Features of the Sorption Interaction of [3H]Hyaluronic Acid with Hydroxyapatite

Full Text

Использование биосовместимых компонентов, которые могут проявлять свои полезные свойства в составе современных медицинских препаратов, является важной актуальной задачей. Логично видится поиск сочетания веществ, которые присутствуют в физиологической среде и не будут рассматриваться организмом как чужеродные, но при этом способствовать доставке и дозированному высвобождению лекарственного средства. Одним из перспективных вариантов такого сочетания является комплекс гидроксиапатита и гиалуроновой кислоты. Гидроксиапатит (ГАП) - основной неорганический компонент костной ткани [1–3]. Гиалуроновая кислота (ГК) – полисахарид, играющий важную роль во многих биологических процессах, таких как регуляция клеточной адгезии, пролиферация клеток, их дифференцирование и многие другие [4, 5]. Оба вещества уже используются в медицине [6–8].

Предполагается, что композиционные материалы на основе гидроксиапатита и гиалуроновой кислоты расширят спектр своего применения за счет комплексного действия, в том числе при лечении заболеваний десен и костей, для ускоренного заживления костных дефектов, в лечении артритов и артрозов. Такие композиты могут найти свое место также и в ядерной медицине при создании современных перспективных радиофармпрепаратов (РФП), поскольку гидроксиапатит уже давно рассматривается как потенциальный носитель терапевтических и диагностических радионуклидов [9, 10]. Здесь ГК может выполнять функцию защитного покрытия наночастиц гидроксиапатита для предотвращения преждевременного высвобождения радионуклидов за счет их комплексообразования с компонентами физиологической среды. Для радионуклидов, неспособных связываться с ГАП, но образующих прочные комплексы с ГК, последняя может выполнить роль молекулы-линкера, а ГАП обеспечит доставку и удержание препарата.

Такие органо-минеральные комплексы можно создать как сокристаллизационным, так и сорбционным способом. В работах авторов [11, 12] было показано, что использование раствора ГК как активной среды синтеза ГАП может существенно повлиять на структуру и морфологию формирующихся наночастиц. Однако до сих пор не было получено информации о количестве ГК, связавшейся с ГАП, а также прочности полученного комплекса в водной и физиологической среде. Это связано с тем, что с применением традиционных аналитических методов очень трудно определить содержание гиалуроновой кислоты в изучаемой системе. Решить эту проблему можно, используя метод радиоактивных индикаторов. Для этих целей удобно использовать долгоживущие радионуклиды химических элементов, входящих в состав ГК - тритий или ¹⁴C. Введение ¹⁴C без химической модификации ГК невозможно или потребует проведения сложного синтеза [13]. Недавно был разработан способ введения трития в гиалуроновую кислоту с помощью метода термической активации в одну стадию путем изотопного замещения водорода на тритий [14]. Было показано, что меченные тритием препараты ГК сохраняют свои свойства, имеют высокую удельную радиоактивность и могут быть использованы в длительных экспериментах без заметной деградации. [³H]ГК была успешно использована для определения условий создания адсорбционных покрытий, образующихся на поверхности наноалмазов и содержащих в своем составе лекарственный препарат мирамистин [15]. Также с помощью [³H]ГК исследовали получение бислойных хитозан/ГК покрытий биологических протезов сердечных клапанов, их устойчивость и антимикробные свойства [16].

В цитированных работах использовали препараты ГК с молекулярной массой от 0.1 до 0.35 МДа. В нашей работе предложено использовать высокомолекулярную ГК (2.37 МДа), так как предполагается, что полисахарид с такой массой в комплексе с ГАП может найти медицинское применение в антираковой терапии [17]. Таким образом, целью данной работы является получение меченной тритием гиалуроновой кислоты со средней молекулярной массой 2.37 МДа и определение особенностей её сорбционного взаимодействия с ГАП, имеющим разную текстуру.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использовали ГК в форме натриевых солей производства BLOOMAGE BIOTECHNOLOGY CORP., LTD., (средняя молекулярная масса M_w 2.37 МДа), а также Lifecore (M_w 0.1 и 0.2 МДа). Для введения трития в ГК применили метод термической активации. Использовали условия проведения экспериментов и очистки препаратов, как описано в [14]. На всех этапах работы радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1215 (LKB, Финляндия), внося аликвоты растворов в сцинтилляционную жидкость UltimaGold (PerkinElmer).

В сорбционных экспериментах использовали гидроксиапатит двух типов:

1) водная суспензия ГАП (ГАП_с) полученная по стандартной методике [18] с содержанием твердой фазы 7.7 ± 0.5 мас% (по массе). Средний размер частиц ГАП_c – 100 × 40 × 10 нм – был определен из данных трансмиссионной электронной микроскопии [18].

2) порошок ГАП (ГАП_п), полученный при высушивании суспензии ГАП_с до постоянной массы при температуре 800°С и размолотый в фарфоровой ступке до размеров частиц 120–180 мкм.

Для введения трития в ГК (2.37 МДа) готовили водный раствор с концентрацией 1 г/л и проводили очистку от низкомолекулярных компонентов с помощью диализа через мембраны (MWCO 8–10 кДа Float-A-LyzerG2 (Spectra/Por)) против дистиллированной воды в течение 3 недель при 4°C. Очищенный препарат равномерно наносили на внутренние стенки реакционного сосуда, замораживали с помощью жидкого азота, удаляли воду лиофилизацией при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционный сосуд присоединяли к установке для работы с газообразным тритием и вакуумировали до остаточного давления 0.005 Па в течение 1 ч. Затем охлаждали стенки жидким азотом, заполняли систему газообразным тритием до 0.5 Па и активировали реакцию изотопного обмена нагреванием вольфрамовой проволоки электрическим током до температуры 1850 K в течение 10 с.

Меченое вещество смывали со стенок реакционного сосуда 4 мл дистиллированной воды. Для очистки препарата от трития в лабильных положениях молекулы ГК, а также от низкомолекулярных продуктов реакции проводили диализ через мембрану MWCO 810 кДа против дистиллированной воды при температуре 4°C. Периодически заменяли внешний раствор и измеряли его радиоактивность. Для очистки потребовалось проводить диализ в течение 16 сут. В работе также использовали препараты ГК с молекулярной массой 0.10 и 0.20 МДа, полученные по аналогичной методике ранее. Для получения препаратов нужной концентрации меченые препараты смешивали с исходной ГК и хранили при 4°C. Препарат ГАП_п перед экспериментом замачивали в воде, для чего к навеске массой 10 мг добавляли 0.1 мл дистиллированной воды и выдерживали 1 сут, периодически перемешивая. ГАП_с, использовали в готовом виде.

Для определения кинетики адсорбции добавляли 1 мл раствора [³H]ГК к 0.1 мл суспензии ГАП_с или ГАП_п, перемешивали встряхиванием и оставляли в стационарном положении, периодически встряхивая. Через определенный промежуток времени проводили разделение фаз центрифугированием в течение 3 мин на центрифуге MiniSpin (Eppendorf) при 3000g. Затем отбирали с помощью автоматического дозатора 50 мкл надосадочной жидкости для определения ее радиоактивности.

Для определения изотермы адсорбции готовили растворы [³H]ГК с требуемой концентрацией (в интервале от 0.1 до 1.0 г/л). Далее эксперимент проводили по схеме, использованной в кинетическом эксперименте. Использовали время выдержки 7 сут для препаратов ГК M_w 2.37 МДа и 1 сут для препаратов ГК M_w 0.2 и 0.1 МДа.

Эксперименты по десорбции [³H]ГК с ГАП-ГК проводили в воде и в 0.9 %-ном растворе NaCl (физиологический раствор, Гематек, Россия). Сначала получали адсорбционный комплекс ГАП_с и ГАП_п с ГК (2.37 и 0.20 МДа) по схеме, описанной в таблице 1. Затем каждый препарат тщательно перемешивали, разделяли на две равные части с весовым контролем и центрифугировали (3 мин, центрифуга MLWT.51.1, 3000g). Раствор над осадком отбирали, заменяли на дистиллированную воду или физиологический раствор, интенсивно перемешали, а затем выдерживали при комнатной температуре, периодически встряхивая. Через 1, 5, 24 и 48 ч отбирали по 0.3 мл суспензии в пластиковые пробирки с крышкой объемом 1.5 мл, центрифугировали (3 мин при 5000g, центрифуга MiniSpin, Eppendorf) и отбирали аликвоту надосадочной жидкости (50 мкл) для измерения радиоактивности.

Таблица 1. Соотношение компонентов при проведении предварительной сорбции (точность – 1–3%).

Все сорбционные эксперименты проводили при комнатной температуре (22 ± 2°C).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С помощью метода термической активации был получен меченный тритием препарат ГК (M_w 2.37 МДа). Удельная радиоактивность препарата составила A_{уд.масс} = 35 ГБк/г. Для препаратов ГК с молекулярной массой 0.1–0.35 МДа в аналогичных условиях была получена удельная активность от 43 до 52 ГБк/г [14]. Таким образом в этой работе показано, что удельная массовая радиоактивность ГК мало зависит от среднего количества звеньев в цепи биополимера. Удельная молярная радиоактивность препарата с M_w 2.37 МДа достигает величины A_уд.мол = 82 ПБк/моль, то есть каждая молекула биополимера содержит в среднем 77 атомов трития. Для сорбционных экспериментов меченые препараты разбавляли носителем до удельной радиоактивности от 28 до 333 МБк/г.

Кинетика адсорбции ГК (2,37 МДа) из растворов с концентрацией 0.98 г/л на ГАП_п и ГАП_с представлена на рис. 1. При этой концентрации раствор ГК был еще достаточно вязким, и максимальная величина связывания ГК для ГАП_п достигалась за 1 сут. Для ГАПс кинетика была гораздо более медленной. Концентрация ГК в растворе переставала существенно меняться через 7 сут. Количество ГК было выше в составе комплекса с ГАП_с.

Рис. 1. Кинетические кривые сорбции ГК (2.37 МДа. с = 1 г/л) на ГАПп (1) и ГАПс (2).

При разбавлении раствора в 10 раз (концентрация 0.1 г/л) вязкость раствора стала намного ниже, и кинетика адсорбции высокомолекулярной ГК существенно изменилась (рис. 2). Для ГАП_п равновесие наступало за 10 ч, а ГАПс – за 6 ч. Равновесное содержание ГК в составе комплекса также оказалось выше для ГАП_с., хотя различие стало меньше.

Рис. 2. Кинетические кривые сорбции ГК (2.37 МДа. с = 0.1 г/л) на ГАПп (1) и ГАПс (2).

Для ГК (0,20 МДа) вязкость раствора при концентрации 1.0 г/л была низкой и адсорбционное равновесие наступало быстрее для двух препаратов ГАП (рис. 3). Величина максимальной адсорбции оказалась одинаковой для порошка и суспензии, и была меньше, чем для высокомолекулярной ГК.

Рис. 3. Кинетические кривые сорбции ГК (0.20 МДа. с = 1.0 г/л) на ГАПп (1) и ГАПс (2).

Полученные данные по кинетике адсорбции описали с использованием моделей псевдопервого и псевдовторого порядка Лагергена [19, 20]. Модель псевдопервого порядка описывается уравнением – $\frac{dm}{dt}=k_1({\Gamma }_{е}-\Gamma )$ Из графика зависимости ln(–Г_e – Г) = f(t) по тангенсу угла наклона прямой определяли константу скорости псевдопервого порядка. В модели псевдовторого порядка – $\frac{dm}{dt}=k_2{({\Gamma }_{е}-\Gamma )}^2$ после преобразования к виду $\frac{t}{Г}=\frac{1}{k_2{Г}_{е}^2}+\frac{1}{{Г}_{е}}t$ из графика зависимости t/Г = f(t) по тангенсу угла наклона определяли Г_е, а по точке пересечения оси ординат – константу скорости псевдовторого порядка. Результаты математической обработки представлены в таблице 2.

Таблица 2. Параметры кинетики адсорбции гиалуроновой кислоты с различной молекулярной массой на образцах ГАПп и ГАПс (точность 4–6%).

Если в качестве критерия выбора модели использовать коэффициент детерминации, то для растворов ГК (2.37 МДа, с = 0.1 г/л) и ГК (0.20 МДа, с = 1 г/л) адсорбция лучше описывается моделью псевдо-второго порядка. В работах [21, 22] показано, что кинетика сорбционных процессов (в том числе и на фосфатах кальция) часто описываются именно уравнением псевдо-второго порядка. Применимость такой модели не зависит от механизмов, определяющих скорость сорбционного процесса, и не требует привлечения представлений о хемосорбции и специальных уравнений кинетики, лимитируемой химическими реакциями или диффузией. В случае, когда модель псевдовторого порядка выполняется с высоким коэффициентом детерминации, можно предположить, что в адсорбционном слое взаимодействие адсорбат-адсорбат значительно слабее взаимодействия адсорбат-адсорбент.

Тем не менее для раствора ГК (2.37 МДа, с = 0.98 г/л) кинетика адсорбции на ГАПс лучше описывается моделью псевдо-первого порядка. Тогда, вероятно, скорость адсорбции определяется взаимным движением как наночастиц ГАПс, так и структурной реорганизацией молекул ГК в вязком растворе. В этом случае в координатах Г – t^1/2 наблюдается линейная зависимость (рис. 4).

Рис. 4. Линеаризация кинетических данных диффузионной моделью при адсорбции ГК 2.37 МДа (1.0 г/л) на ГАПп (1) и ГАПс (2).

На рис. 5 и 6 представлены изотермы адсорбции ГК на двух типах ГАП. В рассматриваемом диапазоне концентраций ГК (0.1–1.0 г/л) изотермы оказались линейными, то есть могут быть описаны уравнением, аналогичным уравнению Генри. Параметры уравнений адсорбции приведены в таблице 3.

Таблица 3. Параметры экспериментальных изотерм сорбции.

Рис. 5. Изотерма сорбции ГК различной Mw на ГАПп: 1 – 2.37 МДа; 2 – 0.2 МДа; 3 – 0.1 МДа.

Рис. 6. Изотерма сорбции ГК различной Mw на ГАПс: 1 – 2.37 МДа; 2 – 0.2 МДа; 3 – 0.1 МДа.

Адсорбция ГК (2.37 МДа) на двух вариантах ГАП оказалась выше, чем адсорбция ГК с массой 0.1 и 0.2 МДа. Для ГАП_п различие составляло примерно в 1.5 раза, а для ГАП_с – в 2.6 раза.

Наблюдалось существенное различие в адсорбции ГК (2.37 МДа) на двух типах ГАП: самая высокая константа в адсорбционном уравнении 73 л/г была получена для ГК (2,37 МДа) на ГАП_с, а на ГАП_п она оказалась на 30% меньше. Для ГК (0.20 МДа) наблюдалась обратная картина: адсорбция была выше дляГАП_п на 36%. Для ГК (0.10 МДа) изотермы на двух типах ГАП были одинаковыми в пределах ошибки эксперимента.

Совокупность полученных данных по кинетике и величине адсорбции ГК на двух типах ГАП говорит о сложности процессов, протекающих в рассматриваемой системе. Рассмотрим зависимость констант в уравнении типа Генри от молекулярной массы ГК (рис. 7).

Рис. 7. Зависимость константы Генри в уравнении адсорбции ГК от молекулярной массы для ГАПс и ГАПп.

Для суспензии зависимость близка к функции k_{Г ~} (M_w)^1/3, то есть k_Г фактически пропорциональна линейному размеру макромолекул ГК. Для порошка ГАП зависимость k_Г от M_w более слабая. Учитывая то, что суспензия ГАП в диспергированном виде представляет собой пластинки размером в десятки нм, процесс образования устойчивого комплекса ГАПс-ГК в растворе высокомолекулярной ГК может протекать медленно, так как требует изменения конформации макромолекул и медленной диффузии агрегатов в вязкой среде. Кроме того, возможен обратный процесс - сорбция нанопластин ГАП на агрегатах макромолекул ГК, что еще больше замедляет процесс. Уменьшение концентрации ГК или ее молекулярной массы ускоряет процесс образования адсорбционного комплекса, и увеличивает число молекул в комплексе пропорционально доступной поверхности сорбента. Как результат адсорбция или удельное содержание ГК в комплексе с ГАП_с (m_ГК/m_ГАП) будут связаны с молекулярной массой и удельной поверхностью молекул ГК как V_ГК/S_{ГК ~} (M_w)^1/3, что и отразилось в зависимости k_Г от M_w.

Для порошка ГАП в растворе ГК M_w 2.37 МДа с концентрацией 1 г/л адсорбция происходит также достаточно медленно, однако в 7 быстрее, чем в случае суспензии, так как не требует структурных перестроек и, кроме того, обратная сорбция микрочастиц порошка невозможна. В этом случае, вероятно, внутренняя поверхность пор недоступна для адсорбции ГК с большой молекулярной массой, однако при снижении молекулярной массы ГК доступность пор для адсорбции возрастает. Следствием этого становится слабая зависимость k_Г от M_w. В тоже время сорбция ГК с меньшей молекулярной массой может приводить к усилению процесса агрегации наночастиц ГАП в суспензии. В результате эффективная сорбционная поверхность ГАП_с снижается и это приводит во-первых – к уменьшению максимальной сорбции ГК на ГАП_с, а во-вторых – к нивелированию различий в сорбции ГК с молекулярной массой 0.2 и 0.1 МДа. Безусловно, для надежного установления механизма адсорбции ГК на ГАП потребуются дополнительные исследования.

Результаты десорбционного эксперимента показали незначительный выход ГК в воду и физиологический раствор за период времени от 1 до 48 ч. Во всех образцах отмечен быстрый выход радиоактивности в раствор, что связано не с десорбцией, а с разбавлением остаточного маточного раствора. Результаты для образцов 1п и 2с (см. табл. 1) показали незначительный избыточный выход ГК (около 4–6% от сорбированного количества ГК) при десорбции в водную среду, для остальных образцов эта величина еще меньше и в среднем не превышает 1%, что говорит о прочном связывании биополимера с сорбентом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая все выше сказанное, отметим, что впервые получена меченная тритием гиалуроновая кислота с M_w 2.37 МДа и удельной радиоактивностью 35 ГБк/г, что позволило выявить особенности поведения высокомолекулярного полимера при контакте с различными типами сорбентов на основе ГАП, в том числе и в сравнении с препаратами ГК с M_w 0.1 и 0.2 МДа. В наших экспериментальных условиях кинетика сорбции ГК на ГАП оказалась диффузионно-контролируемым процессом. При этом время выхода системы на стационарное состояние и величина максимальной сорбции логично уменьшались с уменьшением концентрации ГК и ее молекулярной массы. Показано, что кинетика адсорбции может быть удовлетворительно описана в рамках модели псевдовторого порядка Лагергена. Найдено, что изотермы связывания [³H]ГК с ГАП в диапазоне концентраций от 0.1 до 1 г/л имеют линейный вид и описываются уравнением изотермы типа Генри. При этом с уменьшением молекулярной массы различия между изотермами сорбции на одном типе сорбента нивелируются. Это связано с различием во взаимодействии между молекулами полисахарида и различными текстурами сорбента. Было показано, что в результате контактного взаимодействия образуется очень прочный адсорбционный комплекс ГК-ГАП. Десорбция ГК в воду и физиологический раствор практически не происходит за 2 сут.

Таким образом, результаты нашей работы показывают перспективность использования сорбционного способа создания прочного композита ГАП-ГК, что делает его потенциально доступным для использования, в том числе и для создания новых лекарственных препаратов на их основе.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена в рамках Госзадания № 122012600116-4 «Получение и использование радионуклидов и меченных соединений для целей ядерной медицины, изучения биологически значимых процессов и взаимодействия живых организмов с ионизирующим излучением».

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы подтверждают отсутствие конфликтов интересов.

About the authors

G. A. Badun

Author for correspondence.
Email: badunga@my.msu.ru

Chemical Department

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Kinetic curves of HA sorption (2.37 MDa. c = 1 g/l) for Gap (1) and Gap (2).

Download (84KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Kinetic curves of HA sorption (2.37 MDa. c = 0.1 g/l) for Gap (1) and Gap (2).

Download (90KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Kinetic curves of HA sorption (0.20 MDa. c = 1.0 g/l) for Gap (1) and Gap (2).

Download (77KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Linearization of kinetic data by the diffusion model with the adsorption of HA 2.37 MDa (1.0 g/l) on Ha (1) and Aps (2).

Download (63KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Isotherm of sorption of HA of various Mw on GAPp: 1 – 2.37 MDa; 2 – 0.2 MDa; 3 – 0.1 MDa.

Download (94KB)

Indexing metadata

7. Fig. 6. Isotherm of sorption of HA of various Mw on HAPs: 1 – 2.37 MDa; 2 – 0.2 MDa; 3 – 0.1 MDa.

Download (91KB)

Indexing metadata

8. 7. The dependence of the Henry constant in the HA adsorption equation on the molecular weight for Gps and Ha.

Download (83KB)

Indexing metadata