Oligomerization of IHF protein in the presence of metal cations

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Хромосомы бактерий представляют собой кольцевые молекулы ДНК и играют ключевую роль во всех клеточных процессах [1]. Они содержат генетический код, обеспечивающий синтез белков, и определяют особенности наследственности и изменчивости бактерий. Размеры ДНК бактериальной хромосомы варьируются в среднем от 1 до 5 миллионов пар оснований (п.о.) и имеют длину ~1–2 мм, что однозначно требует ее упаковки в компактную структуру, не превышающей объем клетки. Сворачивание или компактизация бактериальных хромосом осуществляется с помощью таких механизмов, как молекулярный краудинг и суперспирализация ДНК [2]. Эти процессы тесно связаны с нуклеоид-ассоциированными белками (Nucleoid-Associated Proteins, NAP). NAP часто называют гистоноподобными белками, так как они обладают функциями, схожими с функциями гистонов, упаковывающими ДНК эукариот, хотя гистонами эти белки не являются. Они играют решающую роль в пространственной организации и компактизации нуклеоида, а также обеспечивают такие процессы, как репликация, рекомбинация, транспозиция и транскрипция [3, 4]. 

Существует множество различных NAP, которые синтезируются в разных количествах в различные периоды жизни и роста бактерий [5]. Эти периоды делятся на несколько фаз. Когда количество питательных веществ находится в избытке, бактерии находятся в стадии экспоненциального роста. При недостатке питательных веществ наступает этап стационарного роста, когда темпы роста популяции и смертности приблизительно равны. В зависимости от периода жизненного цикла бактерий происходят структурные изменения нуклеоида, в которых участвуют необходимые для данной фазы NAP. Особые изменения нуклеоида бактерий наблюдаются в поздней стадии стационарной фазы роста при формировании кристаллической формы генома [6]. Феномен образования кристаллов в живых клетках привлекает огромное внимание исследователей прежде всего из-за возможности сохранения жизнеспособности бактерий при самых неблагоприятных условиях в течение длительного периода. В фазе кристаллизации наиболее распространенными нуклеоид-ассоциированными белками являются белок IHF (Integration Host Factor) [7] и белок Dps (DNA – binding protein from starved cells) [8] с существенным преобладанием последнего [9]. Известно, что в этих условиях формирование устойчивых кристаллических комплексов Dps-ДНК предотвращает разрушение бактериального генома при воздействии различных стрессовых факторов, в том числе антибиотиков, т.е. приводит к устойчивости бактерий к лекарственным средствам [10]. Отметим, что проблема бактериальной резистентности к антибиотикам в настоящее время является весьма актуальной.

Хотя белки Dps и IHF тесно связаны друг с другом, так как они одновременно сосуществуют на поздней стационарной стадии роста бактерий при существенном снижении количества остальных NAP, роль IHF в процессе биокристаллизации остается невыясненной. В [11] на основании структурных исследований с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) было показано, что IHF образует олигомеры в виде цепочек, что в соответствии с функциональными свойствами этого белка, который стягивает соседние нити ДНК, может приводить к ее слоевой укладке. При продолжении стрессового воздействия молекулы IHF заменяются на Dps, и формируется защитный кристаллический Dps–ДНК-комплекс.

Однако не менее важен и обратный переход, т.е. возвращение к транскрипционно активной структуре нуклеоида, когда клетки могут перейти к экспоненциальной фазе и будут способны продолжать свою метаболическую активность. Оба процесса, как формирование биокристаллов, так и выход из этого состояния, зависят от изменения факторов окружающей среды. Например, в [12] показано, что повышение pH и концентрации MgCl₂ приводит к переключению связывания ДНК с Dps на IHF-связывание и распаду кристаллического Dps–ДНК-комплекса. Однако в настоящее время эти процессы остаются мало изученными и прежде всего необходимо исследовать структурные особенности отдельных нуклеоид-ассоциированных белков в различных условиях. Особенно это касается IHF как белка-предшественника процесса биокристаллизации.

Первоначально IHF был обнаружен как важный кофактор сайт-специфической рекомбинации фага λ [13]. Кристаллическая структура белка IHF показывает, что это облигатный гетеродимер, состоящий из переплетенных α- и β-субъединиц массой около 11 и 10.5 кДа соответственно. Каждая субъединица IHF представляет собой α-спираль, соединенную с β-слоями, вытянутыми в пространстве в виде длинных, подвижных β-тяжей – «рук». Эти «руки» содержат на конце консервативный аминокислотный остаток пролина, который позволяет изгибать ДНК путем встраивания между парами оснований, и облегчают обертывание ДНК вокруг белка. Благодаря электростатическим взаимодействиям между фосфатной основой ДНК и катионными аминокислотами IHF образуется сайт связывания длиной ~35 п.о. При этом IHF преимущественно связывается с консенсусной последовательностью из 13 п.о. 5'-(А/Т)ATCAANNNNTT(A/G)-3' (где N – это любой нуклеотид) [14].

Связывание IHF и ДНК происходит с помощью механизмов, чувствительных к факторам окружающей среды, например присутствию ионов K⁺ и Mg²⁺ [15]. По результатам калориметрических исследований термодинамики процессов связывания IHF с ДНК с помощью изотермического титрования показана возможность неспецифического связывания при низкой концентрации KCl и высокой стехиометрии IHF–ДНК [16].

Таким образом, для глубокого понимания роли IHF в процессе биокристаллизации и возникновения резистентности бактерий к антибиотикам необходимо проведение структурных исследований этого белка в различных условиях. Цель данной работы – последовательное определение функциональных и структурных особенностей поведения IHF в водной среде, содержащей катионы Mg²⁺ и K⁺. Для достижения поставленной цели использовали МУРР, позволяющий изучать структуру биологических макромолекул в растворе, т.е. в условиях, максимально приближенных к физиологическим [17]. Этот метод используется для получения трехмерных структур низкого разрешения и позволяет оценить олигомерное состояние белков и белковых комплексов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подготовка образца IHF. Экспрессию и очистку IHF проводили по методике, описанной в [11].

Растворы белка IHF переводили в буферы 10 мM Трис (буфер I), 20 мM Трис, 50 мM KCl, 2 мM MgCl₂ (буфер II) при pH 7.5 и концентрировали до 4.8 и 10 мг/мл.

Образцы перед измерениями центрифугировали в течение часа в охлаждаемой настольной центрифуге для избавления от возможных крупных агрегатов.

Эксперимент и анализ данных МУРР. Исследование нуклеоид-ассоциированного белка IHF с помощью МУРР проводили на станции «БиоМУР» [18, 19] Курчатовского источника синхротронного излучения (НИЦ «Курчатовский институт», Москва, Россия) в геометрии на пропускание. Исследовали образцы при концентрациях 4.8 и 10 мг/мл в буферных растворах, которые помещали в тонкостенные кварцевые капилляры диаметром 2 мм и толщиной стенок 0.01 мм. Для регистрации рентгенограмм использовали двухкоординатный детектор DECTRIS Pilatus3 1M c площадью рабочей поверхности 168.7 × 179.4 мм, разрешением 981 × 1043 точек и размером пикселя 172 мкм, установленный на расстоянии ~750 мм от образца. Интенсивность рассеяния I(s) была измерена в области значений векторов рассеяния 0.09 < s < 4 нм^–1, где s = (4psinq)/l, 2q – угол рассеяния, λ = 0.1445 нм – длина волны рассеяния. Для каждого образца с целью контроля возможных радиационных повреждений сняли по 12 экспериментальных кривых рассеяния со временем экспозиции 300 с каждая (суммарное время облучения 60 мин). Радиационного повреждения обнаружено не было. Точную калибровку угловой шкалы осуществляли в программе Fit2D [20]. В качестве стандарта угловой калибровки использовали бегенат серебра.

Первичную обработку полученных данных (усреднение кривых рассеяния, вычитание усредненной кривой рассеяния буферного раствора из усредненной кривой рассеяния белка и получение основных интегральных характеристик) проводили с помощью программы PRIMUS [21]. Дальнейшую обработку данных проводили с помощью программного комплекса ATSAS [22].

Для каждого рассматриваемого образца в дальнейшем анализе использовали наиболее информативно полезный интервал волновых векторов для избегания ошибочной интерпретации данных ввиду возможных шумов и погрешностей. Для этого использовали формализм выборки Шеннона и программу SHANUM [23].

Радиусы инерции рассчитывали как усредненные величины, рассчитанные с помощью программы косвенного преобразования GNOM [24], также с ее помощью определены функции распределения по расстояниям p(r), которые являются важнейшими структурными характеристиками белков и которые можно выразить с помощью обратного фурье-преобразования интенсивности рассеяния в виде:

$p\left(r\right)=\frac{1}{2{\pi }^2}\underset{0}{\overset{\infty }{}}s r I\left(s\right) \text{sin}\left(sr\right)ds$. (1)

Эта функция содержит информацию о форме и структуре образца, с ее помощью можно оценить максимальный размер D_max из условия, что p(r) = 0 при r > D_max.

Еще одна из самых важных интегральных характеристик, определяющая объем рассеивающих частиц, – это инвариант Порода (породовский объем) V_P [25], который рассчитывали по анализу полной кривой рассеяния с помощью программы PRIMUS.

Молекулярную массу определяли исходя из установленного эмпирического соотношения между породовским объемом V_P и молекулярной массой M_эксп, которое в среднем для белков составляет 1.65 [26].

Для расчета интенсивности рассеяния из атомной структуры объекта использовали программу CRYSOL [27], которая также приближает теоретическую кривую рассеяния к экспериментальным данным. В программе используется мультипольное разложение амплитуд рассеяния при расчете сферически усредненной картины рассеяния с варьированием контраста гидратной оболочки. Теоретическая кривая рассеяния рассчитывается так, чтобы минимизировать несоответствие (невязку)  между расчетным рассеянием и экспериментальными данными:

${\chi }^2=\frac{1}{N-1}\sum _j{\left[\frac{I_{\text{exp}}\left(s_j\right)-c{I}_{\text{calc}}\left(s_j\right)}{\sigma \left(s_j\right)}\right]}^2$, (2)

где N – число экспериментальных точек, I_exp(s_j) и s(s_j) – экспериментальные интенсивности и их ошибки, I_calc(s_j) – интенсивность, вычисленная от модели, c – шкалирующий множитель.

Моделирование структуры олигомеров IHF осуществляли с помощью программы HEMIX. Алгоритм программы заключается в том, что изначально моделируется структура, в которой каждый последующий строительный блок получается из предыдущего путем подобного трансформирования первого блока для получения второго из первого, третьего из второго и т.д. Затем рассчитываются все возможные конфигурации таких строительных блоков внутри олигомера, и с помощью их линейной комбинации приближаются экспериментальные данные МУРР. В настоящей работе при моделировании исходным строительным блоком был гетеродимер IHF (PDB ID: 1ihf).

Для количественной оценки и анализа состава равновесных смесей, полученных в HEMIX,  использовали программу OLIGOMER [28]. Алгоритм OLIGOMER основан на представлении кривых МУРР как линейной комбинации от различных компонентов равновесной смеси, где минимизируется расхождение χ² между экспериментальными и предсказанными кривыми рассеяния от равновесной смеси и оцениваются объемные доли  каждого компонента в растворе. Интенсивность рассеяния представляется по формуле

$I\left(s\right)=\sum _{k=1}^K{\nu }_k{I}_k\left(s\right)$, (3)

где K – число компонентов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С использованием формализма Шеннона [29] для анализа и обработки экспериментальных данных белка IHF были выбраны наиболее информативные интервалы волновых векторов 0.14 < s < 3.6 нм^–1 согласно табл. 1, где N – число шенноновских каналов:

 

Таблица 1. Характеристики информативности данных в формализме Шеннона

Образец	N, число каналов
10 мг/мл в буфере I	22
4.8 мг/мл в буфере I	16
10 мг/мл в буфере II	12
4.8 мг/мл в буфере II	9

 

$N=\frac{s}{\Delta s}, где \Delta s=\frac{\pi }{D_{\text{max}}}$.

Важно обратить внимание на уширение каналов в формализме Шеннона при добавлении в раствор ионов магния и калия, что свидетельствует о различии максимальных размеров белка в зависимости от состава буферного раствора. В данном случае наблюдается уменьшение размера белка в растворе, который содержит ионы металлов.

На рис. 1а представлены экспериментальные кривые малоуглового рассеяния от белка IHF при концентрациях 4.8 и 10 мг/мл в буферах I и II.

 

Рис. 1. Анализ кривых МУРР от белка IHF: а – экспериментальные кривые малоуглового рассеяния от IHF: 1 – концентрация 10 мг/мл в буфере I, 2 – концентрация 4.8 мг/мл в буфере I, 3 – концентрация 10 мг/мл в буфере II, 4 – концентрация 4.8 мг/мл в буфере II; a, b, c, d – соответствующие кривые, рассчитанные от функции распределения расстояниям (цветовая гамма соответствует парным функциям). Кривые разнесены попарно по вертикали для лучшей визуализации; б – функции распределения по расстояниям p(r): a, b, c, d соответствуют концентрациям 1, 2, 3, 4 соответственно на панели a; в – графики в координатах Кратки: 1, 2, 3, 4 соответствуют концентрациям панели а

 

Из анализа экспериментальных кривых наблюдается увеличение интенсивности в малых углах, что может свидетельствовать о возможной олигомеризации IHF. При этом в растворах могут присутствовать олигомеры различных степеней.

Поскольку в работе использовали буферы с разным химическим составом и, соответственно, разным воздействием на конформацию белка, для анализа свернутости и упорядоченности белка в растворе был построен график Кратки (рис. 1в) [30]. Характерный колоколообразный вид графика указывает на компактность белка в растворе.

Максимумы функций распределения по расстояниям p(r) оказались смещены влево, что характерно для сильно вытянутых рассеивающих объектов. Наличие пиков на спаде функции может свидетельствовать о наличии некоторых повторяющихся структурных форм, расположенных на определенных расстояниях друг от друга. Причем для белка IHF в буфере I, т.е. при отсутствии ионов магния и калия, эти пики выражены ярче и максимальные размеры D_max оказываются значительно больше (рис. 1б), что подтверждается анализом экспериментальных кривых в формализме Шеннона.

Интегральные структурные характеристики нуклеоид-ассоциированного белка IHF. С помощью программы PRIMUS провели анализ интегральных характеристик образцов, результаты которого представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Интегральные структурные характеристики (инварианты МУРР) нуклеоид-ассоциированного белка IHF в растворе

Образец	Rg, нм	VP, нм3	Мэксп, кДа	Dmax, нм
10 мг/мл в буфере I	6.7 ± 1	122 ± 14	74 ± 10	25
4.8 мг/мл в буфере I	3.9 ± 0.6	59 ± 6	36 ± 4	18
10 мг/мл в буфере II	3.01 ± 0.3	46 ± 5	28 ± 3	13
4.8 мг/мл в буфере II	2.85 ± 0.3	43 ± 4	26 ± 3	13

 

Так как у данных образцов предполагалась полидисперсность, т.е. наличие различных олигомерных форм, радиусы инерции R_g определяли не с помощью графика Гинье [31], а как усредненные величины, рассчитанные программой GNOM из функций распределения по расстояниям p(r). Теоретическое значение радиуса инерции R_g, полученное с помощью CRYSOL из кристаллической структуры IHF (PDB ID: 1ihf) для его гетеродимера, составляет 2.1 нм, что существенно ниже полученных значений в результате анализа экспериментальных данных МУРР. Усредненные максимальные размеры D_max, которые оценивали с помощью функций распределения по расстояниям p(r) (рис. 2б), оказались намного больше геометрического размера кристаллической структуры гетеродимера IHF, который составляет 6.6 нм, причем особенно выделяется увеличение максимального размера белка в случае отсутствия в растворе ионов магния и калия. Также наблюдается зависимость структурных инвариантов от состава буфера, в котором проводили исследования. Полученные молекулярные массы М_эксп (табл. 2) также значительно отличаются от теоретической массы димера IHF, которая составляет 21.5 кДа. Таким образом, в растворе присутствуют частицы со степенью олигомеризации больше димера.

 

Рис. 2. Приближение экспериментальных данных МУРР равновесными смесями от IHF в буфере I: a –  при концентрации 4.8 мг/мл, б – при концентрации 10 мг/мл, 1 – экспериментальные данные, 2 – расчетная кривая рассеяния, полученная в программе OLIGOMER от смеси олигомеров, полученных в HEMIX; в, г – модели гексамера и димера IHF при концентрации 4.8 мг/мл; е, ж – модели додекамера и тетрамера IHF при концентрации 10 мг/мл; д, з – гистограммы объемных и числовых долей в равновесной смеси олигомеров

 

Можно предположить, что в растворе присутствует смесь различных олигомеров IHF с исходной структурной единицей, представленной димером. Таблица 2 демонстрирует явную зависимость структурных инвариантов от состава буфера, в котором проводили исследования. Для растворов, в которых присутствуют ионы металлов, такие как магний и калий, менее выражен процесс олигомеризации: основные интегральные структурные характеристики IHF наиболее близки к характеристикам исходного гетеродимера. В образцах с белком IHF в буфере I, т.е. в отсутствие катионов металлов, олигомеризация более выражена, о чем свидетельствует увеличение интенсивности рассеяния в самых малых углах. В данном случае возможно образование агрегатов или больших олигомеров, что особенно заметно при увеличении концентрации белка в растворе.

Для белка Dps при добавлении и повышении концентрации MgCl₂ и KCl его связывание c ДНК нарушается [12], в то время как для белка IHF это может оказывать существенно другое влияние, что сказывается на его конформации и олигомеризации в растворе, т.е., возможно, этот белок меняет способ связывания с ДНК. Таким образом, в поздней стационарной фазе роста бактерий в зависимости от условий среды обитания предположительно происходят реакции дифференцирования и отбора между Dps и IHF для наиболее предпочтительного связывания с ДНК и организации бактериального нуклеоида в нужной архитектуре в ответ на различные стрессовые состояния.

Структурное моделирование белка IHF. Согласно полученным результатам первичного анализа в образцах присутствуют олигомеры белка IHF, причем в растворах, где отсутствуют Mg²⁺ и K⁺, олигомеризация выражена ярче, и возможно образование олигомеров разных порядков.

Для оценки степени олигомеризации IHF в растворе было проведено структурное моделирование по данным МУРР. С помощью программы HEMIX получены структуры белка IHF для каждого из образцов, где смоделированы различные олигомеры, состоящие из исходных димеров.

Модели, построенные HEMIX для образцов в буфере I, т.е. в отсутствие катионов металлов (рис. 2в–2ж), демонстрируют процесс олигомеризации IHF в растворе. О хорошем качестве и надежности моделирования свидетельствуют значения  = 1.4 и 1.5 между экспериментальной и расчетной кривой для образцов с концентрациями 4.8 и 10 мг/мл соответственно. Наблюдается выраженная концентрационная зависимость, которая проявляется в образовании крупных олигомеров при увеличении концентрации белка в растворе, что подтверждает полученные при первичном анализе данных МУРР результаты, причем образуются олигомеры разных порядков.

Для количественной оценки объемных долей каждого компонента в растворе использовали программу OLIGOMER, где наилучшее совпадение с экспериментальными данными (рис. 2а, 2б) дала равновесная смесь гексамеров и димеров для образца с концентрацией 4.8 мг/мл, додекамеров, тетрамеров и димеров для образца с концентрацией 10 мг/мл. Результаты анализа с помощью программы OLIGOMER наглядно представлены в виде гистограмм (рис. 2д, 2з). Однако важно учесть, что полученные объемные доли тетрамеров и гексамеров больше, чем их числовые доли в смеси. По сравнению с димером числовые доли снижаются в 2 и 3 раза для тетрамера и гексамера соответственно. Таким образом, в числовом выражении присутствие высоких олигомеров достаточно ограничено. Молекулярные массы, усредненные по всем компонентам, оказались равны 39.6 и 65.3 кДа для образца с концентрацией 4.8 и 10 мг/мл соответственно, что хорошо согласуется с массами, полученными в результате анализа полной кривой рассеяния (табл. 2).

Следующим этапом работы было определение структуры белка IHF в присутствии ионов магния и калия в растворе. Так как концентрационной зависимости в интервале концентраций 4.8–10 мг/мл в данном растворе не наблюдалось, для дальнейшего структурного моделирования использовали кривую при концентрации 10 мг/мл как наиболее информативную согласно формализму Шеннона. Модели, построенные с помощью программы HEMIX, представлены на рис. 3б–3г.  Таким образом, с помощью компьютерного моделирования продемонстрировано, что белок IHF в присутствии ионов магния и калия также образует олигомеры в растворе, что подтверждает полученные при первичном анализе результаты. Однако в данном случае степень олигомеризации ниже, чем в буфере I. Наилучшее приближение к экспериментальным данным (рис. 3а) дала смесь гексамеров, тетрамеров и димеров (рис. 3б–3г).

 

Рис. 3. Приближение экспериментальных данных МУРР равновесными смесями от IHF в буфере II: a – при концентрации 10 мг/мл, 1 – экспериментальные данные, 2 – расчетная кривая рассеяния, полученная в программе OLIGOMER от смеси димеров, тетрамеров и гексамеров, полученных в HEMIX (χ2 = 1.7); б – модель гексамера IHF, в – модель тетрамера IHF, г – модель димера IHF; д – гистограмма объемных и числовых долей олигомеров в равновесной смеси

 

Количественная оценка результата представлена на гистограмме (рис. 3д). Из анализа следует, что в растворе с ионами металлов присутствуют преимущественно димеры белка IHF с небольшим количеством образовавшихся тетрамеров и гексамеров. Молекулярная масса, усредненная по всем компонентам, составляет 27 кДа, что согласуется с массой, рассчитанной по полной кривой рассеяния с помощью инварианта Порода.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью МУРР изучены особенности процессов олигомеризации геном-ассоциированного белка IHF в различных условиях. Получены кривые МУРР от растворов белка в присутствии одно- и двухзарядных металлических катионов и без них. Анализ полученных кривых и структурное моделирование позволили сделать два важных вывода: во-первых, наличие катионов Mg²⁺ и K⁺ заметно тормозит формирование крупных олигомеров, во-вторых, олигомеризация IHF всегда идет по пути образования длинных белковых цепочек, а не, например, компактных глобулярных или клубковых структур. Последнее важно с точки зрения формирования структур-предшественников в процессе возникновения устойчивого кристаллического комплекса Dps–ДНК, ответственного за бактериальную резистентность к неблагоприятным внешним условиям. Цепочки IHF, стягивая отдельные молекулы ДНК, способствуют их параллельной укладке, и в дальнейшем при продолжении стрессовых воздействий и лавинообразном продуцировании бактерией белка Dps происходит замена IHF на Dps, что приводит к защитной кристаллизации бактериального генома. Здесь важно отметить, что этот процесс, как показало данное исследование, можно лимитировать введением катионов Mg²⁺ и K⁺. Полученные данные будут полезны для исследования поведения и взаимодействия нуклеоид-ассоциированных белков в живых бактериальных клетках, что поможет приблизиться к решению проблемы устойчивости бактерий к лекарственным препаратам.

Авторы выражают благодарность Г. Петерсу за проведение экспериментов по МУРР.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант № 18-74-10071) в части получения образцов и их первичной характеризации, в рамках выполнения работ государственного задания НИЦ «Курчатовский институт» в части моделирования структуры белка.

About the authors

A. M. Gordienko

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics of NRC “Kurchatov Institute”

Author for correspondence.
Email: alex.gor99@mail.ru
Russian Federation, Moscow

L. A. Dadinova

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics of NRC “Kurchatov Institute”

Email: alex.gor99@mail.ru
Russian Federation, Moscow

M. V. Petoukhov

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics of NRC “Kurchatov Institute”; Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: alex.gor99@mail.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

A. A. Mozhaev

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics of NRC “Kurchatov Institute”; Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: alex.gor99@mail.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

V. A. Manuvera

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency; Moscow Institute of Physics and Technology

Email: alex.gor99@mail.ru
Russian Federation, Moscow; Dolgoprudny

V. N. Lazarev

Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency; Moscow Institute of Physics and Technology

Email: alex.gor99@mail.ru
Russian Federation, Moscow; Dolgoprudny

E. V. Shtykova

Shubnikov Institute of Crystallography of Kurchatov Complex of Crystallography and Photonics of NRC “Kurchatov Institute”

Email: alex.gor99@mail.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files