Microbiome of Supraglacial Systems on the Aldegonda and Bertel Glaciers (Western Spitsbergen Island)

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Высокая Арктика – территория с чрезвычайно хрупкими экосистемами, где в наибольшей степени проявляются последствия глобального изменения климата [75]. Это в полной мере относится к ледникам, которые рассматривают как отдельный сложноорганизованный биом [35]. На Шпицбергене ежегодная потеря массы ледников ускоряется [62, 92] и за период 2000–2019 гг. составила 8 ± 6 Гт в год [79]. Этот процесс оказывает сильное влияние на перигляциальные и супрагляциальную экосистему отступающих ледников, в которой доминируют микробные сообщества [18].

Среди образований супрагляциальной зоны особое место занимают криокониты – тонкодисперсные органо-минеральные седименты, часто микробно-преобразованные, обогащенные органическим веществом (ОВ), имеющие гранулярную структуру и ускоряющие абляцию за счет темного цвета [18, 67, 77, 80, 86]. Благодаря высокому содержанию биогенных элементов, разнообразному составу минеральных компонентов, их тесному взаимодействию и биогенной агрегации криоконитовый материал приобретает признаки почвоподобного тела, а при сходе с ледника и переотложении в перигляциальной зоне может создавать благоприятные условия для почвообразования [4, 5, 7, 18, 33, 69, 71]. Другая группа супрагляциальных объектов – метастабильные шарообразные подушки мхов, так называемые “ледниковые мышки” [1], которые прикрепляются к скоплениям криоконита или материалу абляционной морены и при взаимодействии с мелкоземом образуют почвы с микропрофилем [18].

Информация о микробиоме органо-минеральных тел супрагляциальной зоны продолжает накапливаться. Пока по данным объектам выполнено мало исследований молекулярно-биологическими методами секвенирования рДНК [56, 80, 96], а изучение экологии микробиомов развивается [96].

Основными первичными продуцентами ОВ супрагляциальной зоны являются водоросли [56, 85], функционирование которых в снегу и льду подробно изучено [50]. Гораздо меньше информации по биомассе и структуре гетеротрофного гидролитического блока микроорганизмов супрагляциальных тел, которые участвуют как в минерализации, так и стабилизации трансформированного ОВ [71], а также поддерживают сбалансированное функционирование биокосных систем на ледниках. Считается, что среди микробных гетеротрофов в криоконитах преобладают бактерии [40, 45, 70]. Микобиота данных объектов изучена в меньшей степени [45, 46, 56, 82], хотя известно, что в криоконитах доминируют дрожжи, а не мицелиальные грибы [82]. На примере ледника Мидре-Ловенбрен (о. Западный Шпицберген) было показано, что большая часть штаммов грибов в криоконите психрофильна и продуцирует гидролазы, активные при температурах около нуля [82]. Это доказывает, что микобиота может активно участвовать в разложении ОВ на ледниках. Для почв известно, что грибы выступают основными деструкторами ОВ [97], а их биомасса (особенно мицелия) преобладает над биомассой прокариот [19, 23, 27, 29, 72]. Сведения о соотношении биомассы микобиоты и прокариот в органо-минеральных телах на ледниках, а также о вкладе в биомассу мицелиальных форм грибов и актинобактерий фрагментарны и практически не систематизированы. В целом для различных компонентов экосистем Высокой Арктики пока мало работ по оценке микробной биомассы, в том числе на Шпицбергене [12, 36, 59]. Практически все такие исследования выполнены с использованием не прямых методов люминесцентной микроскопии, а методами фумигации-экстракции [36] или профилей PLFA [59].

В последнее время появились данные о пространственной стратификации микробных сообществ в супрагляциальном материале даже на микроуровне [80], что влияет на различные этапы цикла азота при преобразовании ОВ на ледниках. Для лучшего понимания этого процесса необходима оценка числа генов, кодирующих ферментативный комплекс для азотфиксации (nifH – нитрогеназа), нитрификации (amoA – аммоний оксигеназа) и денитрификации (nirK – нитритредуктаза). Маловероятно, что условия на самом леднике позволяют процессам трансформации N-содержащих соединений достичь оптимальной интенсивности, однако численность функциональных генов цикла азота в криоконите может иметь важное значение при переотложении материала в более теплых почвах перигляциальной зоны [40].

Цель работы – исследование структуры микробной биомассы, численности и таксономического разнообразия культивируемых бактерий и микромицетов, а также числа функциональных генов цикла азота в супрагляциальных и перигляциальных органо-минеральных системах ледников Альдегонда и Бертель на о. Западный Шпицберген.

Выдвинули следующие рабочие гипотезы:

• структура сообщества микроорганизмов существенно меняется в зависимости от условий формирования и стабильности субстрата в ряду от инситного криоконита в стаканах протаивания до переотложенного криоконита на леднике и за его пределами;
• мицелиальные микроорганизмы (грибы и актиномицеты) занимают доминирующие позиции в составе гидролитического блока микробиома в переотложенном аэрируемом криоконите и перигляциальных почвах, а одноклеточные прокариоты – в инситном криоконите в стаканах протаивания с талой водой. Эта гипотеза основана на том, что гифальная организация позволяет микроорганизмам более успешно колонизировать гетерогенные субстраты с множеством микрозон (например, почву и почвоподобные тела), по сравнению с одноклеточными про- и эукариотами, которые лучше адаптированы к гомогенной среде локусов, богатых водой [43].

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Полевые исследования и отбор образцов проводили в 2019 и 2020 гг. Объекты исследования расположены на ледниках Альдегонда и Бертель о. Западный Шпицберген, ключевые точки которых представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Расположение ледников Бертель и Альдегонда на о. Западный Шпицберген, а также основные группы объектов исследования в супрагляциальной и ближней перигляциальной зонах ледников: I – шарообразная подушка мха на леднике (“ледниковая мышка”) с микропрофилем почвы; IIa – инситный криоконит в стаканах протаивания; IIb – биогенные гранулы криоконита на дне стакана протаивания; III – переотложенный дисперсный криоконит, структура биогенных гранул частично утрачена; IV – переотложенный криоконит, коническая форма с ледяным ядром, структура биогенных гранул сильно деградирована или утрачена; V – слаборазвитая почва (пелозем) на молодой морене с участием материала криоконита

 

Образцы в полевых условиях отбирали методом усреднения пяти единичных проб. Предназначенные для микробиологических исследований образцы хранили в стерильных емкостях при температуре –18°С сначала в морозильной камере, а затем в лаборатории.

Содержание углерода и азота определяли методом сухого сжигания на CNSH-анализаторе Vario Isotope (Германия).

Координаты ключевых точек, описание и некоторые физико-химические свойства исследованных образцов представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Свойства исследованных криоконитов в ледниках Альдегонд и Бертель архипелага Шпицберген

Индекс образца	Ледник	Группа	Описание	Сорг, %	Nобщ, %	С/N
Супрагляциальная зона
Pr2	Бертель	I. Почва с микропрофилем на леднике	Шарообразная подушка мха с микропрофилем первичной почвы (“ледниковая мышка”), присутствуют гранулы криоконита	11.34	0.70	19
Pr5	Бертель	II. Инситный криоконит в стаканах протаивания	Биогенные гранулы из нескольких стаканов протаивания на краю водотока	2.56	0.19	16
Pr6	Бертель		Биогенные гранулы из нескольких стаканов протаивания	2.68	0.18	17
Pr7	Бертель		Биогенные гранулы из нескольких стаканов протаивания на краю водотока	3.11	0.10	36
Pr13	Бертель		Хорошо оформленные биогенные гранулы на дне стакана протаивания	3.98	0.03	155
A19-7	Альдегонда		Скопление хорошо оформленных биогенных гранул	2.73	0.15	21
A19-8	Альдегонда		Биогенные гранулы в стакане протаивания с большим количеством минерального окисленного материала	2.67	0.15	21
Pr4	Бертель	III. Переотложенный дисперсный криоконит	Криоконит локально перемещен вследствие недавнего разрушения стаканов протаивания и формирования талого водотока, структура биогенных гранул частично сохранена	1.87	0.12	18
Pr8	Бертель		Крупное скопление криоконитового материала, в том числе вытаявшего из нескольких мелких стаканов, структура биогенных гранул частично утрачена	1.56	0.11	17
Pr9	Бертель		Крупное скопление криоконита, структура биогенных гранул частично утрачена	1.86	0.16	14
A19-1	Альдегонда		Полоса вытаявшего криоконита, основной материал крупнозернистый песок, есть признаки оструктуривания тонкодисперсного материала	1.1	0.10	13
A19-2	Альдегонда		Центральная часть ледника, скопление криоконита по трещине, структура биогенных гранул частично утрачена	1.73	0.19	11
Pr12	Бертель	IV. Переотложенный криоконит, коническая форма с ледяным ядром	Крупное скопление криоконита, структура биогенных гранул сильно деградирована или утрачена	2.63	0.17	18
Ближняя перигляциальная зона
Pr28	Бертель	V. Слаборазвитая почва на морене с участием материала криоконита	Пелозем на молодой морене со значительным участием материала переотложенного криоконита, глубина отбора 0–10 см, присутствуют сосудистые растения	1.13	0.04	33
A19-11	Альдегонда		Пелозем на 20-летней морене со значительным участием материала переотложенного криоконита, глубина отбора 5–10 см	1.48	0.13	13

 

Биомасса прокариот. Общая численность прокариот определена с помощью метода прямой микроскопии с использованием люминесцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 plus (Carl Zeiss, Германия) (объектив ×100, масляная иммерсия). Данный метод сводится к тому, что приготовленные из почвенной суспензии препараты окрашиваются красителем акридином оранжевым [8]. Пробу почвы (растительного материала) массой 1 г помещали в колбу со 100 мл стерильной воды. Для десорбции клеток с поверхности почвенных частиц почвенную суспензию обрабатывали ультразвуком, используя ультразвуковой диспергатор УДНЗ-1 (2 мин, 22 кГц, 0.44 А) (Россия). Последующую окраску препаратов акридином оранжевым проводилась по следующей методике [8]: на стекло наносили 10 мкл суспензии и распределяли по площади 2×2 см², затем стекло фиксировали в пламени горелки и окрашивали акридином оранжевым (в соотношении красителя и воды 1 : 10 000, 2–4 мин) непосредственно перед просмотром под микроскопом с УФ-источником света. Из каждого образца готовили 6 препаратов, на каждом из которых подсчитывали клетки в 30 полях зрения. Расчет количества бактериальных клеток на 1 г субстрата производили по формуле:

$N=S_{1}an/V{S}_{2}C$,

где N – число клеток на 1 г субстрата; S₁ – площадь препарата (мкм²); a – количество клеток в одном поле зрения (усреднение производится по всем препаратам); n – показатель разведения бактериальной смеси (мл); V – объем капли, наносимой на стекло (мл); S₂ – площадь поля зрения микроскопа (мкм²); C – навеска субстрата (1 г). Длину актиномицетного мицелия в 1 г образца (NМА) определяли по формуле:

$NMA=S_{1}an/v{S}_{2}c\times {10}^6$,

где S₁ – площадь препарата (мкм²); а – средняя длина фрагментов актиномицетного мицелия в поле зрения (мкм); n – показатель разведения суспензии (мл); v – объем капли, наносимой на стекло (мл); S₂ – площадь поля зрения микроскопа (мкм²); с – навеска образца (г).

Биомасса грибов. Численность грибных пропагул и длину грибного мицелия определяли методом люминесцентной микроскопии на микроскопе Zeiss Axioskop 2 plus (Германия) при увеличении 400. Препараты почвенной суспензии (разведение 1 : 100) окрашивали флуоресцентным красителем калькофлуором белым [8]. Десорбцию клеток с почвы проводили при помощи вортекса MSV-3500 (Латвия) при скорости 3500 об./мин в течение 10 мин. На стекло наносили 10 мкл суспензии и распределяли по площади 2 × 2 см², затем стекло фиксировали в пламени горелки и окрашивали калькофлуором белым (в соотношении красителя и воды 1 : 10000, 15–20 мин) непосредственно перед просмотром под микроскопом с УФ-источником света. Из каждого образца готовили 3 препарата, на каждом из которых подсчитывали клетки в 90 полях зрения. Расчет количества грибных клеток на 1 г субстрата производили по формуле:

$M=\left(\left(4an\right)/p\right)\times {10}^{10}$,

где М – количество клеток в 1 г почвы; а – среднее число клеток в поле зрения; р – площадь поля зрения (мкм²); n – показатель разведения. Длину грибного мицелия в 1 г образца (NМА) определяли по формуле:

$NMA=S_{1}an/v{S}_{2}c\times {10}^6$,

где S₁ – площадь препарата (мкм²); а – средняя длина фрагментов мицелия в поле зрения (мкм); n – показатель разведения суспензии (мл); v – объем капли, наносимой на стекло (мл); S₂ – площадь поля зрения микроскопа (мкм²); с – навеска образца (г). Расчет грибной биомассы (мг/г почвы) проводили, полагая, что плотность спор равна 0.837 г/ см³, а плотность мицелия – 0.628 г/см³ [27].

Определение численности и таксономической структуры комплекса культивируемых сапротрофных бактерий проводили на агаризованной глюкозо-пептонно-дрожжевой среде с нистатином [16]. Посев для учета численности бактерий и актиномицетов проводили из разведений 1 : 100, 1 : 1000 в трехкратной повторности после обработки почвенной суспензии на приборе УЗДН1 (22 кГц, 0.44А, 2 мин) (Россия) для десорбции клеток с поверхности почвенных частиц [8]. Посевы для учета численности бактерий и актиномицетов инкубировали при комнатной температуре. Учет бактерий осуществляли на 10–14 сут, а для актиномицетов – на 14–21 сут. Представителей основных морфотипов изолировали на скошенный агар и идентифицировали по общепринятым определителям [16, 30]. Выделяли следующие группы по относительному обилию родов [15]: доминанты (>30%), субдоминанты (20–30%), группа среднего обилия (10–20%) и минорные компоненты (<10%).

Численность и таксономический состав культивируемых микромицетов определяли методом глубинного микробиологического посева [8], при котором высокая температура среды стимулирует развитие покоящихся пропагул, тем самым увеличивая разнообразие культивируемых форм [14]. Для этого почвенную суспензию перед посевом обрабатывали с помощью шейкера Vortex (Латвия) в течение 5 мин при 3500 об./мин. Аликвоту 100 мкл суспензии почвы с разведением 1 : 100 помещали на дно стерильных чашек Петри, в которые заливали расплавленную и охлажденную до +50°С среду Чапека с добавлением стрептомицина (100 мг/л) для предотвращения роста бактерий. Инкубацию посевов проводили в термостатах при температуре +25°С в течение 2–3 недель, а также при +5°С в течение 3–4 недель, чтобы дополнительно выделить психротолерантные виды микромицетов и дрожжей [49]. Посев осуществляли в пятикратной повторности для каждого образца при каждой температуре инкубации. По прошествии вышеуказанного времени инкубации производили учет общего числа колоний мицелиальных грибов и дрожжей, а также их первичную идентификацию по макро- и микрокультуральным признакам (микроскоп Биомед-5 (Россия)) с помощью определителей [44, 81].

Для изолятов микроскопических грибов неясного таксономического положения и стерильного мицелия идентификацию проводили на основании анализа участков ITS1–ITS2 гена рДНК. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляли по методике [6]: биомассу 5–6-суточной культуры переносили в 2 мл эппендорфы, добавляли 400 мкл стеклянных шариков (300–500 мкм диаметром) и 500 мкл лизирующего буфера (TrisBase 50 мM, NaCl 250 мM, ЭДТА 50 мM, SDS0.3%, pH 8). Приготовленную смесь взбалтывали на вортексе на скорости 3500 об./мин в течение 15 мин, затем инкубировали 1 ч при температуре +65°С, после снова использовали шейкер 15 мин и центрифугировали (13.4 об./мин) 10 мин, отбирали надосадочную жидкость. Для амплификации региона рДНК, содержащего D1/D2 домен региона 26S рДНК, использовали праймеры ITS1f (5’ CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA) и NL4 (5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG) и смеси для ПЦР ScreenMix (ЗАО “Евроген”, Москва). Амплификатор использовали по следующей программе: начальная денатурация – 2 мин при температуре +96°С; затем 35 циклов: денатурация – 20 с при температуре +96°С, отжиг праймеров – 50 с при температуре +52°С, синтез ДНК – 1.5 мин при температуре +72°С; конечная достройка 7 мин при температуре +72°С. Очистку ПЦР-продукта проводили с использованием набора BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, USA). Для секвенирования использовали праймер NL4. Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem, USA) с последующим анализом продуктов реакции на секвенаторе Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer в Научно-производственной компании Синтол (Москва). Идентификацию по полученным хроматограммам проводили, используя данные генбанка NCBI и СABI Bioscience Database Index Fungorum.

Общее α-разнообразие грибных сообществ оценивали по индексу Шеннона. Статистическую обработку данных проводили с помощью программ Microsoft Оffice Excel 2019 и Stаtistica 10.0.

Выделение ДНК для анализа на присутствие генов целевых ферментов из супрагляциальных систем проводили, не допуская размораживания образцов, выполняя все манипуляции на льду. Препарат ДНК из образца массой 0.5 г выделяли в соответствии с методикой производителя при помощи набора реактивов (FastDNA spin kit for soil, Qbiogene, Канада). Выделенный препарат ДНК растворяли в 50 мкл дистиллированной воды. Дальнейшую очистку производили с помощью коммерческого набора реактивов (UltraClean 15 DNA purification Kit, MoBio, Канада).

Количественный анализ ПЦР-продуктов проводили для количественной оценки численности генов цикла азота. Определяли численность генов, кодирующих ключевые ферменты процессов nifH, amoA, nirK согласно протоколу [41, 98]. Использовали наборы праймеров, описанные в табл. 2. Все реакции проводили в амплификаторе C1000 с системой реального времени CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Смесь для количественной ПЦР содержала 10 мкл 2Х концентрированного мастермикса для количественной ПЦР BioMaster HS-qPCR SYBR Blue (Biolabmix, Россия), 0.5–0.8 мкМ каждого праймера и 1 мкл экстрагированной почвенной ДНК-матрицы в общем объеме 20 мкл. Оценку количества копий исходного гена проводили в CFX Manager. Программа работы амплификтора следующая: 3 мин при 95°C, затем 40 циклов при 95°C в течение 20 с, 54°C в течение 20 с и 72°C в течение 20 с. Для обеспечения количественной специфичности ПЦР проводили анализ кривой плавления (от 65 до 95°C с шагом 0.5°C). Стандартные кривые в трех экземплярах варьировали от 10³ до 10⁸ число копий гена/мкл. Стандарты были получены путем очистки продуктов ПЦР и количественного определения концентрации с помощью флуорометра Qubit 2 (Thermo Fisher Scientific, США). Контрольные организмы (за исключением гена amoA) для построения стандартных кривых для продуктов ПЦР описаны в табл. 2. Эффективность количественной ПЦР составляла 82–101%, а коэффициенты детерминации были R² > 0.90 для всех стандартных кривых.

 

Таблица 2. Информация о праймерах и стандартах для количественной ПЦР [97]

Целевая группа или процесс	Целевой ген	Название праймера	Сиквенс праймера	Чистая культура микроорганизма – источник целевого гена
Бактерии	16S рРНК	Eub358 Eub518	ACTCCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG	Escherichia coli
Археи	16S рРНК	915f 1059r	AGGAA TTGGC GGGGG AGCAC GCCAT GCACC WCCTC T	Штамм FG-07 Halobacterium salinarum
Грибы	ITS	ITS1f 5.8s	TCC GTA GGT GAA CCT GCG G CGC TGC GTT GTT CAT CG	Saccharomyces cerevisiae Meyen 1B-D1606
Азотфиксация	nifH	PolF PolR	TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA	Sinorhizobium meliloti
Нитрификация	Бактериальный amoA	amoA-1F amoaA-2R	GGGGTTTCTACTGGTGGT CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC	Стандарты, синтезированные с помощью ПЦР амплификации из гена amoA, экстрагированного из тотальной почвенной ДНК
Денитрификация	nirK	nirK876 nirK1040	ATY GGC GGV CAY GGC GA GCC TCG ATC AGR TTR TGG TT	Sinorhizobium meliloti

 

Анализ продуктов ПЦР проводили в 1.0%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием до концентрации 1 мкг/мл. Электрофорез в денатурирующем геле (ДГГЭ). ДГГЭ-анализ состава сообщества аммонийокисляющих архей выполняли в соответствии с методом [91]. Сообщество аммонийокисляющих бактерий было охарактеризовано с помощью ДГГЭ анализа фрагментов гена amoA в соответствии с методикой [48]. Продукты амплификации фрагментов гена amoA аммонийокисляющих бактерий содержали GC кламп на нуклеотидных последовательностях праймера amoA-1F (amoA-1F-GC) и amoA-2R-GG. Поскольку ДГГЭ анализ функционального гена amoA аммонийокисляющих архей возможен без наличия GC клампа, использовали ПЦР продукты, полученные непосредственно после амплификации с праймерами CrenamoA23f и CrenamoA616r.

ДГГЭ анализ выполняли с использованием приборов DCode Universal Mutation Detection System (Bio-RAd, Hertfordshire, Великобритания) в соответствии с [91]. Для ДГГЭ анализа использовали гели, содержащие 8% (масса/объем) полиакриламида при разных значениях линейного градиента денатуранта (40–60% для фрагментов гена amoA аммоний окисляющих бактерий и 15–60% для фрагмента гена amoA аммоний окисляющих архей). Были заданы следующие условия проведения анализа ДГГЭ: электрофорез в 6.5 л буфера ТАЕ при температуре 60°С в течение 900 мин и напряжении 100 В. Дальнейшее окрашивание нитратом серебра выполняли согласно [91], сканирование производили с использованием сканера Epson GT9600. Количество Rf и плотность ДГГЭ полос определяли с помощью программы Quantity one (Version 4.5.0, Bio-Rad production) и Форетикс (Phoretix International, Newcastle-Upon-Tyne, UK).

Статистическую обработку данных (определение среднего арифметического, дисперсии, моды и медианы) проводили с помощью программ Microsoft Оffice Excel 2019 и Stаtistica 10.0. Количество повторностей составляет: 90 полей зрения для каждого из трех препаратов на один образец для метода люминесцентной микроскопии; три чашки Петри на образец для метода микробиологического посева; трехкратная для выделения ДНК и количественной ПЦР.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Суммарная биомасса микроорганизмов (грибов и бактерий) составляла от 2.54 мкг/г субстрата в слаборазвитой почве, сформированной на морене с участием криоконитового материала (образец Pr28), до 722.0 мкг/г субстрата в образце инситного криоконита в стакане протаивания (образец Pr7) (рис. 2). Для образцов инситного (Pr4, Pr5, A19-1, A19-2 и A19-8) биомасса микроорганизмов составляла десятки мкг/г субстрата, а для образцов Pr6, Pr7, Pr8, Pr9, Pr12, Pr13, A19-7 и A19-11 – сотни мкг/г субстрата. В целом наблюдалась тенденция уменьшения суммарной микробной биомассы в ряду: группа I почва с микропрофилем на леднике > группа V слаборазвитая почва на морене > группа IV переотложенный криоконит конической формы > группа III переотложенный дисперсный криоконит > группа II инситный криоконит в стаканах протаивания.

 

Рис. 2. Общая биомасса микроорганизмов: 1 – микобиоты, 2 – прокариот

 

Доля микобиоты в общей микробной биомассе варьировала от 78.7 до 99.8%. Минимальная доля грибов (78.7–92.0%) выявлена в образцах Pr2, Pr4, Pr5, Pr28 и A19-9, а максимальная (97.2–99.8%) – в образцах Pr6, Pr7, Pr8, Pr9, Pr12, Pr13, A19-1, A19-2, A19-7 и A19-11.

Структура биомассы грибов. Значения биомассы микобиоты в исследованных криоконитах варьировали от сотых долей мг/г субстрата в Pr7, Pr9, Pr13, Pr28, A19-1, A19-2, A19-8 до десятых долей мг/г субстрата в Pr2, Pr4, Pr5, Pr6, Pr8, Pr12, A19-7, A19-11. Минимум грибов (0.020 мг/г субстрата) обнаружен в почве на криоконитовом материале с растительностью (образец Pr28), а максимум микобиоты (0.719 мг/г субстрата) – на материале на границе водораздела ледника и грязной зоны (табл. 3).

 

Таблица 3. Структура биомассы грибов

Индекс образца

Ледник

Группа

Мицелий (d = 3 мкм)

Споры (диаметр, мкм)

Общая биомасса спор, мг/г субстрата

Доля мелких (2–3 мкм) спор по массе, %

Суммарная биомасса грибов, мкг/г субстрата

биомасса, мг/г

длина, м

доля мицелия в общей биомассе, %

2

3

5

7

численность, шт./г ×104

масса, мг/г

численность, шт./г×104

масса, мг/г

численность, шт./г×103

масса, мг/г

численность, шт./г×103

масса, мг/г

Pr2

Бертель

I. Почва с микропрофилем на леднике

0.299 ± 0.034

236.74 ± 15.8

70.4

6.47 ± 0.89

0.022 ± ± 0.005

0.97 ± 0.13

0.011 ± 0.002

Нет

–

0.87 ± ± 0.14

0.093 ± ± 0.15

0.126 ± 0.022

26.2

0.425 ± 0.073

Pr5

Бертель

II. Инситный криоконит в стаканах протаивания

0.307 ± 0.035

243.07 ± 16.22

88.2

1.91 ± 0.26

0.007 ± ± 0.001

2.10 ± 0.29

0.024 ± 0.005

1.04 ± ± 0.18

0.010 ± ± 0.002

Нет

–

0.041 ± 0.008

75.6

0.348 ± 0.060

Pr6

Бертель

0.558 ± 0.064

441.85 ± 29.49

87.7

1.11 ± 0.15

0.004

6.47 ± 0.89

0.075 ± 0.013

Нет

–

Нет

–

0.079 ±

100

0.636 ± 0.109

Pr7

Бертель

0.679 ± 0.078

537.51 ± 35.87

94.4

1.71 ± 0.23

0.006

2.91 ± 0.40

0.034 ± 0.007

Нет

–

Нет

–

0.040 ± 0.008

100

0.719 ± 0.124

Pr13

Бертель

0.008 ± 0.001

6.70 ± 0.45

20.5

1.62 ± 0.22

0.005

2.27 ± 0.31

0.026 ± 0.005

Нет

–

Нет

–

0.031 ± 0.006

100

0.039 ± 0.007

A19-7

Альдегонда

0.105 ± 0.012

83.41 ± 5.57

69.1

1.11 ± 0.15

0.004

2.27 ± 0.31

0.026 ± 0.005

1.75 ± ± 0.30

0.017 ± ± 0.003

Нет

–

0.047 ± 0.009

63.8

0.152 ± 0.026

A19-8

Альдегонда

–

Нет

–

0.51 ± 0.07

0.002

4.21 ± 0.57

0.049 ± 0.007

Нет

–

Нет

–

0.051 ± 0.010

100

0.051 ± 0.010

Pr4

Бертель

III. Переотложенный дисперсный криоконит

0.305 ± 0.035

241.21 ± 16.10

86.4

3.02 ± 0.41

0.010 ± ± 0.002

3.24 ± 0.45

0.038 ± 0.006

Нет

–

Нет

–

0.048 ± 0.009

100

0.353 ± 0.061

Pr8

Бертель

0.101 ± 0.012

79.66 ± 5.32

87.1

2.26 ± 0.31

0.007 ± ± 0.002

0.65 ± 0.089

0.008 ± 0.001

Нет

–

Нет

–

0.015 ± 0.003

100

0.116 ± 0.020

Pr9

Бертель

–

Нет

–

1.31 ± 0.18

0.004

2.92 ± 0.40

0.034 ± 0.007

Нет

–

Нет

–

0.038 ± 0.007

100

0.038 ± 0.007

A19-1

Альдегонда

0.015 ± 0.002

11.73 ± 0.78

31.3

0.61 ± 0.84

0.002

1.94 ± 0.27

0.023 ± 0.004

0.88 ± ± 0.15

0.008 ± ± 0.001

Нет

–

0.033 ± 0.006

75.8

0.048 ± 0.009

A19-2

Альдегонда

0.067 ±

53.25 ± 3.55

91.8

1.32 ± 0.18

0.004

0.15 ± 0.02

0.002

Нет

–

Нет

–

0.006 ± 0.001

100

0.073 ± 0.014

Pr12

Бертель

IV. Переотложенный криоконит, коническая форма с ледяным ядром

0.202 ± 0.024

159.99 ± 10.7

72.7

1.01 ± 0.14

0.003

4.86 ± 0.67

0.056 ± 0.008

1.75 ± ± 0.30

0.017 ± ± 0.003

Нет

–

0.076 ± 0.014

77.6

0.278 ± 0.048

Pr28

Бертель

V. Слаборазвитая почва на морене с участием материала криоконита

–

Нет

–

1.42 ± 0.20

0.005

1.30 ± 0.18

0.015 ± 0.003

Нет

–

Нет

–

0.020 ± 0.004

100

0.020 ± 0.004

A19-11

Альдегонда

0.140 ± 0.017

110.96 ± 7.41

72.2

0.82 ± 0.11

0.003

4.21 ± 0.57

0.049 ± 0.007

0.35 ± ± 0.06

0.003

Нет

–

0.054 ± 0.010

96.3

0.194 ±

Примечание. Для каждого образца число повторностей (полей зрения) составляло 270. После знака ± указано стандартное отклонение.

 

Доля мицелия в изученных образцах изменялась в широких пределах: от 31.3% в переотложенном дисперсном криоконите с ледника Альдегонда (образец A19-1) до 94.4% в образце инситного криоконита в стакане протаивания (образец Pr7). Однако для большинства образцов доля грибного мицелия была относительно высока – от 70 до 90%. Минимум мицелия (6.70 м/г субстрата) обнаружен в криоконите из стакана (образец Pr13), а максимум – в материале на границе водораздела ледника и грязной зоны, где длина гиф достигает 537.51 м/г субстрата. Образцы Pr2, Pr4, Pr5, Pr6, Pr7, Pr12, A19-11 содержали сотни метров мицелия в грамме субстрата; образцы Pr8, A19-1, A19-2 и A19-7 – десятки метров мицелия в грамме субстрата; а образцы Pr9, Pr13, Pr28, A19-8 – единицы метров мицелия в грамме субстрата или гифы грибов вовсе не были выявлены.

Численность одноклеточных грибных пропагул (спор и дрожжей) в изученных объектах составляла 10³–10⁴ кл./г субстрата. Пропагулы представлены 4 размерными группами – 2, 3, 5 и 7 мкм в диаметре. Доля мелких пропагул (2 и 3 мкм) изменялась от 26.2% в Pr2 до 96.3% в A19-11. В шести образцах (Pr4, Pr6, Pr7, Pr8, Pr9, Pr13, Pr28, A19-2, A19-8) доля мелких пропагул доходила до 100%. Крупные пропагулы диметром 5 и 7 мкм выявлены в Pr2, Pr5, Pr12, A19-1, A19-7, A19-11, а их численность мала – 10²–10³ кл./г субстрата. Пропагулы диаметром 7 мкм отмечены лишь в Pr2. Около 86% пропагул округлой формы с гладкой поверхностью; 9% – округлы и шероховаты; 4% – овальны с гладкой поверхностью; 1% – имели овальную форму с неровностями.

Структура биомассы прокариот. Численность одноклеточных прокариот в исследованных объектах колебалась от сотен миллионов до миллиардов клеток в грамме субстрата (табл. 4). Наименьшие значения (2.4×10⁸ кл./г субстрата) выявлены в образце A19-1, а наибольшие (1.95×10⁹ и 1.96×10⁹ кл./г субстрата) – в образцах A19-7 и A19-8 соответственно. Большая часть образцов характеризовалась количеством прокариот порядка 10⁹ на грамм субстрата. Биомасса одноклеточных прокариот исследованных образцов составляла от 0.52 до 4.23 мкг/г субстрата. Наименьшие значения выявлены в группе V (слаборазвитая почва на морене с участием материала криоконита, образцы Pr28 и A19-1). Наибольшие показатели биомассы прокариот отмечены в группе II (инситный криоконит в стаканах протаивания, образцы A19-7 и A19-9). Биомасса прокариот в большинстве образцов представлена преимущественно (от 51.8 до 96.8%) одноклеточными формами.

 

Таблица 4. Структура биомассы прокариот

Индекс образца	Ледник	Группа	Численность клеток прокариот, ×109 кл./г	Биомасса одноклеточных прокариот, мкг/г субстрата	Длина актиномицетного мицелия, м/г	Биомасса актиномицетного мицелия, мкг/г	Доля мицелия в общей биомассе, %	Общая биомасса прокариот, мкг/г субстрата
Pr2	Бертель	I. Почва с микропрофилем на леднике	1.13 ± 0.21	2.39 ± 0.46	43.64 ± 8.72	1.61 ± 0.40	40.3	4.00 ± 0.10
Pr5	Бертель	II. Инситный криоконит в стаканах протаивания	1.17 ± 0.22	2.48 ± 0.48	62.61 ± 12.53	2.31 ± 0.58	48.2	4.79 ± 1.19
Pr6	Бертель		0.68 ± 0.13	1.44 ± 0.28	32.13 ± 6.44	1.19 ± 0.30	45.3	2.63 ± 0.65
Pr7	Бертель		1.51 ± 0.28	3.20 ± 0.62	19.93 ± 4.01	0.74 ± 0.19	18.8	3.94 ± 0.97
Pr13	Бертель		0.54 ± 0.10	1.15 ± 0.22	Нет	–	–	1.15 ± 0.22
A19-7	Альдегонда		1.96 ± 0.37	4.23 ± 0.81	3.80 ± 0.84	0.14 ± 0.03	3.2	4.37 ± 0.84
A19-8	Альдегонда		1.95 ± 0.37	4.21 ± 0.81	5.29 ± 1.11	0.20 ± 0.04	4.5	4.41 ± 0.85
Pr4	Бертель	III. Переотложенный дисперсный криоконит	1.68 ± 0.31	3.57 ± 0.69	54.44 ± 10.91	2.01 ± 0.50	36.0	5.58 ± 1.39
Pr8	Бертель		0.64 ± 0.12	1.36 ± 0.26	2.60 ± 0.51	0.10 ± 0.02	6.9	1.46 ± 0.36
Pr9	Бертель		1.74 ± 0.33	3.69 ± 0.71	44.53 ± 8.96	1.64 ± 0.41	30.8	5.33 ± 1.31
A19-1	Альдегонда		0.24 ± 0.05	0.52 ± 0.10	Нет	–	–	0.52 ± 0.10
A19-2	Альдегонда		0.79 ± 0.15	1.71 ± 0.33	Нет	–	–	1.71 ± 0.33
Pr12	Бертель	IV. Переотложенный криоконит, коническая форма с ледяным ядром	1.38 ± 0.26	2.93 ± 0.56	6.40 ± 1.32	0.24 ± 0.06	7.6	3.17 ± 0.78
Pr28	Бертель	V. Слаборазвитая почва на морене с участием материала криоконита	0.25 ± 0.05	0.54 ± 0.10	Нет	–	–	0.54 ± 0.10
A19-11	Альдегонда		1.36 ± 0.26	2.94 ± 0.57	9.39 ± 1.92	0.35 ± 0.08	10.6	3.29 ± 0.63

Примечание. Для каждого образца число повторностей (полей зрения) составляло 270. После знака ± указано стандартное отклонение.

 

Длина мицелия актиномицетов составляла от 2.6 до 62.61 м/г субстрата. Образцы Pr4, Pr5, Pr6, Pr7 (инситный криоконит в стаканах протаивания) содержали десятки метров актиномицетного мицелия на грамм субстрата; образцы Pr8, Pr9, Pr12, A19-7, A19-8 и A19-11 (переотложенный криоконит) – единицы метров актиномицетного мицелия на грамм субстрата; в некоторых образцах (Pr13, Pr28, A19-1 и A19-2) мицелий актиномицетов обнаружен не был.

В целом содержание биомассы прокариот было выше в образцах почвы с микропрофилем (Pr2, A9) и инситных криоконитах в стаканах протаивания (Pr5, Pr9, Pr12, A19-7).

Численность комплекса культивируемых сапротрофных бактерий в исследованных объектах Шпицбергена варьировала от 1.1×10³ до 1.3×10⁵ КОЕ/г субстрата (табл. 5). Минимальные показатели численности бактерий (около 10³ КОЕ/г субстрата) зафиксированы в образцах ледника Альдегонда A19-1 и A19-11. Максимальное содержание бактерий выявлено в образце почвы с микропрофилем на леднике Pr2 (ледника Бертель). В целом численность культивируемых сапротрофных бактерий была выше в почве с микропрофилем на леднике Pr2 и биогенных гранулах из криоконитовых стаканов ледника Бертель (Pr5, Pr6, Pr7, Pr13).

 

Таблица 5. Структура сообществ культивируемых почвенных гетеротрофных бактерий и актиномицетов

Индекс образца	Ледник	Группа	Численность бактерий, 104×КОЕ/г	Доминанты	Субдоминанты	Группа родов среднего обилия и минорные компоненты
Pr2	Бертель	I. Почва с микропрофилем на леднике	13.00 ± 3.23	Arthrobacter, Streptomyces	Cytophaga, Myxococcus, Polyangium	Alcaligenes, Caulobacter, Pseudomonas, Sporocytophaga
Pr5	Бертель	II. Инситный криоконит в стаканах протаивания	6.84 ± 1.21	Arthrobacter,	Cytophaga, Polyangium	Alcaligenes, Aquaspirillum, Comamonas, Sporocytophaga
Pr6	Бертель		5.95 ± 1.05	Arthrobacter	Polyangium	Alcaligenes, Caulobacter, Comamonas, Pseudomonas,
Pr7	Бертель		8.57 ± 1.51	Arthrobacter	Cytophaga, Myxococcus, Polyangium	Alcaligenes, Caulobacter, Pseudomonas, Sporocytophaga
Pr13	Бертель		11.18 ± 2.38	Bacillus, Streptomyces	Cytophaga, Myxococcus, Polyangium	Alcaligenes, Aquaspirillum, Caulobacter, Comamonas, Pseudomonas, Sporocytophaga
A19-7	Альдегонда		0.80 ± 0.15	Arthrobacter	Myxococcus,	Alcaligenes, Aquaspirillum, Pseudomonas, Sporocytophaga
A19-8	Альдегонда		1.03 ± 0.19	Bacillus, Rhodococcus	Cytophaga, Myxococcus,	Alcaligenes, Caulobacter, Comamonas, Pseudomonas, Sporocytophaga
Pr4	Бертель	III. Переотложенный дисперсный криоконит	0.63 ± 0.14	Arthrobacter, Rhodococcus,	Cytophaga, Polyangium	Caulobacter, Comamonas, Pseudomonas, Sporocytophaga
Pr8	Бертель		0.53 ± 0.11	Arthrobacter	Myxococcus,	Caulobacter, Comamonas, Pseudomonas, Sporocytophaga
Pr9	Бертель		0.70 ± 0.15	Arthrobacter, Rhodococcus,	Myxococcus,	Alcaligenes, Aquaspirillum, Comamonas, Sporocytophaga
A19-1	Альдегонда		0.11 ± 0.02	Arthrobacter, Bacillus	Polyangium	Aquaspirillum, Comamonas, Pseudomonas, Sporocytophaga
A19-2	Альдегонда		0.39 ± 0.07	Arthrobacter	Myxococcus,	Alcaligenes, Aquaspirillum, Comamonas, Pseudomonas, Sporocytophaga
Pr12	Бертель	IV. Переотложенный криоконит, коническая форма с ледяным ядром	7.65 ± 1.63	Bacillus	Myxococcus,	Alcaligenes, Caulobacter, Pseudomonas, Sporocytophaga
Pr28	Бертель	V. Слаборазвитая почва на морене с участием материала криоконита	0.21 ± 0.04	Arthrobacter	Cytophaga,	Aquaspirillum, Comamonas, Pseudomonas,
A19-11	Альдегонда		0.12 ± 0.02	Bacillus, Streptomyces	Polyangium	Aquaspirillum, Caulobacter, Comamonas, Pseudomonas

Примечание. Для каждого образца число повторностей (количество чашек Петри в которые произведен микробиологический посев) составляло 6. После знака ± указано стандартное отклонение.

 

Выделено 94 штамма сапротрофных прокариот, отнесенных к 17 родам бактерий. Грамположительные бактерии представлены 6 родами: Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Micromonospora, Rhodococcus, Streptomyces. Грамотрицательные бактерии представлены 11-ю родами: Alcaligenes, Aquaspirillum, Caulobacter, Comamonas, Cytophaga, Myxococcus, Polyangium, Pseudomonas, Sporocytophaga, Xanthomonas, Xanthobacter. В большинстве образцов доминировали бактерии рода Arthrobacter, Bacillus, Rhodococcus и Streptomyces. В качестве субдоминантов выступали бактерии родов Cytophaga, Myxococcus и Polyangium. Группа среднего обилия и минорные компоненты представлены в основном грамотрицательными бактериями родов Alcaligenes, Aquaspirillum, Caulobacter, Comamonas, Pseudomonas, Sporocytophag, Xanthomonas, Xanthobacter, а также грамположительными бактериями родов Micrococcus, Micromonospora, Xanthomonas и Xanthobacter. В образцах, относительно богатых органическим углеродом (Pr2 и Pr13), выявлено высокое разнообразие активных гидролитиков – Cytophaga, Myxococcus, Polyangium, Sporocytophaga и копиотрофов – Alcaligenes, Comamonas, Pseudomonas, Xanthobacter и Xanthomonas. В образцах с относительно низким содержанием органического углерода (Pr28, A19-1 и A19-11) преобладали олиготрофы Caulobacter. В почве с микропрофилем на леднике доминировали бактерии Arthrobacter и актиномицеты Streptomyces; в инситном криоконите в стаканах протаивания – бактерии Arthrobacter, Bacillus, Rhodococcus и актиномицеты Streptomyces; в переотложенном дисперсном криоконите – бактерии Arthrobacter Bacillus, Rhodococcus; в переотложенном криоконите конической формы – бактерии Bacillus; в слаборазвитой почве на морене – бактерии Arthrobacter, Bacillus и актиномицеты рода Streptomyces. В основном бактериальные доминанты представлены типичными почвенными родами: субдоминанты – гидролитиками, а группы среднего обилия и минорные компоненты – протеобактериями.

Численность и таксономический состав сообществ культивируемых микромицетов. Суммарная численность почвенных микромицетов на образец составляла от 2.2×10¹ до 1.7×10⁴ КОЕ/г почвы (рис. 3). Наименьшие значения (порядка 10¹ КОЕ/г почвы) выявлены в образцах ледника Бертель – инситных криоконитах в стаканах протаивания; переотложенных дисперсных криоконитах; слаборазвитой почве на морене с участием материала криоконита (образцы Pr5, Pr7, Pr8, Pr13, Pr28 соответственно). Гораздо больше микромицетов (порядка 10³ КОЕ/г почвы) в образцах инситного криоконита в стаканах протаивания и слаборазвитой почве на морене с участием материала криоконита ледника Альдегонда (образцы A19-8, A19-11 соответственно). Максимум культивируемых микромицетов (1.7×10⁴ КОЕ/г почвы) обнаружен также в образцах инситного криоконита в стаканах протаивания ледника Альдегонда (образец A19-7). Однако для большей части исследованных образцов Шпицбергена численность микромицетов не превышала 10² КОЕ/г почвы. Численность культивируемых микромицетов уменьшалась в ряду: группа IV переотложенный криоконит конической формы > группа I почва с микропрофилем на леднике > группа III переотложенный дисперсный криоконит > V слаборазвитая почва на морене > группа II инситный криоконит в стаканах протаивания.

 

Рис. 3. Численность и таксономическое разнообразие микроскопических грибов

 

Из проанализированных объектов Шпицбергена выделено 25 видов микроскопических грибов, которые относятся к 19 родам из 2 отделов (табл. 6). Отдел Ascomycota представлен тремя телеоморфными (Antarctomyces, Pseudogymnoascus и Thelebolus) и 10 анаморфными родами (Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Cadophora, Cladosporium, Epicoccum, Hyphozyma, Penicillium, Phoma, Teberdinia). Отдел Basidiomycota представлен только дрожжами – Glaciozyma, Goffeauzyma, Leucosporidium, Mrakia и Rhodotorula. Представители отдела Mucoromycota не были зафиксированы в изученных образцах. Выделенные микромицеты относятся к 12 порядкам: Pleosporales (роды Alternaria, Epicoccum, Phoma); Eurotiales (роды Aspergillus, Penicillium); Dothideales (Aureobasidium); Helotiales (роды Cadophora, Pseudogymnoascus); Capnodiales (род Cladosporium); Leotiomycetes (роды Hyphozyma); Kriegeriales (роды Glaciozyma); Tremellales (род Goffeauzyma, Mrakia); Leucosporidiales (роды Leucosporidium); Saccharomycetales (род Torula); Dothideomycetes (роды Teberdinia); Thelebolales (роды Thelebolus); Sporidiobolales (род Rhodotorula). Кроме того, было выделено два типа стерильного пигментированного (Mycelia sterilia (dark color)) и гиалинового мицелия (Mycelia sterilia (light color)), который не удалось идентифицировать.

 

Таблица 6. Структура сообществ культивируемых почвенных микромицетов

Род/вид	Вариант
	Pr2	Pr5	Pr6	Pr7	Pr13	A19-7	A19-8	Pr4	Pr8	Pr9	A19-1	A19-2	Pr12	Pr28	A19-11
Alternaria alternata*,a,c,d,e (Fr.) Keissl.															+
Antarctomyces psychrotrophicus*,a,f Stchigel & Guarro	V		V
Aspergillus fumigatusa,e Fresen.		+	+					+				+
Aureobasidium pullulansa,b,e (de Bary & Löwenthal) G. Arnaud									+	+ V
Cadophora fastigiata*,с,f (J. F. H. Beyma) T. C. Harr. et McNew			+
Cadophora malorum*,с,d,f (Kidd & Beaumont) W. Gams				+		+
Cladosporium cladosporioides a,c,d,e (Fresen) G.A. de Vries											+
Epicoccum nigruma,b,cLink					+
Glaciozyma watsonii*,f Turchetti, L.B. Connell, Thomas-Hall & Boekhout		V	V					V		V
Goffeauzyma gilvescens*,f (Chernov & Babeva) Xin Zhan Liu, F.Y. Bai, M. Groenew. & Boekhout								V		V
Hyphozyma variabilis*,f de Hoog & M.T. Sm.			+
Leucosporidium frigidum*,f Fell, Statzell, I.L. Hunter & Phaff								V
Mrakia frigida*,f (Fell, Statzell, I.L. Hunter & Phaff) Y. Yamada & Komag.								V
Penicillium chrysogenuma Thom					+								+
Penicillium expansuma Link					+
Penicillium variabilea Sopp		+						+		+
Phoma exiguaa,c,d Desm.														V	+
Phoma herbaruma,c,d Westend.															+
Pseudogymnoascus pannoruma,e,f (Link) Minnis & D.L. Lindner						V+	V
Rhodotorula svalbardensis*,b,f (A. Jörg.) Purnima Singh, Shiv M. Singh, M. Tsuji, G.S. Prasad & Tam. Hoshino										V
Teberdinia hygrophila*,f Sogonov, W. Gams, Summerb. & Schroers						V +	V	V+			V +		V	V	V
Teberdinia sp.f						V+	V	V							V
Thelebolus microsporusa,f (Berk. et Broome) Kimbr.	V	V				V				V
Thelebolus globosus*,a,f Brumm. & de Hoog	+		V							+
Torula terrestris*,f P.C. Misra			+
Mycelia sterilia (dark color)			V+			V+
Mycelia sterilia (light color)		V	V+	V	V			V

Примечание. * ‒ виды, определенные по анализу участков ITS рДНК; ^а ‒ cапротрофы; ^b ‒ эпифиты/эндофиты/эккрисотрофы; ^c ‒ потенциальные патогены растений; ^d – целлюлолитики; ^e ‒ условные патогены животных и человека; ^f – виды характерные для холодных экосистем. V – рост отмечен при +5°С; + – рост отмечен при +25°С.

 

Для выявления психрофильной микобиоты инкубирование посевов было проведено не только при стандартной (+25°С), но и при пониженной температуре (+5°С). Одни штаммы в посевах были обнаружены только при +5°С (штаммы видов: Antarctomyces psychrotrophicus, Glaciozyma watsonii, Goffeauzyma gilvescens, Leucosporidium frigidum, Mrakia frigida, Rhodotorula svalbardensis, Thelebolus microsporus), другие – исключительно при +25°С (штаммы видов: Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Cadophora fastigiata, Cadophora malorum, Cladosporium cladosporioides Hyphozyma variabilis, Penicillium chrysogenum, Penicillium variabile, Phoma herbarum), а третьи (Aureobasidium pullulans, Phoma exigua, Pseudogymnoascus pannorum, Teberdinia hygrophila, Teberdinia sp., Thelebolus globosus, Mycelia sterilia (dark color), Mycelia sterilia (light color)) – отмечены в посевах при обеих температурах. Большинство штаммов выявлено лишь при повышенной температуре.

Культивируемые микромицеты относились к различным эколого-трофическим и функциональным группам – cапротрофы, эпифиты/эндофиты/эккрисотрофы, потенциальные патогены растений, целлюлолитики, условные патогены животных и человека, виды, характерные для холодных экосистем.

Сапротрофные микромицеты выявлены из всех исследуемых образцов и представлены как типичными почвенными родами [44, 81] – Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Cladosporium, Epicoccum, Penicillium, Phoma, Pseudogymnoascus, Thelebolus, так и видами, характерными для холодных экосистем, – Antarctomyces psychrotrophicus, Cadophora fastigiata, Cadophora malorum, Glaciozyma watsonii, Goffeauzyma gilvescens, Hyphozyma variabilis, Leucosporidium frigidum, Mrakia frigida, Pseudogymnoascus pannorum, Rhodotorula svalbardensis, Teberdinia hygrophila, Teberdinia sp., Thelebolus microsporus, Thelebolus globosus.

Пятая часть (20%) выявленных видов (Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Aureobasidium pullulans, Cladosporium cladosporioides, Pseudogymnoascus pannorum) входит в базу данных BSL патогенных для человека и животных видов [42].

Среди выделенных микромицетов было мало видов, экологически связанных с растениями, – эпифитов, эндофитов или эккрисотрофов – Aureobasidium pullulans, Epicoccum nigrum и Rhodotorula svalbardensis. Однако 20% видов являлись целлюлолитиками, практически все из которых одновременно и фитопатогены [44, 81], – Alternaria alternata, Cadophora malorum, Cladosporium cladosporioides, Phoma exigua, Phoma herbarum.

Наибольшим видовым разнообразием характеризовались роды: Penicillium (3 вида), а также Cadophora, Teberdinia и Thelebolus (по 2 вида). По численности (от 1.43×10³ до 2.0×10⁴ КОЕ/г почвы) и обилию (от 32 до 94%) доминировали представители сапротрофных и характерных для холодных экосистем видов – Teberdinia hygrophila, Teberdinia sp. и Thelebolus microsporus. Субдоминантами по численности (от 2.10×10² до 4.1×10² КОЕ/г почвы) и обилию (от 10 до 19%) являлись Pseudogymnoascus pannorum, Mycelia sterilia (dark color) и Mycelia sterilia (light color). Численность остальных выявленных микромицетов была мизерна – от 1.40×10¹ до 8.1×10¹ КОЕ/г почвы.

В первичной почве на леднике доминировали микромицеты Thelebolus microsporus и Thelebolus globosus; впервые показано, что в инситном криоконите в стаканах протаивания преобладает Teberdinia hygrophila; в переотложенном дисперсном криоконите – дрожжи Aureobasidium pullulans, Glaciozyma watsonii и Goffeauzyma gilvescens; в переотложенном криоконите конической формы – Teberdinia hygrophila; в слаборазвитой почве на морене – Teberdinia hygrophila и Thelebolus microsporus.

Численность копий функциональных генов цикла азота. Количество генов азотфиксиации у бактерий nifH варьировало от 9.89×10⁷ копий генов/г субстрата (слаборазвитая почва на морене с участием материала криоконита ледника Альдегонда, образец A19-11) до 9.81×10¹⁰ копий генов/г субстрата (переотложенный дисперсный криоконит с ледника Бертель, образец Pr8) (рис. 4). Большинство образцов (8 из 15) характеризовалось высокими значениями численности гена (около 10¹⁰ копий гена/г субстрата) и 10⁹ копий гена/г субстрата (6 шт. из 15 или 40%). В среднем для образцов с ледника Бертель (группа Pr) средние значения численности гена nifH были выше (2.38×10¹⁰ копий гена/г почвы), чем для образцов с ледника Альдегонда (группа A19) ‒ 2.09×10¹⁰ копий гена/г почвы. Из этих групп выделяются образцы Pr8 и A19-2 с максимальной численностью генов – 9.81×10¹⁰ и 3.26×10⁹ копий гена/г почвы соответственно. На фоне остальных проанализированных криоконитов образец A19-11 характеризовался относительно низкой численностью функциональных генов nifH ‒ 9.89×10⁷ копий генов/г почвы.

 

Рис. 4. Численность копий функциональных генов amoA, nifH бактерий и nirK

 

Количество генов нитрификации гена аmoA у аммонийокисляющих бактерий варьировало от 5.33×10⁶ копий гена/г субстрата в слаборазвитой почве на морене с участием материала криоконита ледника Альдегонда (образец A19-11) до 4.86×10⁹ копий гена/г почвы в переотложенном дисперсном криоконите (ледник Бертель, образец Pr8). Большинство образцов характеризовалось значениями около 10⁹ (8 из 15 или 53%) и 10⁶ копий гена/г субстрата (6 из 15 или 40%). Для ледника Бертель (группа Pr) средние значения гена amoA выше (1.64×10⁹ копий ген/г субстрата), чем для Альдегонда (группа A19) ‒ 1.21×10⁹ копий ген/г почвы. Из этих групп выделяются образцы Pr8 и A19-2 (группа III, переотложенный дисперсный криоконит) с максимальной численностью аммонийокисляющих бактерий ‒ 4.86×10⁹ и 3.68×10⁹ копий гена/г субстрата соответственно. На фоне остальных проанализированных образцов A19-11 характеризовался низкой численностью amoA ‒ 5.33×10⁶ копий гена/г субстрата. Количество генов денитрификации у бактерий nirK варьировало от 4.82×10⁷ копий гена/г субстрата в слаборазвитой почве на морене с участием материала криоконита ледника Альдегонда (образец A19-11) до 3.34×10¹⁰ копий гена/г почвы в слаборазвитой почве на морене с участием материала криоконита ледника Бертель (образец Pr28). Большинство образцов (14 из 21 или 67%) характеризовалось значениями около 10⁹ копий гена/г почвы. Также многие образцы (8 из 15 или 53%) имели значения около 10¹⁰ копий гена/г почвы и 10⁹ копий гена/г субстрата (6 из 15 или 40%). В среднем для образцов ледника Бертель (группа Pr) средние значения количества функционального гена nirK были выше (1.47×10¹⁰ копий ген/г субстрата) по сравнению с результатами для ледника Альдегонда (группа A19) – 8.46×10⁹ копий гена/г почвы. На фоне остальных проанализированных органо-минеральных систем образец A19-11 характеризовался относительно низкой численностью гена nirK – 4.82×10⁷ копий гена/г почвы.

В целом численность копий всех проанализированных генов цикла азота (amoA, nifH и nirK) имела тенденцию к уменьшению в ряду: группа I почва с микропрофилем на леднике > группа IV переотложенный криоконит конической формы > группа V слаборазвитая почва на морене > группа II инситный криоконит в стаканах протаивания > группа III переотложенный дисперсный криоконит.

ОБСУЖДЕНИЕ

Общая биомасса микроорганизмов. В известных работах микробную биомассу в почвах и криоконитах Шпицбергена определяли лишь с помощью оценки содержания фосфолипидов жирных кислот (метод PLFA) [59], измерения субстрат-индуцированного дыхания в лаборатории [59, 94], а также посредством измерения концентрации аденозин-5-трифосфата (АТФ; индекс живой микробной биомассы) [68]. Однако данные методы, в отличие от люминесцентной микроскопии, не являются прямыми, поэтому не могут дать достоверную информацию о численности и биомассе микроорганизмов в почве [63]. Использованный метод прямой люминесцентной микроскопии позволил визуализировать клетки микроорганизмов и провести расчеты содержания грибной и прокариотной биомассы, а также определить их соотношение.

Впервые показано, что значительная часть микробной биомассы супрагляциальных объектов представлена грибами, что более характерно для почв, а не криоконитов [53, 63]. Полученные значения содержания биомассы микроорганизмов сопоставимы с таковыми для почв северных территорий архипелага Новая Земля [21]. Минимальные значения биомассы в проанализированных образцах сходны, а максимальные – примерно в 8 раз меньше по сравнению с таковыми для почв Земли Франца-Иосифа [26, 23]. Для существенной доли грибов исследованных образцов свойственно преобладание одноклеточных пропагул, по-видимому, по большей части представленных дрожжами, – чрезвычайно устойчивых к негативным абиотическим факторам жизненными формами микобиоты [95]. Объекты ледника Бертель (группа образцов Pr) имеют несколько большие запасы биомассы грибов, численность прокариот, а также длину грибного и актиномицетного мицелия по сравнению с ледником Альдегонда (группа образцов A19).

Структура биомассы грибов. В большинстве исследованных образцов содержание биомассы микобиоты сопоставимо с таковым для почв северных территорий архипелага Новая Земля [21]. Минимальные значения биомассы в проанализированных объектах Шпицбергена сходны, а максимальные примерно в 8 раз меньше, чем для почв Земли Франца-Иосифа [20, 23, 26]. В то же время в инситных криоконитах в стаканах протаивания (образцы Pr6 и Pr7) биомасса грибов в 2–5.5 выше по сравнению с остальными изученными образцами архипелага Шпицбергена. По-видимому, это может быть обусловлено повышенным содержанием в них органического углерода (2.56 и 2.68% соответственно).

Для большинства органогенных и органо-минеральных горизонтов почв и почвоподобных тел характерно преобладание мицелия в биомассе микобиоты [24, 72]. Тем не менее ряд исследованных образцов не содержал гиф. Это свидетельствует об угнетенном состоянии грибов в данных локусах, по-видимому, из-за низкого содержания органического вещества и малой активности воды. Такие выводы подтверждаются рядом работ [55, 90]. Около трех четвертей мицелия грибов представлено тонкими формами до 3 мкм в диаметре, что характерно для полярных регионов и, вероятно, является адаптацией к олиготрофным условиям. Не выявлено пряжковых гиф, что косвенно свидетельствует о низком содержании в этих арктических субстратах мицелиальных представителей отдела Basidiomycota [2, 89, 90].

В образцах Pr2 и Pr28, A19-7, A19-8, A19-11 среди одноклеточных пропагул обнаружено много округлых и овальных клеток, которые, судя по морфологическим критериям и наличию у них почкования, можно отнести к дрожжам – одной их характерных жизненных форм микобиоты в экстремально холодных экосистемах [39]. Дрожжи в основном одноклеточны, поэтому их трудно отличить от покоящихся грибных пропагул (спор, конидий и др.) [25].

Объекты на леднике Бертель (группа образцов Pr) имеют несколько большие запасы биомассы грибов, численность одноклеточных пропагул и длину грибного мицелия по сравнению с ледником Альдегонда (группа образцов A19). Однако значения для отдельных образцов Бертель меньше, чем для Альдегонда, и наоборот. Поэтому можно заключить, что условия развития микобиоты зависят не от географической широты, а от локальных условий (экологических факторов), в которых находится объект исследования [95].

Структура биомассы прокариот. Численность одноклеточных прокариот в исследованных объектах архипелага Шпицберген на порядок больше по сравнению со значениями для почв северных территорий архипелага Новая Земля [21] и сопоставима с количеством прокариот для территорий Земли Франца-Иосифа [23, 26] и Восточной Антарктиды [16, 24].

Длина мицелия актиномицетов в проанализированных объектах Шпицбергена в 2–3 раза больше по сравнению с таковой для почв севера Новой Земли [21] и в 4–6 раз меньше, чем для Земли Франца-Иосифа [23].

Практически все объекты на леднике Бертель имеют несколько большую численность прокариот и длину актиномицетного мицелия по сравнению с ледником Альдегонда. Исключением являются лишь образцы A19-7 и A19-8 группы II инситных криоконитов в стаканах протаивания, где количество одноклеточных прокариот максимально по сравнению со значениями по всей выборке образцов. Это может быть связано с высокой гранулированностью данных объектов, которая обычно обусловливается аккумуляцией полисахаридных слизей в результате активного развития нитчатых цианобактерий [80].

Численность и таксономическая структура комплекса культивируемых сапротрофных бактерий и актиномицетов в исследованных криоконитах Шпицбергена сравнима с таковыми для почв архипелага [82, 83] и севера Новой Земли [22]. Однако численность сапротрофных культивируемых бактерий и число таксонов в проанализированных образцах значительно ниже по сравнению с грунтами Восточной Антарктиды [16, 60]. Такие различия могут быть связаны с климатическим фактором [51].

В проанализированных органо-минеральных системах доминировали грамположительные бактерии, представленные таксонами, устойчивыми к экстремальным условиям, что типично для высоких широт [61, 65]. Субдоминантами в образцах с относительно высоким обилием органического углерода являлись представители родов Bacillus, Cytophaga, Myxococcus, Polyangium и Streptomyces ‒ активные деструкторы растительных полимеров [13, 47]. В образцах с относительно низким содержанием органического углерода субдоминанты представлены родами Bacillus и Streptomyces. Группа среднего обилия и минорные компоненты включали грамотрицательные бактерии, доля которых обычно невелика в полярных почвах [65]. Определенного интереса заслуживает выделение из образцов с низким содержанием органического углерода родов Caulobacter и Aquaspirillum – типичных представителей олиготрофных и обводненных экосистем [78]. Такой перечень таксонов может свидетельствовать о переносе минеральных и органических частиц супрагляциальных объектов с других территорий [32].

Численность и таксономический состав комплексов культивируемых микромицетов изученных объектов Шпицбергена по порядку значений и списку видов в общих чертах соответствовали данным, ранее полученным как для других районов архипелага [9, 10, 12], так и для иных территорий полярных областей: Земли Франца-Иосифа [11, 26] и Восточной Антарктиды [3, 17, 20, 57].

Выявлены специфические черты структуры сообществ микромицетов, свойственные исследованным образцам. Так, Teberdinia hygrophila, Antarctomyces psychrotrophicus и Hyphozyma variabilis обнаружены на территории Шпицбергена впервые. Род Teberdinia с единственным видом T. hygrophila впервые описан совсем недавно (2005 г.) и выделен из высокогорных почв Теберды (Карачаево-Черкесская Республика, Россия) [84]. В 2010 г. T. hygrophila обнаружена в донных отложениях Карского моря [38]; в 2014 г. – в вечномерзлых грунтах Антарктиды [58]; в 2016 г. – в многолетнем льду пещеры Румынии и в высокогорных почвах Кореи [34]. Antarctomyces psychrotrophicus и Hyphozyma variabilis также выявляют лишь в полярных экосистемах и высокогорьях [3, 16, 20, 22, 42]. Таким образом, данные таксоны обнаруживаются в мире достаточно редко и в чрезвычайно удаленных друг от друга регионах, характеризующихся экстремально холодным климатом. Такая необычная встречаемость (в Арктике, Антарктике, высокогорьях и дне морей) показана и для других таксонов микроскопических грибов и названа “биполярным эндемизмом” [89].

Отметим, что представители рода Teberdinia являлись доминантами для части образцов – численность доходила до 2.0×10⁴ КОЕ/г почвы, а относительное обилие возрастало до 94%. Поэтому представляется странным, как данный микромицет оставался невыявленным на Шпицбергене до настоящего времени. Возможно, физиологические особенности рода Teberdinia таковы, что его развитие возможно лишь в специфических экологических нишах [84].

Исследованные объекты Шпицбергена отличаются между собой по структуре сообществ микромицетов, однако Teberdinia hygrophila, Thelebolus microsporus и Mycelia sterilia (light color) характерны для большинства образцов.

Отличительной чертой образцов с ледника Альдегонда являлось наличие выраженных доминантов Teberdinia hygrophila, Teberdinia sp. и Thelebolus microsporus и чрезвычайно низкого разнообразия культивируемых микроскопических грибов. Численность практически всех микромицетов для Альдегонда относительно велика. Образцы данной локации отличаются от образцов ледника Бертель отсутствием ряда видов – Antarctomyces psychrotrophicus, Aspergillus fumigatus, Aureobasidium pullulans, Cadophora fastigiate, Cadophora malorum, Epicoccum nigrum, Glaciozyma watsonii, Goffeauzyma gilvescens, Hyphozyma variabilis, Leucosporidium frigidum, Mrakia frigida, Penicillium variabile, Penicillium chrysogenum, Penicillium expansum, Rhodotorula svalbardensis, Thelebolus globosus, Torula terrestris, а также Mycelia sterilia (light color). В образце A19-2 переотложенного дисперсного криоконита микромицеты не выявлены. Важно отметить, что в леднике Альдегонда не обнаружены дрожжи, что может указывать на меньшее содержание доступного ОВ и более суровые климатические условия [31]. Странным кажется отсутствие в образцах Альдегонды представителей эвритопного рода Penicillium, который обнаружен в леднике Бертель. Ввиду того, что Penicillium – типичный почвенный сапротроф и умеренный ксерофил [43], это может свидетельствовать о большем сходстве объектов ледника Бертель с почвами по структуре организации, количеству ОВ и условиям увлажнения.

Ледник Бертель характеризовался отсутствием доминантов, но большим по сравнению с Альдегондом разнообразием культивируемых микроскопических грибов. Численность всех микромицетов данных образцов мала; выявлены дрожжи нескольких родов. В образцах ледника Бертель нет некоторых видов, которые отмечены в Альдегонде – эвритопов Alternaria alternata и Cladosporium cladosporioides, а также типичных видов для холодных экосистем – Phoma herbarum и Pseudogymnoascus pannorum.

Численность функциональных генов цикла азота. Численность копий ключевого гена азотфиксации у бактерий nifH в исследованных почвах сопоставима со значениями для почв севера Новой Земли [20] и выше значений, полученных для почв тундр Ненецкого автономного округа [98]. Обилие гена nifH, ответственного за фиксацию атмосферного азота, коррелирует с содержанием общего почвенного азота, нитратов и аммонийсодержащих соединений, как и в других почвенно-экологических исследованиях [64, 76], в том числе для Арктических территорий [87, 94].

Число копий гена amoA в проанализированных криоконитах Шпицбергена на два порядка выше значений, известных для криоконитов ледника Урумчи в горах Тянь-Шаня (Китай) [80], тундровых почв Ненецкого автономного округа [98] и почв севера Новой Земли [20]. Гены аммониймонооксигеназы (amoA) имеют большое распространение в почвах и природных водах [88]. В связи с этим предполагаем, что высокую численность данной группы можно связать с интенсивным преобразованием фиксируемого диазотрофами азота в нитратную форму [74]. Наименьшая численность бактериальных генов amoA среди всех рассмотренных функциональных генов может быть объяснена низким содержанием органического азота во всех проанализированных почвах [94]. Известно, что обилие бактериального гена amoA в почве коррелирует с количеством аммонийсодержащих соединений [73].

Численность функционального гена денитрификации бактерий nirK в изученных криоконитах Шпицбергена сопоставима со значениями для почв севера Новой Земли [20] и на порядок меньше, чем для тундровых почв Ненецкого автономного округа [98]. Оценивая процессы денитрификации, обычно рассматривают 2 функциональных гена: nirK и nirS. Согласно некоторым исследованиям, nirK (ген, кодирующий нитритредуктазу меди) более распространен в наземных экосистемах, тогда как nirS (ген, кодирующий цитохром cd1-нитритредуктаза) более распространен в морских экосистемах [37, 54, 93].

В целом, численность всех проанализированных функциональных генов, связанных с трансформацией азота (amoA, nifH и nirK), выше для образцов ледника Бертель (группа Pr), чем для образцов ледника Альдегонда (группа A19). Полагаем, это может быть связано с гораздо более высоким отношением C/N в образцах Бертель по сравнению с образцами ледника Альдегонда. Отношение C/N обычно обусловливает интенсивность протекания всех процессов цикла азота в экосистеме [66].

Численность функциональных генов nifH и amoA максимальна для образцов A19-2 и Pr8, в то время как наибольшие значения гена nirK выявлены для образца Pr28. Вероятно, это можно объяснить низким содержанием азота во всех этих криоконитах (особенно для Pr28).

Минимальная численность всех проанализированных функциональных генов, связанных с трансформацией азота (amoA, nifH и nirK), отмечена для образца A19-11. Данный факт, в первую очередь, может быть обусловлен относительно низким соотношением С/N, при котором активно идут процессы иммобилизации азота в биомассу микроорганизмов [28].

Известно, что наличие того или иного функционального гена у микроорганизма не всегда говорит, что такой ген реально работает в природных условиях [52]. Поэтому высокая численность рассмотренных функциональных генов цикла азота еще не доказывает, что в криоконитах Шпицбергена интенсивность процессов выше, чем в более южных регионах с менее суровым климатом.

В исследованных криоконита Шпицбергена наибольшей численностью обладали гены азотфиксации nifH (почти до 10¹⁰ копий гена/г почвы). Это опровергает работы, где выявлено преобладание генов, связанных с денитрификацией (nirK и nirS) по сравнению с nifH и amoA [76, 98]. Полагаем, такая закономерность может быть связана с экстремальными климатическими условиями в арктических олиготрофных (обедненных питательными элементами) экосистемах, где развитие жизни, в первую очередь, лимитируется содержанием доступных форм азота [66, 94].

Значительная численность функциональных генов микроорганизмов свидетельствует об интенсивном протекании процессов трансформации азота в супрагряциальных образцах Шпицбергена и заметном вкладе прокариот в продукцию парниковых газов, по крайней мере, в теплый период года.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подтверждена первая выдвинутая рабочая гипотеза. Показано существенное изменение структуры сообщества микроорганизмов (численность, таксономическое разнообразие, соотношение эколого-трофических групп) в ряду супрагляциальных тел острова Западный Шпицберген по выделенным группам образцов. Количественные показатели микробиома исследованных объектов варьируют в широких пределах, нижние значения которых соответствуют высокоарктическим пустошам, а высшие – ландшафтам умеренного климата. Поэтому, несмотря на общность названия (криоконит), их биологические параметры могут существенно отличаться.

Частично подтверждена вторая предложенная рабочая гипотеза. Впервые показано, что доминирующим (до 99% по массе) компонентом микробиома супрагляциальных объектов (как в аэрируемых криоконитах, так и в стаканах протаивания с талой водой) могут являться грибы, большая часть биомассы которых представлена мицелием, что свидетельствует о высокой активности микобиоты в супрагляциальных объектах архипелага. Микроскопические грибы Teberdinia hygrophila, Antarctomyces psychrotrophicus и Hyphozyma variabilis обнаружены на территории Шпицбергена впервые, что представляет значительный интерес в плане изучения микробного разнообразия экстремально холодных биотопов Арктики. Впервые оценена биомасса микроорганизмов, а также количество функциональных генов цикла азота в криоконитовом материале ледников Альдегонда и Бертель архипелага Шпицберген. Почти три четверти всех выявленных микроорганизмов представлены мелкими формами, что характерно для экстремальных экосистем.

Сопоставляя совокупность проанализированных микробиологических параметров в исследованных супрагляциальных объектах и почвах (почвоподобных телах) других высокоширотных территорий, можно выстроить следующий ряд по увеличению биологической активности субстратов: оазисы Восточной Антарктиды < север Новой Земли = Шпицберген < Земля Франца-Иосифа. Можно предположить, что на рост и активность микроорганизмов, в первую очередь, будут влиять параметры конкретной экологической ниши, а не глобальные географические условия региона. Например, в криоконитах складываются относительно благоприятные условия для развития жизни – защищенность от ветра, повышенная инсоляция и более высокая температура, высокое содержание питательных элементов, достаточная влажность и др. В то же время архипелаг Шпицберген находится в высокоарктической природной зоне с экстремальным климатом, а также имеет мощный ледниковый покров, оказывающий иссушающее и охлаждающее действие.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках научного проекта № 20-17-00212: блок микробиологических исследований и определение содержания углерода и азота в криоконите и почвах. Полевые работы проводились при поддержке темы государственного задания Института географии РАН по Шпицбергену.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

D. A. Nikitin

Dokuchaev Soil Science Institute; Institute of Geography, RAS

Author for correspondence.
Email: dimnik90@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8533-6536
Russian Federation, Moscow; Moscow

L. V. Lysak

Lomonosov Moscow State University

Email: dimnik90@mail.ru
Russian Federation, Moscow

E. P. Zazovskaya

Institute of Geography, RAS; University of Georgia

Email: dimnik90@mail.ru
Russian Federation, Moscow; Athens, USA

N. S. Mergelov

Institute of Geography, RAS

Email: dimnik90@mail.ru
Russian Federation, Moscow

S. V. Goryachkin

Institute of Geography, RAS

Email: dimnik90@mail.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files