Development of an in vitro model of dysferlinopathy via crispr/cas-mediated transcriptional activation of the dysf gene

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

Scientists need cell models from human tissues to develop methods of gene therapy and genome editing for monogenic diseases. It is preferable to use minimally invasive methods to obtain samples; these tissues can be applied for further screening in order to select the most effective approach to restore the synthesis of the target protein. We used the CRISPR/Cas9-SAM transcriptional activation system, which ensures expression of the DYSF gene in HEK293Т cells, as well as in fibroblasts from patients with dysferlinopathy (c.2779delG (Ala927LeufsX21)). After targeted activation of DYSF, it was possible to detect the main gene products: mRNA and protein (HEK293Т_ТА) and mRNA (fibroblasts). Transcriptionally activated dysferlin-deficient fibroblasts and HEK293 cells can be used to evaluate the in vitro efficacy of gene therapy for dysferlinopathies.

Full Text

Restricted Access

About the authors

I. A. Yakovlev

Artgene Biotech; OOO Genotarget, Skolkovo Innovation Center

Author for correspondence.
Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow; Moscow

Y. S. Slesarenko

OOO Genotarget, Skolkovo Innovation Center

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow

I. G. Starostina

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Kazan

A. A. Shaimardanova

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Kazan

V. V. Solovyova

Kazan (Volga Region) Federal University

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Kazan

P. A. Bobrovsky

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow

E. N. Grafskaia

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow

L. D. Belikova

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow

S. N. Bardakov

Artgene Biotech

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow

A. A. Rizvanov

Kazan (Volga Region) Federal University; Division of Medical and Biological Sciences, Tatarstan Academy of Sciences

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Kazan; Kazan

A. A. Isaev

Artgene Biotech

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow

R. V. Deev

Artgene Biotech; OOO Genotarget, Skolkovo Innovation Center; Avtsyn Research Institute of Human Morphology, Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: mail@genotarget.com
Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

References

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. CRISPR/Cas9-SAM transcriptional activation system.

Download (162KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Distribution of fibroblasts isolated from the gums of a patient with dysferlinopathy by surface markers (immunophenotyping). Vertical axis – cell number; horizontal axis – glow intensity of the probe bound to the corresponding antibody. a – Cells negative for markers CD4 5, CD34, CD 1 1b, CD 19 and HLA-DR; b – CD90+ cells (94.4%), b – CD 10 5+ cells (90.5%), d – CD73+ cells (91.5%); d, e – histogram of cell population distribution by GFP fluorescent signal intensity before and after sorting, respectively. Flow cytometry.

Download (682KB)
Indexing metadata
4. Fig. 3. Detection of p53 knockout in fibroblasts. a – Fibroblasts from a patient with dysferlinopathy transduced with LVUHshp53-gfp.3 lentivirus. b – Western blot: KO – immortalized skin fibroblasts from a patient with dysferlinopathy obtained by knockout of the p53 tumor suppressor gene (53 kDa), WT – skin fibroblasts from a patient with dysferlinopathy. M – molecular marker.

Download (203KB)
Indexing metadata
5. Fig. 4. Detection of DYSF mRNA and protein in fibroblasts and HEK 293T cells before (wo TA) and after (TA) transcriptional activation of DYSF using CRISPR/dCas9 SAM. a – Relative expression of dysferlin mRNA (ΔΔCT, RT-PCR) in human myoblasts without a mutation in the DYSF gene used as control cells (HMb), patient fibroblasts after transcriptional activation (TA) of DYSF (HF-mut26-p53_TA) and patient fibroblasts lacking a component of the activation system (HF-mut26-p53 wo TA). b – Relative (ΔΔCT) expression of dysferlin mRNA in HEK 293T cells before and after TA DYSF and C 2C 1 2 cells, which served as a positive control. c, d – Western blots with antibodies to the dysferlin protein and their densitograms (D – optical density), respectively. a, b: Data are presented as mean ± standard error of the mean.

Download (277KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».