью.

 

Таблица 1. Влияние гипохлорита натрия на жизнеспособность нейтрофилов

Концентрация NaOCl, мкМ

Жизнеспособность, %

0

100

5

97.7 ± 1.8

15

95.8 ± 2.2

30

94.3 ± 2.6

50

90.4 ± 2.5

75

89.5 ± 2.9

100

87.2 ± 3.2

Примечание. Клетки инкубировали с NaOCl в течение 15 мин.

 

Учитывая способность хлорноватистой кислоты эффективно взаимодействовать с молекулами белков (Prütz, 1996; Panasenko et al., 2007), мы исследовали влияние NaOCl на пероксидазную активность МПО (рис. 6). Видно, что гипохлорит натрия в концентрациях от 5 до 100 мкМ дозозависимо снижает активность анализируемого фермента. Следовательно, экзогенный гипохлорит натрия в низких концентрациях способен значительно уменьшать активность секретированной из клеток МПО.

 

Рис. 6. Активность МПО под действием гипохлорита натрия. Время предварительного инкубирования NaOCl/АВАН с МПО – 10 мин. Концентрация АВАН – 1 мкМ. Результаты представлены как средние значения и их стандартные отклонения.

 

Ранее установлено, что гипохлорит натрия с наибольшей константой скорости реагирует с сульфгидрильными группами молекул, затем инактивируются тиоэфирные и только после этого аминогруппы (Мурина и др., 1989; Folkes et al., 1995). На основании этих данных можно предположить, что в нашем случае гипохлорит натрия, взаимодействуя в первую очередь с сульфгидрильными и, возможно, с другими функциональными группами мембранных белков нейтрофилов, предактивирует (праймирует) клетки, что приводит к усилению респираторного взрыва в ответ на различные стимулы. Известно, что для избирательной нейтрализации экстраклеточных оксидантов можно применять непроникающий в клетки восстановленный глутатион, действие которого обусловлено исключительно наличием сульфгидрильной группы.

Использование восстановленного глутатиона позволяет отделить АФКХ, образуемые внутри клеточных структур и генерируемые в окружающей среде (Мурина и др., 2005). Восстановленный глутатион добавляли к суспензии нейтрофилов кроликов после их инкубации в течение 3 мин с 5 мкМ NaOCl до добавления ФМА (рис. 7). Введение восстановленного глутатиона в суспензию нейтрофилов вызывает уменьшение интенсивности Люм-ХЛ в максимуме примерно на 30–35% (рис. 7, кривая 2). После добавления гипохлорита натрия (рис. 7, кривая 3), тушение ХЛ в этой системе восстановленным глутатионом было больше и составляло примерно 55% (рис. 7, кривая 4). Свечение, которое остается после действия восстановленного глутатиона как в присутствии (рис. 7, кривая 4), так и в отсутствие (рис. 7, кривая 2) экзогенного NaOCl, составляет примерно 65% по сравнению с контролем (рис. 7, кривая 1). Следовательно, восстановленный глутатион полностью подавляет усиленную гипохлоритом Люм-ХЛ нейтрофилов, обусловленную окислением люминола экстраклеточными оксидантами. Причем среди таких оксидантов основным является хлорноватистая кислота, генерируемая МПО, секреция которой во внеклеточную среду, как это следует из рис. 5, усиливается под действием экзогенного NaOCl.

 

Рис. 7. Действие восстановленного глутатиона (GSH) на усиленную гипохлоритом хемилюминесценцию люминола в суспензии нейтрофилов крови кролика. Кривая 1 – контроль (к нейтрофилам добавлен люминол и ФМА); 2 – GSH (0.2 мМ) введен в суспензию нейтрофилов до ФМА; 3 – NaOCl (5 мкМ) введен в суспензию нейтрофилов за 3 мин до ФМА; 4 – NaOCl (5 мкМ) введен в суспензию нейтрофилов за 3 мин до GSH (0.2 мМ) и ФМА. Iн, – нормированная к контролю (100% в максимуме) интенсивность ХЛ. Представлены усредненные зависимости интенсивности ХЛ по данным пяти независимых опытов; разброс данных представлен среднеквадратичной ошибкой средней величины.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из полученных данных следует, что хлорноватистая кислота и ионы гипохлорита в микромолярных концентрациях способны оказывать стимулирующее воздействие на функциональную активность нейтрофилов, что выражается в увеличении выхода АФКХ и усилении секреторной дегрануляции клеток, обработанных индукторами фагоцитоза. Наблюдаемые эффекты связаны с перераспределением вклада компонентов трансдукции активационного сигнала в формирование респираторного взрыва, а именно: с активацией ФИ-3К и МАР-киназы ERK1/2. Индуцируемое HOCl/OCl– повышение выхода АФКХ обусловлено усиленной продукцией под действием НАДФН-оксидазы супероксидных анион-радикалов, дисмутация которых приводит к избыточному образованию субстрата МПО пероксида водорода. Из этого следует, что под действием хлорноватистой кислоты во внеклеточной среде, где уровень МПО повышен в результате секреции содержимого азурофильных гранул, продуцируется дополнительное количество HOCl/OCl–. Однако образование этого окислителя не настолько велико, чтобы оказывать цитодеструктивный эффект, поскольку он дозозависимо ингибирует активность МПО. Мы полагаем, что образуемую под действием МПО хлорноватистую кислоту следует рассматривать в качестве нового потенциального вторичного мессенджера, который способен регулировать функции нейтрофилов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в рамках государственной программы научных исследований “Фундаментальные основы биотехнологий” (№ 20115801), Республика Беларусь.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Забор крови у здоровых добровольцев осуществляли после информированного согласия. Исследование с использованием нейтрофилов кроликов проведено с соблюдением стандартов работы с животными и было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю.М. Лопухина ФМБА России (протокол заседания № 2022/10/05 от 05 октября 2022 г.).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

C.Г.Н.: оригинальная идея и схема экспериментов, анализ и интерпретация полученных данных, написание рукописи; Ж.И.И.: проведение исследований, обсуждение результатов, подготовка статьи; М.М.А.: изучение хемилюминесценции нейтрофилов крови кроликов, обсуждение результатов, подготовка статьи; А.Н.В.: измерение хемилюминесценции нейтрофилов, обработка результатов, подготовка статьи; Р.Д.И.: обсуждение результатов исследований, подготовка статьи.

×

About the authors

G. N. Semenkova

Belarusian State Medical University

Email: n.amaegberi@gmail.com
Belarus, Minsk, 220083

I. I. Zholnerevich

Belarusian State University

Email: n.amaegberi@gmail.com
Belarus, Minsk, 220030

M. A. Murina

Lopukhin Federal Scientific and Clinical Center for Physical-Chemical Medicine of the Federal Medical and Biological Agency

Email: n.amaegberi@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 119435

N. V. Amaegberi

Belarusian State University

Author for correspondence.
Email: n.amaegberi@gmail.com
Belarus, Minsk, 220030

D. I. Roshchupkin

Pirogov Russian National Research Medical University

Email: n.amaegberi@gmail.com
Russian Federation, Moscow, 117513

References

  1. Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И. 1989. Прямое и косвенное противоагрегационное действие гипохлорита натрия на обогащенную тромбоцитами плазму крови. Бюл. экспер. биол. мед. Т. 107. № 12. С. 702. (Murina M.A., Sergienko V.I., Roshchupkin D.I. 1989. Direct and indirect antiaggregatory effect of sodium hypochlorite on platelet-rich blood plasma. Bull. Exp. Biol. Med. V. 107. No. 12. 2008. P. 702.)
  2. Мурина М.А., Рощупкин Д.И., Белакина Н.С., Филиппов С.В., Халилов Э.М. 2005. Усиленная люминолом хемилюминесценция стимулированных полиморфноядерных лейкоцитов: тушение тиолами. Биофизика. Т. 50. № 6. 1100. (Murina M.A., Roshchupkin D.I., Belakina N.S., Filippov S.V., Khalilov E.M. 2005. Luminol-enhanced chemiluminescence of stimulated polymorphonuclear leukocytes: quenching by thiols. Biophysics. V. 50. No. 6. P. 1100.)
  3. Рощупкин Д.И., Белакина Н.С., Мурина М.А. 2006. Усиленная люминолом хемилюминесценция полиморфноядерных лейкоцитов кролика: природа оксидантов, непосредственно вызывающих окисление люминола. Биофизика. Т. 51. № 1. С. 99. (Roshchupkin D.I., Belakina N.S., Murina M.A. 2006. Luminol-enhanced chemiluminescence of rabbit polymorphonuclear leukocytes: the nature of oxidants directly responsible for luminol oxidation, Biofizika. V. 51. No. 1. P. 99.)
  4. Семенкова Г.Н., Квачева З.Б., Жолнеревич И.И., Амаэгбери Н.В., Пинчук С.В. 2024. Гипохлорит-индуцированная модификация свойств астроцитов. Новости медико-биологических наук. Т. 24. № 1. С. 74. (Semenkova G.N., Kvacheva Z.B., Zholnerevich I.I., Amaegberi N.V., Pinchuk S.V. 2024. Hypochlorite-induced modification of astrocyte properties. News of medical and biological sciences. V. 24. No. 1. P. 74.)
  5. Ткачук В.А., Тюрин-Кузьмин П.А., Белоусов В.В., Воротников А.В. 2012. Пероксид водорода как новый вторичный посредник. Биологические мембраны. Т. 29. № 1–2. С. 21. (Tkachuk, V.A., Tyurin-Kuzmin P.A., Belousov V.V., Vorotnikov A.V. 2012. Hydrogen peroxide as a new secondary messenger. Biological membranes. V. 29. No. 1–2. P. 21.)
  6. Andrés C.M.C., Pérez de la Lastra J.M., Juan C.A., Plou F.J., Pérez-Lebeña E. 2022. Hypochlorous acid chemistry in mammalian cells-influence on infection and role in various pathologies. Int. J. Mol. V. 23. Art. ID 10735.
  7. Arnhold J., Malle E. 2022. Halogenation activity of mammalian heme peroxidases. Antioxidants. V. 11. P. 890.
  8. Bauer G. 2018. HOCl and the control of oncogenesis. J. Inorg. Biochem. V. 179. P. 10.
  9. Böyum A. 1976. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Scand. J. Immunol. V. 5. P. 9.
  10. Fernandes R.M. da Silva N.P., Sato E.I. 2012. Increased myeloperoxidase plasma levels in rheumatoid arthritis. Rheumatol. Int. V. 32. P. 1605.
  11. Fichman Y., Rowland L., Nguyen T.T., Chen S.-J., Mittler R. 2024. Propagation of a rapid cell-to-cell H2O2 signal over long distances in a monolayer of cardiomyocyte cells. Redox Biol. V. 70. Art. ID 103069.
  12. Folkes L.K., Candeias L.P., Wardman P. 1995. Kinetics and mechanisms of hypochlorous acid reactions. Arch. Biochem. Biophys. V. 323. P.120.
  13. Fu X., Kao J.L., Bergt C., Kassim S.Y., Huq N.P., d’Avignon A., Parks W.C., Mecham R.P., Heinecke J.W. 2004. Oxidative cross-linking of tryptophan to glycine restrains matrix metalloproteinase activity: specific structural motifs control protein oxidation. J. Biol. Chem. V. 279. P. 6209.
  14. Gamaley I.A., Kirpichnikova K.M., Klyubin I.V. 1994. Activation of murine macrophages by hydrogen peroxide. Cell Signal. V. 6. P. 949.
  15. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. 1998. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. V. 92. P. 3007.
  16. Hirsch E., Katanaev V.L., Garlanda C., Azzolino O., Pirola L., Silengo L., Sozzani S., Mantovani A., Altruda F., Wymann M.P. 2000. Central role for G protein-coupled phosphoinositide 3-Kinase γ in inflammation. Science. V. 287. P. 1049.
  17. Hu N., Qiu Y., Dong F. 2015. Role of Erk1/2 signaling in the regulation of neutrophil versus monocyte development in response to G-CSF and M-CSF. J. Biol. Chem. V. 290. P. 24561.
  18. Kato F., Tanaka M., Nakamura K. 1999. Rapid fluorometric assay for cell viability and cell growth using nucleic acid staining and cell lysis agents. Toxicol. in Vitro. V. 13. P. 923.
  19. Kettle A.J., Winterbourn C.C. 1994. Assays for the chlorination activity of myeloperoxidase. Methods Enzymol. V. 233. P. 502.
  20. Kulahava T.A., Semenkova G.N., Kvacheva Z.B., Cherenkevich S.N. 2007. Regulation of morphological and functional properties of astrocytes by hydrogen peroxide. Cell Tissue Biol. V. 1. Р. 8.
  21. Kuznetsova T., Kulahava T., Zholnerevich I., Amaegberi N., Semenkova G., Shadyro O., Arnhold J. 2017. Morphometric characteristics of neutrophils stimulated by adhesion and hypochlorite. Mol. Immunol. V. 87. P. 317.
  22. Lacy P. 2006. Mechanisms of degranulation in neutrophils. Allergy Asthma Clin. Immunol. V. 2. P. 98.
  23. Leopold J., Schiller J. 2024. (Chemical) Roles of HOCl in rheumatic diseases. Antioxidants (Basel). V. 13. P. 921.
  24. Morris J.C. 1966. The acid ionization constant of HOCl from 5 to 35. J. Phys. Chem. V. 70. № 12. P. 3798.
  25. Ndrepepa G. 2019. Myeloperoxidase – A bridge linking inflammation and oxidative stress with cardiovascular disease. Clin. Chim. Acta. V. 493. P. 36.
  26. Paclet M.-H., Laurans S., Dupré-Crochet S. 2022. Regulation of neutrophil NADPH oxidase, NOX2: a crucial effector in neutrophil phenotype and function. Cell Dev. Biol. V. 10. Art. ID 945749.
  27. Panasenko, O.M. Vakhrusheva T., Tretyakov V., Spalteholz H., Arnhold J. 2007. Influence of chloride on modification of unsaturated phosphatidylcholines by the myeloperoxidase/hydrogen peroxide/bromide system. Chem. Phys. Lipids. V. 149. P. 40.
  28. Pravalika K., Sarmah D., Kaur H., Wanve M., Saraf J., Kalia K., Borah A., Yavagal D.R., Dave K.R., Bhattacharya P. 2018. Myeloperoxidase and neurological disorder: a crosstalk. ACS Chem. Neurosci. V. 9. P. 421.
  29. Prütz W.A. 1996. Hypochlorous acid interactions with thiols, nucleotides, DNA, and other biological substrates. Arch. Biochem. Biophys. V. 332. P. 110.
  30. Pulli B., Ali M., Forghani R., Schob S., Hsieh K.L.C., Wojtkiewicz G., Linnoila J.J., Chen J.W. 2013. Measuring myeloperoxidase activity in biological samples. PLoS ONE. V. 8. Art. ID e67976.
  31. Ray R.S., Katyal A. 2016. Myeloperoxidase: bridging the gap in neurodegeneration. Neurosci. Biobehav. Rev. V. 68. P. 611.
  32. Schoonbroodt S., Legrand-Poels S., Best-Belpomme M., Piette J. 1997. Activation of the NF-κB transcription factor in a T-lymphocytic cell line by hypochlorous acid. Biochem. J. V. 321. P. 777.
  33. Shugar D. 1952. The measurement of lysozyme activity and the ultra-violet inactivation of lysozyme. Biochim. Biophys. Acta. V. 8. P. 302.
  34. Sies H. 2017. Hydrogen peroxide as a central redox signaling molecule in physiological oxidative stress: oxidative eustress. Redox Biol. V. 11. P. 613.
  35. Teng N., Maghzal G.J., Talib J., Rashid I., Lau A.K., Stocker R. 2017. The roles of myeloperoxidase in coronary artery disease and its potential implication in plaque rupture. Redox Rep. V. 22. P. 51.
  36. Ulfig A., Leichert L.I. 2021. The effects of neutrophil-generated hypochlorous acid and other hypohalous acids on host and pathogens. Cell. Mol. Life Sci. V. 78. P. 385.
  37. Vile G.F., Rothwell L.A., Kettle A.J. 1998. Hypochlorous acid activates the tumor suppressor protein p53 in cultured human skin fibroblasts. Arch. Biochem. Biophys. V. 359. P. 51.
  38. Wang Y., Chuan C.Y., Hawkins C.L., Davies M.J. 2022. Activation and inhibition of human matrix metalloproteinase-9 (MMP9) by HOCl, myeloperoxidase and chloramines. Antioxidants. V. 11. P. 1616.
  39. Weiss S.J. 1989. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. V. 320. P. 365.
  40. Winter J., Ilbert M., Graf P.C.F., Ozcelik D., Jakob U. 2008. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. V. 135. P. 691.
  41. Zeng M.Y., Miralda I., Armstrong C.L., Uriarte S.M., Bagaitkar J. 2019. The roles of NADPH oxidase in modulating neutrophil effector responses. Mol. Oral. Microbiol. V. 34. P. 27.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Kinetic curves of intensity of luminol-dependent chemiluminescence (CL) of rabbit neutrophils stimulated by PMA in control (1) and under the action of sodium hypochlorite (2-5), respectively, at final concentrations of 1, 10, 20 and 40 microns. PMA (5 micrograms/ml) was injected into a suspension of neutrophils (106 cells in 1 ml) immediately after luminol (20 micrograms). The time of pre-incubation of cells with sodium hypochlorite is 5 minutes. In, (%) is the normalized light intensity: in control (1), the maximum luminous intensity is assumed to be 100%. The averaged dependences of CL intensity according to 10 independent experiments are presented; the data spread is represented by the root-mean-square error of the average value.

Download (34KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. The dependence of the total intensity of luminol-dependent chemiluminescence (CL) of human neutrophils stimulated by latex and adhesion (a), as well as fMLP and LPS (b), on the concentration of NaOCl. The integral intensity of CL cells in the presence of (ΣIHL) and in the absence of (ΣIHLO) NaOCl was measured within 10 minutes after the addition of luminol.The concentration of fMLP is 0.1 microns, LPS is 25 micrograms/ml. The pre-incubation time of neutrophils with NaOCl is 10 min. The results are presented as averages and their standard deviations.

Download (34KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Dependence of the maximum chemiluminescence intensity (Imax) on the concentration of sodium hypochlorite (NaOCl) in the luminol oxidation reaction. The results are presented as averages and their standard deviations.

Download (23KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. The effect of enzyme inhibitors on the degree of inhibition of luminol-dependent CL of human neutrophils in the presence (light columns) and in the absence (dark columns) of NaOCl (15 microns). The cells were stimulated by adhesion to the glass surface. The time of pre–incubation of neutrophils with NaOCl is 30 minutes, the registration time is 10 minutes; temperature is 37 °C, pH 7.4. Inhibitors are shown: NADPH oxidase (DPI, 1 µm); myeloperoxidase (AVAN, 50 µm); phosphatidylinositol-3-kinase (LY-294002, 3.5 µm) and MAP kinase ERK1/2 (PD-98059, 25 microns). Vertically, the degree of CL inhibition is indicated ((ΣI0 – ΣIi) / ΣI0) · 100%), where ΣI0 and ΣIi are the total intensity of cell luminescence in the absence and presence of the inhibitor, respectively. The results are presented as averages and their standard deviations.

Download (49KB)
Indexing metadata
6. Fig. 5. The effect of sodium hypochlorite on lysozyme secretion from human blood neutrophils. Incubation time of cells with NaOCl is 15 min. Lysozyme secretion was assessed by the rate of lysis of the cell walls of Micrococcus lysodeikticus bacteria. The results are presented as averages and their standard deviations.

Download (16KB)
Indexing metadata
7. Fig. 6. MPO activity under the influence of sodium hypochlorite. The pre–incubation time of NaOCl/AVAN with MPO is 10 min. The concentration of AVAN is 1 micron. The results are presented as averages and their standard deviations.

Download (14KB)
Indexing metadata
8. Fig. 7. The effect of reduced glutathione (GSH) on hypochlorite-enhanced luminol chemiluminescence in rabbit blood neutrophil suspension. Curve 1 – control (luminol and PMA were added to the neutrophils); 2 – GSH (0.2 mM) was introduced into the neutrophil suspension before PMA; 3 – NaOCl (5 microns) was introduced into the neutrophil suspension 3 minutes before PMA; 4 – NaOCl (5 microns) was introduced into the neutrophil suspension 3 minutes before GSH (0.2 mM) and FMA. In, – normalized to control (100% at maximum) the intensity of XL. The averaged dependences of CL intensity according to the data of five independent experiments are presented.; The spread of the data is represented by the root-mean-square error of the average value.

Download (49KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».