Copper ions’ influence on thiocyonate dehydrogenase packing and conformation in a crystal

Full Text

Введение

Медьсодержащий фермент тиоцианатдегидрогеназа (TcDH) участвует в азотном или/и энергетическом обмене у ряда сероокисляющих микроорганизмов [1, 2], катализируя реакцию окисления тиоцианата с образованием цианата и элементной серы и переносом двух электронов на внешний акцептор [3]. Впервые пространственная структура была установлена для фермента из галоалкалофильной бактерии Thioalkalivibrio paradoxus ARh1 (tpTcDH) [3]. Недавно структуры свободного фермента и его комплекса с тиомочевиной были установлены с атомным разрешением для другого представителя класса из бактерии Pelomicrobium methylotrophicum (pmTcDH), что позволило точно охарактеризовать детали строения активного центра в различных состояниях и уточнить первые этапы каталитической реакции [4].

Оба охарактеризованных фермента обладают сходной структурой и являются димерами в растворе и кристалле [3, 4]. Субъединица TcDH представляет собой семилопастной β-пропеллер, сформированный антипараллельными β-слоями. Субстратный канал ведет с поверхности фермента в центральную полость пропеллера, где располагается активный центр TcDH, содержащий в качестве кофакторов три иона меди Cu1–3. Согласно имеющимся структурным данным [4] субъединица TcDH может принимать открытую конформацию, где активный центр доступен для растворителя, и закрытую конформацию, в которой субстратный канал закрыт от растворителя консервативным остатком пролина. Механизм перехода между конформациями остается не до конца выясненным.

Несмотря на сходство общей структуры, димеры tpTcDH и pmTcDH обладают одним заметным и интересным отличием. Конформация субъединиц в димере tpTcDH одинакова во всех установленных структурах, включая варианты с точечными заменами [3, 5, 6]. Обе субъединицы всегда находятся либо в закрытой, либо в открытой конформации. Закрытая конформация субъединиц tpTcDH наблюдалась только в одной структуре (PDB ID: 6UWE), где в активном центре фермента был обнаружен неидентифицируемый лиганд [3]. В случае pmTcDH в организации димера наблюдается асимметрия: одна субъединица находится в закрытой конформации, а другая – в открытой [4]. При этом эффекта кооперативного взаимодействия между субъединицами pmTcDH в кинетических экспериментах не отмечалось.

Рост белковых кристаллов и, как следствие, упаковка в нем молекул зависят от ряда различных факторов, включая параметры кристаллизационного эксперимента [7–10] и свойства кристаллизуемой молекулы [11]. На конформацию фермента может оказывать влияние и связывание лигандов (кофактора, субстрата и др.). Так, в случае сокристаллизации мРНК-кэпирующего фермента в комплексе с гуанозинтрифосфатом одна молекула из независимой части принимает закрытую конформацию, а другая – открытую [11]. В то же время кристаллизация формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. в комплексе с никотинамидадениндинуклеотидом и азидом привела к тому, что кристаллы комплекса имели другую пространственную группу, в которой молекулы фермента принимали закрытую конформацию по сравнению с открытой конформацией в апоформе фермента [12].

В данной работе проведена проверка влияния кофакторов (ионов меди) на упаковку молекул pmTcDH в кристалле и конформацию субъединиц димера.

Материалы и методы

Выделение и очистка pmTcDH. Экспрессию рекомбинантного препарата pmTcDH в клетках Escherichia coli, выделение и очистку проводили согласно методике, описанной в [4]. Полученный гомогенный препарат pmTcDH не содержал ионов меди (апоформа) и не обладал ферментативной активностью.

Кристаллизация. Для кристаллизации использовали препарат апоформы pmTcDH с концентрацией 11.5 мг/мл в 25 мМ MOPS, рН 7.5, содержавшем 150 мМ NaCl.

Кристаллизацию осуществляли методом диффузии паров (вариант “висячая капля”) в 24-луночных планшетах (VDX, Hampton Research, США) при температуре 15°С. Для этой цели смешивали 1 мкл раствора белка и 1 мкл раствора осадителя, в лунку планшета вносили 500 мкл раствора осадителя. Кристаллы апоформы pmTcDH были получены в следующих условиях: 0.1 M HEPES, pH 7.5, 21% PEG 8000, 8% этилен гликоля.

Восстановление трехъядерного центра ионами меди в кристалле. Встраивание ионов меди в активный центр апоформы pmTcDH в кристалле проводили настаиванием с ионами меди (2+) и ионами меди (+). Для настаивания ионами меди (2+) кристаллы апоформы pmTcDH помещали на ~24 ч и более в кристаллизационный раствор, содержавший 1 мМ CuCl₂. Для настаивания с ионами меди (+) кристаллы апоформы pmTcDH помещали на 12 ч в кристаллизационный раствор, содержавший 1 мМ CuCl₂ и 1 мМ аскорбата натрия.

Сбор дифракционных данных. Наборы дифракционных данных для кристаллов апоформы pmTcDH и pmTcDH, настоянных с ионами меди (2+) (pmTcDH^Cu2+), собирали на станции BL17UM (SSRF, Китай), а для кристалла pmTcDH, настоянного с ионами меди (+) (pmTcDH^Cu+) – на дифрактометре XtaLAB Synergy-S (Rigaku, Япония) в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Перед сбором дифракционных данных кристаллы помещали на 5–10 с в кристаллизационный раствор с добавлением 20% этиленгликоля в качестве криопротектирующего агента. Сбор дифракционных данных проводили при температуре 100 К.

Обработку данных для структур апоформы pmTcDH и pmTcDH^Cu2+ проводили с помощью программ XDS и XSCALE [13], а для pmTcDH^Cu+ – с помощью программы CrysAlis^Pro 1.0.43 (Rigaku, Japan). Статистика сбора данных представлена в табл. 1.

Таблица 1. Статистика сбора данных и уточнения структур апоформы pmTcDH, pmTcDH^Cu2+ и pmTcDH^Cu+

Примечание. В скобках приведены значения для данных высокого разрешения.

Решение и уточнение структур проводили с использованием комплекса программ CCP4 [14]. Все структуры были решены методом молекулярного замещения с помощью программы MOLREP [15] с использованием субъединицы холоформы pmTcDH (PDB ID: 8Q9X) в качестве исходной модели [4]. Уточнение проводили в программах REFMAC5 [16] и COOT [17]. Для структур фермента pmTcDH^Cu2+ и pmTcDH^Cu+ В-факторы ионов меди уточняли в анизотропном приближении на последних циклах уточнения. Статистика уточнения структур представлена в табл. 1. Анализ кристаллических контактов проводили с помощью сервиса PDBePISA [18]. Совмещение структур по всем сходным Сα-атомам проводили с помощью программы LSQKAB [19].

Результаты и их обсуждение

Субъединицы димера апоформы белка имеют одинаковую конформацию

Кристаллы апоформы pmTcDH были получены в условиях кристаллизации, в которых ранее росли кристаллы холоформы фермента. Однако пространственная группа и состав независимой части элементарной ячейки данных кристаллов различались. Пространственная группа кристаллов апоформы соответствует центрированной группе С222₁ (табл. 1) в отличие от примитивной Р2₁2₁2₁ для кристаллов холоформы [4]. Кроме того, в первом случае в независимой части элементарной ячейки обнаружен не димер, а три молекулы фермента (рис. 1а): димер (субъединицы А и В) и одна субъединица (субъединица С) второго димера с осью симметрии, совпадающей с кристаллографической.

Рис. 1. Три субъединицы А, В, С из независимой части элементарной ячейки (показана вторичная структура) и симметричная субъединица С (вторичная структура не показана) апоформы pmTcDH (PDB ID: 8Z75) (а). Положение остатка Р256 в закрытой конформации субъединицы апоформы pmTcDH (PDB ID: 8Z75) (б) и открытой конформации холоформы pmTcDH (PDB ID: 8Q9X) (в). Стрелка показывает направление движения остатка Р256 при открытии субстратного канала. Поверхность показана для аминокислотных остатков, формирующих стенки субстратного канала. Ионы меди активного центра показаны сферами.

Все молекулы апоформы фермента из независимой части элементарной ячейки имеют одинаковую закрытую конформацию (табл. 2). Остаток Р256, расположенный на подвижной петле 251–266, ограничивает доступ растворителя в активный центр всех трех субъединиц (рис. 1б), что соответствует закрытой конформации в структуре холоформы pmTcDH (табл. 2). В последнем случае при переходе в открытую конформацию остаток Р256 в составе петли смещается и открывает активный центр для внешнего растворителя и субстрата (рис. 1в). Подчеркнем, что в закрытой конформации апо- и холоформ подвижная петля 251–266 зафиксирована большим числом водородных связей с соседними участками полипептидной цепи (13 связей) по сравнению с открытой конформацией холоформы (9 связей). Водородные связи между парами остатков E253 и K68, E253 и Y129, G257 и Y397, E259 и H346 обнаружены только в закрытой конформации. Остатки Q347 и F401, важные для конформационных переходов между открытой и закрытой конформациями [5], в структуре апофермента упорядочены и принимают положение, соответствующее закрытой конформации холоформы.

Таблица 2. Сравнение субъединиц апоформы pmTcDH, pmTcDH^Cu2+ и pmTcDH^Cu+ с закрытой субъединицей апоформы и с закрытой и открытой субъединицами холоформы (PDB ID: 8Q9X)

Примечание. Приведены значения среднеквадратичного отклонения (Å) при совмещении по Сα-атомам. Название субъединиц, принимающих закрытую конформацию, обозначены курсивом.

Несмотря на отсутствие ионов меди, активный центр апоформы pmTcDH хорошо структурирован (рис. 2а): все остатки активного центра принимают одну конформацию и хорошо различимы на карте электронной плотности. Интересно отметить, что ионы меди Cu1 и Cu3 отсутствуют в активном центре. В то время как на месте иона Cu2 располагается максимум на карте электронной плотности (рис. 2б), который не может быть описан растворителем из-за короткого расстояния до окружающих лигандов. Данный максимум был описан как ион меди с заселенностью 0.2. Присутствие иона Cu2 в активном центре, вероятно, связано с тем, что фермент способен связывать небольшое количество ионов меди в процессе экспрессии белка в клетках E. coli. При этом в апоформе конформация аминокислотных остатков, координирующих ионы Cu2 и Cu3, соответствует таковому для холоформы (рис. 2а), а отсутствие иона Cu1 приводит к смещению остатка Н346 в альтернативное положение (рис. 2в). Н346 прочно фиксируется в этом положении сетью водородных связей непосредственно с Е259 из подвижной петли 251–266 и остатками N361, T400 посредством общей молекулы воды.

Рис. 2. Активный центр апоформы pmTcDH (PDB ID: 8Z75) (а) до настаивания кристаллов ионами меди. Максимум на разностной карте электронной плотности на уровне 3σ описан ионом меди Cu2 с заселенностью 0.2, соответствующие координационные расстояния указаны в Å (б). Совмещение структур апоформы (PDB ID: 8Z75) и холоформы (PDB ID: 8Q9X) показало (в), что в отсутствие иона Cu1 остаток Н346 меняет свое положение и образует водородные связи с остатком Е259 и молекулой воды. Восстановление трехъядерного медного центра pmTcDH^Cu2+ после настаивания кристаллов ионами меди (2+) (PDB ID: 8Z76): показаны максимумы на разностной карте электронной плотности на уровне 3σ в положениях ионов Cu1, Cu2, Cu3 (г). Ионы меди и молекулы воды – большие и маленькие сферы соответственно, координационные и водородные связи – толстые и тонкие пунктирные линии соответственно.

Анализ кристаллических контактов в структуре апо- и холоформ pmTcDH показал, что корреляции между числом кристаллических контактов и конформацией молекул из независимой части элементарной ячейки не наблюдается.

Встраивание ионов меди в активный центр сопровождается конформационными изменениями

Для восстановления полного трехъядерного медного центра кристаллы апоформы pmTcDH настаивали ионами меди. Полный трехъядерный медный центр, где ионы меди Cu1, Cu2 и Cu3 обладают полной заселенностью, был получен при настаивании кристаллов как ионами меди (2+) pmTcDH^Cu2+ (PDB ID: 8Z76, рис. 2г), так и ионами меди (+) pmTcDH^Cu+ (PDB ID: 8Z77). Однако в первом случае требуется большее время настаивания, что связано, вероятно, с большими энергетическими затратами при удалении гидратной оболочки иона меди (2+) в процессе связывания в активном центре фермента. Отметим, что медные белки часто проявляют избирательность к степени окисления ионов меди при их активации в кристалле [20, 21]. Например, в случае tpTcDH полный медный центр в структуре можно получить только при обработке кристаллов ионами меди (+) [3], что часто сопровождается возникновением артефактов в структуре.

Далее каждую их трех субъединиц из независимой части элементарной ячейки структур pmTcDH^Cu2+ и pmTcDH^Cu+ совмещали со структурами субъединицы апоформы и закрытой и открытой субъединицами холоформы (табл. 2). Полученные результаты показали, что встраивание ионов меди в активный центр в кристалле приводит к конформационным изменениям молекул апофермента.

При настаивании кристаллов ионами меди (2+) подвижная петля 251–266 принимает закрытую конформацию у субъединиц димера А и В, а в субъединице С наблюдаются два положения для данной петли (рис. 3а). При настаивании кристаллов ионами меди (+) петля 251–266 у субъединицы В остается в закрытом положении, а у субъединиц А и С данная петля изменяет свою конформацию на открытую. Отметим, что остатки Q347 и F401, также влияющие на переход между открытой и закрытой конформациями, в обеих структурах, настоянных с медью, плохо проявляются на карте электронной плотности.

Рис. 3. Два положения остатка Р256 на карте электронной плотности (2F_o – F_c), соответствующие закрытой и открытой конформации, в активном центре субъединицы С структуры pmTcDH^Cu2+ после настаивания кристаллов ионами меди (2+) (PDB ID: 8Z76) (а). Конформации субъединиц димера pmTcDH после настаивания кристаллов ионами меди: две закрытые субъединицы А и В в структуре pmTcDH^Cu2+ (PDB ID: 8Z76) (б), открытая А (сверху) и закрытая В (внизу) субъединицы в структуре pmTcDH^Cu+ (PDB ID: 8Z77) (в), две открытые субъединицы С и симметричная С в структуре pmTcDH^Cu+ (PDB ID: 8Z77) (г). На панелях б–г приведены врезки с изображением остатков, формирующих субстратный канал.

Полученные структурные данные позволили охарактеризовать набор состояний димера pmTcDH с полным трехъядерным медным центром, где обе субъединицы димера могут быть закрыты (субъединицы А и В в структуре pmTcDH^Cu2+, рис. 3б), могут принимать разные конформации (А и В в структуре pmTcDH^Cu+, рис. 3в) и могут быть открыты (С в структуре pmTcDH^Cu+, рис. 3г). Исходя из полученных данных можно заключить, что кристаллические контакты не ограничивают возможность конформационных переходов субъединиц pmTcDH, поскольку субъединицы А и С, образующие большее число контактов, демонстрируют большую подвижность петли 251–266 и остатков Q347 и F401 в сравнении с субъединицей В в обеих структурах pmTcDH^Cu2+ и pmTcDH^Cu+.

Таким образом, результаты проведенного исследования структуры апоформы pmTcDH и восстановления полного медного центра фермента настаиванием кристаллов с ионами меди наряду с ранее полученными данными для холоформы [4] позволяют заключить, что ионы меди в активном центре влияют на упаковку молекул фермента в кристалле и их предпочтительную конформацию. При этом симметричные контакты не ограничивают переходы между закрытой и открытой конформациями фермента. В случае отсутствия кофакторов в активном центре молекулы pmTcDH принимают наиболее жесткую – закрытую конформацию.

Заключение

Показано, что упаковка молекул pmTcDH в кристалле и конформация субъединиц фермента зависят от присутствия ионов меди в активном центре. В случае апоформы обе субъединицы димера принимают закрытую конформацию. Полный трехъядерный медный центр в структуре pmTcDH может быть восстановлен путем настаивания кристаллов с ионами меди (2+) или (+). Встраивание ионов меди в активный центр фермента в процессе настаивания вызывает конформационные переходы между закрытой и открытой конформациями субъединиц.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского научного фонда, грант № 23-74-30004.

About the authors

L. А. Varfolomeeva

Author for correspondence.
Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

A. Y. Solovieva

Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

N. S. Shipkov

Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

N. I. Dergousova

Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

М. E. Minyaev

Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

K. M. Boyko

Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

T. V. Tikhonova

Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

V. O. Popov

Email: l.varfolomeeva@fbras.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Three subunits A, B, C from the independent part of the unit cell (secondary structure is shown) and the symmetrical subunit C (secondary structure is not shown) of the apo form of pmTcDH (PDB ID: 8Z75) (a). The position of the P256 residue in the closed conformation of the subunit of the apo form of pmTcDH (PDB ID: 8Z75) (b) and the open conformation of the holo form of pmTcDH (PDB ID: 8Q9X) (c). The arrow shows the direction of movement of the P256 residue during the opening of the substrate channel. The surface is shown for the amino acid residues forming the walls of the substrate channel. Copper ions of the active site are shown as spheres.

Download (504KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Active center of the apo form of pmTcDH (PDB ID: 8Z75) (a) before infusion of crystals with copper ions. The maximum in the difference electron density map at the 3σ level is described by the copper ion Cu2 with an occupancy of 0.2, the corresponding coordination distances are given in Å (b). Superposition of the structures of the apo form (PDB ID: 8Z75) and holo form (PDB ID: 8Q9X) showed (c) that in the absence of the Cu1 ion, the H346 residue changes its position and forms hydrogen bonds with the E259 residue and a water molecule. Reduction of the trinuclear copper center of pmTcDHCu2+ after infusion of crystals with copper (2+) ions (PDB ID: 8Z76): maxima in the difference electron density map at the 3σ level are shown at the positions of the Cu1, Cu2, Cu3 ions (d). Copper ions and water molecules are large and small spheres, respectively; coordination and hydrogen bonds are thick and thin dotted lines, respectively.

Download (529KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Two positions of the P256 residue on the electron density map (2Fo – Fc), corresponding to the closed and open conformations, in the active site of the C subunit of the pmTcDHCu2+ structure after infusion of crystals with copper ions (2+) (PDB ID: 8Z76) (a). Conformations of the subunits of the pmTcDH dimer after infusion of crystals with copper ions: two closed subunits A and B in the pmTcDHCu2+ structure (PDB ID: 8Z76) (b), open A (top) and closed B (bottom) subunits in the pmTcDHCu+ structure (PDB ID: 8Z77) (c), two open C subunits and a symmetrical C in the pmTcDHCu+ structure (PDB ID: 8Z77) (d). Panels b–d show insets depicting the residues that form the substrate channel.

Download (754KB)

Indexing metadata

In the print version, the article was published under the DOI: 10.31857/S0023476125010027