Effect of stabilizer concentration on parameters of poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles produced by nanoprecipitation

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Разработка систем адресной доставки биологически активных веществ (БАВ) является актуальной биомедицинской задачей. В качестве потенциальных носителей активных агентов исследуют различные коллоидные объекты [1–4], в том числе микро- и наноразмерные частицы на основе биоразлагаемых полимеров поли(лактида), поли(капролактона) (ПКЛ), поли(лактида-со-гликолида) (ПЛГА) и др. [5, 6].

В рамках адресной доставки различных лекарственных агентов, в том числе противоопухолевых, ПЛГА частицы могут выступать как в качестве самостоятельных носителей [7–9], так и в качестве компонентов композитных систем «гидрогель-наночастицы» [10, 11]. Для получения частиц на основе ПЛГА сополимеров используют такие методы, как нанопреципитация [12–14], эмульгирование [12, 15], микрофлюидная технология [16] и пр. Нанопреципитация является одним из наиболее часто используемых способов формирования ПЛГА частиц благодаря своей простоте, низкой стоимости и масштабируемости. Кроме того, нанопреципитация позволяет получать наноразмерные ПЛГА частицы с малым индексом полидисперсности по размерам и воспроизводимыми характеристиками. Физико-химические свойства ПЛГА частиц, получаемых методом нанопреципитации, зависят как от состава и молекулярно-массовых характеристик исходного сополимера, так и от условий получения, таких как концентрация сополимера в органической фазе, концентрация стабилизатора в водной фазе, объемное соотношение фаз, присутствие различных добавок и пр. Поскольку ПЛГА частицы рассматриваются как перспективные носители для доставки различных БАВ, крайне важно уметь направленно регулировать такие их параметры, как размер, содержание загруженного активного агента и скорость его высвобождения, способность к лиофилизации и последующему ре-диспергированию и др. Так, увеличение концентрации сополимера в органическом растворителе, как правило, приводит не только к росту размера ПЛГА частиц, но и к увеличению содержания загруженного в частицы агента [12, 14, 17, 18]. В свою очередь, данные по зависимости параметров ПЛГА частиц от концентрации стабилизатора, используемого на этапе их получения, носят неоднозначный характер.

Так, в работе [12] методом нанопреципитации авторы получали частицы на основе сополимеров ПЛГА с одинаковым мольным соотношением D, L-лактидных (ЛА) и гликолидных (ГК) звеньев, равным 50/50, но различной средневесовой молекулярной массой (M_w), равной 17000 и 153000 г/моль. Органическая фаза представляла собой раствор ПЛГА в ацетоне (С_{ПЛГА/ацетон} = 10 мг/мл), водная фаза – раствор стабилизатора поли(винилового спирта) (ПВС) (86–89% гидролизованного низкомолекулярного) в воде с концентрацией С_{ПВС/вода}, равной 1, 3 или 5%. Обнаружено, что увеличение концентрации ПВС приводит к линейному росту гидродинамического диаметра (D_h) частиц на основе ПЛГА сополимеров. Так, значение D_h ПЛГА (M_w = 17 000 г/моль) частиц возрастает от 154.5 ± 0.76 до 174.0 ± 0.33 нм при изменении содержания ПВС от 1 до 5%. В свою очередь, величина индекса полидисперсности (ИП) частиц на основе сополимеров ПЛГА с M_w = 17 000 и 153 000 г/моль не зависит от концентрации стабилизатора и составляет 0.05 и 0.07 соответственно. Аналогичный эффект наблюдали Badri и др. для стабилизированных ПВС (M_w = 31000 г/моль) ПКЛ (M_w = 14 000 г/моль) частиц, полученных нанопреципитацией из ацетона [19]. Увеличение концентрации ПВС от 2.5 до 20 мг/мл (при постоянной концентрации органической фазы С_{ПКЛ/ацетон} = 8 мг/мл) приводит к росту D_h ПКЛ частиц от 169 до 283 нм, что может быть связано с возрастанием количества ПВС, адсорбированного на поверхности ядра частиц. Данных о влиянии концентрации стабилизатора на ИП частиц авторы не приводят.

В работе [17] методом нанопреципитации получали ненагруженные и нагруженные кетопрофеном ПЛГА (соотношение ЛА/ГК звеньев = 50/50, M_w = 30 000–50 000 г/моль) частицы, стабилизированные Pluronic F127 (M_w = 12 600 г/моль) или Tween20 (M_w = 1228 г/моль). Показано, что при постоянной концентрации сополимера в органической фазе (C_{ПЛГА/ацетон} = 5 мг/мл) увеличение концентрации как Pluronic F127, так и Tween20 в водной фазе от 0 до 1 мг/мл практически не влияет на величину D_h ПЛГА частиц, которая составляет ~ 110–120 нм. Данные по влиянию концентрации стабилизатора на содержание загруженного в ПЛГА частицы лекарственного агента не приведены, однако авторы установили, что содержание кетопрофена в частицах и скорость его высвобождения зависят от типа используемого стабилизатора. Так, при одинаковых условиях получения (С_{ПЛГА/ацетон} = 10 мг/мл, С_{стабилизатор/вода} = 0.1 мг/мл, С_{кетопрофен} = 10 мг/мл, объемное соотношение органической и водной фаз – 1 : 10) содержание кетопрофена в Pluronic F127- и Tween20-стабилизированных ПЛГА частицах составляет 26.9 ± 2.0 и 38.2 ± 2.8% соответственно. Кроме того, высвобождение лекарственного агента из ПЛГА частиц, стабилизированных Tween20, происходит медленнее по сравнению с высвобождением из ПЛГА частиц, стабилизированных Pluronic F127, что авторы объясняют меньшей молекулярной массой Tween20 и, соответственно, формированием более плотного и компактного слоя поверхностно-активного вещества (ПАВ) на поверхности ПЛГА ядра.

В работе [18] исследовали влияние нескольких независимых параметров нанопреципитации, а именно концентрации сополимера и лекарственного агента в ацетоне, а также концентрации стабилизатора Tween80 в воде на характеристики ПЛГА (соотношение ЛА/ГК звеньев = 50/50, M_w = 34000 г/моль) частиц для оптимизации процесса получения на их основе наносомальной формы ликохалкона А. Так, при варьировании концентрации Tween80 от 0.46 до 1.14% авторы установили, что при высокой концентрации ПАВ ПЛГА частицы характеризуются меньшим средним значением D_h. Кроме того, увеличение содержания Tween80 приводит к снижению ИП получаемых частиц. Однако с ростом концентрации стабилизатора авторы наблюдали снижение эффективности загрузки ликохалкона А в ПЛГА частицы: при С_{Tween80/вода}, равной 0.464 и 1.136%, эффективность загрузки активного агента в частицы составляет 45.46 и 8.65% соответственно, поэтому оптимальная концентрация стабилизатора Tween80 для получения наносомальной формы ликохалкона А составила 0.4%. Аналогичные зависимости наблюдали в работе [20] для полученных нанопреципитацией из ацетона в присутствии стабилизатора ПВС ПЭГилированных ПЛГА частиц, нагруженных дексибупрофеном. Shah и др. также обнаружили, что увеличение концентрации стабилизатора приводит к снижению размера частиц на основе ПЛГА (соотношение ЛА/ГК звеньев = 50/50) [21]. Показано, что рост концентрации Pluronic F-68 от 0.5 до 1.5% (при постоянной концентрации органической фазы С_{ПЛГА/ацетон} = 20 мг/мл) приводит к уменьшению D_h ПЛГА частиц, загруженных фелодипином, от 160.5 ± 1.52 до 149.7 ± 3.39 нм. Авторы полагают, что малой концентрации Pluronic F-68 недостаточно для покрытия поверхности ПЛГА ядер частиц и их эффективной стабилизации, что приводит к большему размеру частиц при низкой концентрации стабилизатора. Однако эффективность загрузки фелодипина в ПЛГА частицы, напротив, увеличивается с ростом концентрации Pluronic F-68 и составляет 67.26 ± 1.85 и 74.41 ± 1.96% для С_{Pluronic F-68/вода} = 0.5 и 1.5% соответственно.

Таким образом, целью данного исследования является установление влияния концентрации стабилизатора ПВС на параметры получаемых нанопреципитацией частиц на основе ПЛГА сополимеров близкого молекулярного состава, но с различной молекулярной массой M_w = 19 000 и 97 000 г/моль, синтезированных с использованием субсалицилата висмута и 2-этилгексаноата олова (II) соответственно. В работе также получены частицы на основе ПЛГА сополимера (мольное соотношение ЛА/ГК звеньев = 75/25, M_w = 19 000 г/моль), нагруженные модельным противоопухолевым агентом доцетакселом, и изучено влияние концентрации ПВС на эффективность загрузки активного агента в частицы, их цитотоксическую активность in vitro, а также способность к лиофилизации и ре-диспергированию.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

D,L-лактид (ЛА) и гликолид (ГК) (“Corbion”, Нидерланды) предварительно очищали перекристаллизацией из этилацетата. 2-этилгексаноат олова (II) (Sn(Oct)₂) (“Sigma Aldrich”, США), субсалицилат висмута (BiSS) (“Sigma Aldrich”, США), поли(виниловый) спирт (ПВС) (“Sigma Aldrich”, США) со средневесовой молекулярной массой M_w = 30 000––70 000 г/моль (гидролизованный 87%) (“Sigma Aldrich”, США), D(–)-маннитол (“Honeywell Burdick & Jackson”, США), доцетаксел безводный (ДОЦ) (“Xi’an Taicheng Chem Co., LTD”, Китай) использовали без дополнительной очистки. Все используемые в работе органические растворители класса ОСЧ (“Химреактив”, Россия) дополнительно не очищали. Для приготовления водных растворов использовали дважды дистиллированную воду, полученную на установке Millipore Milli-Q (“Merk KGaA”, Германия).

Синтез и характеризация сополимеров на основе D,L-лактида и гликолида

Полимеризацию с раскрытием цикла ЛА в присутствии ГК проводили по модифицированной методике Kricheldorf и др. [22] с использованием Sn(Oct)₂ или BiSS в качестве катализатора. Кратко, предварительно взвешенные навески ЛА и ГК загружали в коническую круглодонную колбу, затем к реакционной смеси добавляли необходимое количество катализатора и активатора (этиленгликоля). Синтез проводили в расплаве при 180^оC при постоянном перемешивании в атмосфере аргона. Синтезированные сополимеры поли(D,L-лактида-со-гликолида) (ПЛГА) растворяли в тетрагидрофуране (ТГФ) и переосаждали в холодный н-гексан, далее высушивали в вакуумном шкафу при 120^оC до постоянного веса для удаления остатков растворителя.

Степень конверсии ЛА (α_ЛА) и состав полученных сополимеров ПЛГА (мольное соотношение ЛА/ГК звеньев) рассчитывали по данным ¹Н ядерно-магнитного резонанса (¹H ЯМР). Средневесовую (M_w) и среднечисловую (M_n) молекулярные массы, дисперсность (Đ) образцов определяли методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ).

Условия синтеза сополимеров ПЛГА, полученных с использованием Sn(Oct)₂ и BiSS (шифры образцов ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi соответственно), а также их молекулярно-массовые характеристики приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Условия синтеза (температура T, время реакции τ, концентрация катализатора С_кат) ПЛГА сополимеров и их молекулярно-массовые характеристики

Шифр образца	T, oC	τ, ч	Cкат, ppm	1αЛА, %	1ЛА/ГК, мол. %	2Mw, г/моль	2Mn, г/моль	2Đ
ПЛГА-Sn	180	2	500	98	71:29	97000	46000	2.3
ПЛГА-Bi	180	1	1000	96	74:26	19000	9000	2.2

¹ Определено методом ¹H ЯМР^{. 2}Определено методом ГПХ.

 

Получение ПЛГА наночастиц

Водные дисперсии ПЛГА наночастиц, стабилизированных ПВС, получали нанопреципитацией. Навеску сополимера массой 50 мг растворяли в 10 мл ацетона (С_{ПЛГА/ацетон} = 5 мг/мл), затем полученный раствор добавляли по каплям к 10 мл водного раствора стабилизатора ПВС с концентрацией 2.5, 5, 10 или 15 мг/мл. Органический растворитель испаряли при комнатной температуре в течение 4 ч при постоянном перемешивании (700 об/мин). Полученные водные дисперсии центрифугировали (40000g, 30 мин) с использованием ультрацентрифуги Optima MAX–XP (“Beckman Coulter”, США) для удаления остаточного ацетона и несвязанного стабилизатора. Осажденные ПЛГА наночастицы ре-диспергировали в 8 мл дважды дистиллированной воды. Процедуру очистки повторяли дважды. Очищенные водные дисперсии ПВС-стабилизированных ПЛГА наночастиц хранили в закрытых стеклянных виалах при +4^оC.

Для приготовления водных дисперсий ПЛГА наночастиц, нагруженных модельным гидрофобным лекарственным агентом, навеску ДОЦ массой 5 мг предварительно растворяли в 10 мл ацетона. Затем 100 мг ПЛГА (M_w = 19 000 г/моль) растворяли в 10 мл раствора ДОЦ в ацетоне (С_{ПЛГА/ацетон} = 10 мг/мл), органическую фазу добавляли по каплям к 10 мл водного раствора ПВС с концентрацией 1, 5, 10 или 15 мг/мл. Далее ДОЦ-нагруженные ПЛГА частицы получали согласно описанной выше методике. Водные дисперсии ПВС-стабилизированных ПЛГА частиц, содержащих ДОЦ, сразу после получения лиофилизировали в присутствии криопротектора D(–)-маннитола (для предотвращения преждевременного высвобождения загруженного в частицы лекарственного агента). Лиофильно высушенные образцы хранили в закрытых пластиковых эпендорфах при +4^оC.

Нестабилизированные ПЛГА наночастицы также получали нанопреципитацией. Для этого 50 мг сополимера растворяли в 10 мл ацетона (С_{ПЛГА/ацетон} = 5 мг/мл), затем полученный раствор добавляли по каплям к 10 мл дважды дистиллированной воды. Органический растворитель испаряли при комнатной температуре в течение 4 ч при постоянном перемешивании (700 об./мин). Полученные водные дисперсии нестабилизированных ПЛГА наночастиц хранили в закрытых стеклянных виалах при +4^оC.

Характеризация ПЛГА наночастиц. Динамическое рассеяние света (ДРС)

Распределения гидродинамических диаметров (D_h) ПЛГА наночастиц в водных дисперсиях получали с использованием анализатора “Zetasizer Nano ZSP” (“Malvern Instruments Ltd.”, Великобритания). Анализатор оснащен He-Ne лазером с длиной волны 632.8 нм и фотодетектором, расположенным под углом 173^о. Водные дисперсии наночастиц (1 мл) помещали в пластиковую кювету с длиной оптического пути 1 см. Измерения проводили при 25^оC, каждое измерение повторяли трижды. Распределения D_h ПЛГА наночастиц в дисперсиях были рассчитаны из автокорреляционных функций программного обеспечения “Zetasizer Software”.

Электрофоретическое рассеяние света

Распределения электрофоретической подвижности ПЛГА наночастиц в водных дисперсиях получали с использованием анализатора “Zetasizer Nano ZSP” (“Malvern Instruments Ltd.”, Великобритания). Водные дисперсии наночастиц (0.8 мл) помещали в U-образную капиллярную кювету. Измерения проводили при 25^оC, каждое измерение повторяли трижды. Распределения величин электрокинетического потенциала (ζ-потенциала) ПЛГА наночастиц в дисперсиях были рассчитаны с помощью уравнения Генри в приближении Смолуховского с использованием программного обеспечения “Zetasizer Software”.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Содержание модельного лекарственного агента ДОЦ в ПЛГА наночастицах определяли с помощью хроматографической системы Agilent HPLC1200 (“Agilent”, США), оснащенной спектрофотометрическим детектором. Обращенно-фазовое градиентное разделение осуществляли с использованием колонки PerfectSil 300 ODS C18 (250×4.6 мм, 5 μМ) (“MZ-Analysentechnik GmbH”, Германия) при 40^оC. Объем вводимого образца составлял 25 мкл. В качестве компонентов подвижной фазы использовали воду (А) и ацетонитрил (Б). Скорость потока составляла 1.2 мл/мин. Для осуществления градиентного режима элюирования объемное содержание подвижной фазы Б равномерно увеличивалось от 28% (9 мин) до 72% (38 мин) и далее уменьшалось до 28% (50 мин). Длина волны регистрации сигнала ДОЦ составляла 232 нм, время удерживания ДОЦ – 27.3 мин.

Исследование цитотоксического эффекта ПЛГА наночастиц in vitro

Цитотоксическую активность чистого ДОЦ, ненагруженных и ДОЦ-нагруженных ПЛГА-Bi наночастиц определяли с использованием MTT-теста [23]. Клетки карциномы толстой кишки мыши линии CT26 и фибробластов легкого эмбриона человека линии WI-38 культивировали в стандартной среде DMEM (“Gibco”, Великобритания), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (“HyClone”, США) и 50 мкг/мл гентамицина (“Gibko”, Великобритания), в СО₂-инкубаторе при 37^оC в увлажненной атмосфере с 5% СО₂. Для определения цитотоксичности клетки высевали в 96-луночные планшеты (“Corning”, США) по 5×10³ клеток в 100 мкл культуральной среды и инкубировали в течение 24 ч. Исходный раствор чистого ДОЦ готовили в концентрации 10 ммоль/л в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при –20^оC, избегая повторных циклов замораживания/размораживания. В день эксперимента готовили серийное разведение исходного раствора ДОЦ в полной питательной среде и добавляли полученные растворы к культурам клеток в диапазоне концентраций от 0.3 до 200 нмоль/л (максимальное содержание ДМСО составляло 0.002%). ПЛГА-Bi частицы суспендировали в культуральной среде и также добавляли к культурам клеток в диапазоне вышеуказанных концентраций (в пересчете на ДОЦ). Далее клетки инкубировали в стандартных условиях в течение 72 ч, затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (МТТ) (“Sigma Aldrich”, Германия) в концентрации 200 мкг/мл в культуральной среде и инкубировали в течение 3 ч при 37^оC для образования формазана. Среду удаляли, добавляли 100 мкл ДМСО и перемешивали. После полного растворения кристаллов формазана измеряли оптическую плотность содержимого лунок с помощью многоканального спектрофотометра (“Bio-Rad”, США) при длине волны λ = 570 нм. Данные представляли в виде оптической плотности экспериментальных образцов относительно контроля. По полученным данным строили графики зависимости количества клеток от концентрации ДОЦ. По кривым выживаемости определяли значения IC₅₀ (концентрацию вещества, ингибирующую рост клеток на 50%).

Лиофилизация и ре-диспергирование ПЛГА наночастиц

Лиофилизацию водных дисперсий ПЛГА наночастиц, нагруженных модельным лекарственным агентом ДОЦ, проводили с использованием D(–)-маннитола в качестве криопротектора. D(–)-маннитол (100 мг) предварительно растворяли в 10 мл дважды дистиллированной воды, далее 1 мл полученного раствора добавляли к 1 мл водной дисперсии ПЛГА наночастиц, после чего растворы замораживали при –18^оC. Замороженные образцы лиофильно высушивали с использованием системы лиофильной сушки Alpha 2–4 LSC (“Martin Christ”, Германия) в течение 48 ч при –72^оC и давлении 0.001 мбар. Полученные лиофилизаты ПЛГА наночастиц ре-диспергировали в 2 мл дважды дистиллированной воды простым перемешиванием (взбалтыванием) в течение 1–2 мин при комнатной температуре.

Статистический анализ экспериментальных результатов

Все экспериментальные данные представлены как среднее значение трех измерений со стандартным отклонением.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использование стабилизирующего агента на этапе получения ПЛГА наночастиц необходимо для обеспечения их стабильности в дисперсии в течение длительного времени и при изменении внешних условий (температуры, pH, ионной силы) [14]. Рассмотрим, как концентрация стабилизатора ПВС в водной фазе влияет на величины D_h, ИП и ζ-потенциала ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi наночастиц.

Влияние концентрации стабилизатора ПВС на параметры ПЛГА наночастиц

Зависимости значений D_h ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц от концентрации ПВС в водной фазе приведены на рис. 1а и 1б соответственно. По данным ДРС ПВС-стабилизированные частицы характеризуются большим размером по сравнению с ПЛГА частицами, полученными в отсутствии стабилизатора (величины D_h для нестабилизированных ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц составляют 125 ± 1 и 95 ± 1 нм соответственно), что может свидетельствовать об успешной адсорбции молекул ПВС на поверхность ПЛГА частиц [24, 25]. Разница в значениях D_h нестабилизированных ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц может быть связана с различной молекулярной массой используемых сополимеров (табл. 1) [26]. С увеличением молекулярной массы полимера возрастает вязкость органической фазы и, соответственно, снижается скорость диффузии полимерных цепей в водную фазу. Чем меньше скорость диффузии полимерных макромолекул, тем больше их приходится на единицу объема органического растворителя, что приводит к их агрегации и формированию полимерных частиц большего размера [27]. Отметим, что для ПВС-стабилизированных ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц существенной разницы в размерах в зависимости от молекулярной массы исходного сополимера не наблюдается (рис. 1).

 

Рис. 1. Зависимости величин гидродинамического диаметра (D_h, нм) и индекса полидисперсности (ИП) (а) ПЛГА-Sn и (б) ПЛГА-Bi наночастиц от концентрации стабилизатора ПВС в водной фазе (С_{ПВС/вода}, мг/мл).

 

Обнаружено, что при варьировании С_{ПВС/вода} от 2.5 до 5 мг/мл (концентрация органической фазы оставалась постоянной С_{ПЛГА/ацетон} = 5 мг/мл) величина D_h частиц уменьшается, тогда как дальнейшее увеличение содержания стабилизатора в системе до 15 мг/мл практически не влияет на размер ПЛГА частиц обоих типов (рис. 1). Как отмечалось в работах [18, 21], малой концентрации стабилизатора может быть недостаточно для эффективной стабилизации ПЛГА ядер, вследствие чего происходит образование частиц большего размера. Отметим, что распределения интенсивности рассеяния света по величинам D_h ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц независимо от С_{ПВС/вода} носят мономодальный характер (данные не приведены).

Наибольшие значения ИП обнаружены для ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц, полученных при С_{ПВС/вода} =2.5 и 5 мг/мл соответственно, увеличение С_{ПВС/вода} до 15 мг/мл приводит к снижению ИП частиц (рис. 1). Аналогичную зависимость наблюдали в работе [18]. Как видно из рис. 1, величина ИП для обоих типов частиц независимо от С_{ПВС/вода} не превышает 0.3, то есть все полученные частицы могут выступать в качестве потенциальных носителей лекарственных средств.

По данным электрофоретического рассеяния света ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi наночастицы характеризуются отрицательными величинами ζ-потенциала независимо от С_{ПВС/вода} (рис. 2), что может быть объяснено присутствием на поверхности ПЛГА ядер карбоксильных групп, способных к диссоциации. Увеличение содержания ПВС в системе приводит к нелинейному уменьшению абсолютной величины ζ-потенциала частиц обоих типов (рис. 2), что, по-видимому, связано с более эффективным экранированием карбоксильных групп на поверхности ПЛГА ядер за счет адсорбции большего количества ПВС [28].

 

Рис. 2. Зависимости величин электрокинетического потенциала (ζ, мВ) ПЛГА наночастиц от концентрации стабилизатора ПВС в водной фазе (С_{ПВС/вода}, мг/мл).

 

Отметим, что при данных условиях нанопреципитации формирование ПЛГА частиц происходит по механизму “нуклеации и агрегации”, согласно которому в результате локального перенасыщения происходит спонтанная нуклеация ПЛГА цепей в “зародыши” частиц, причем число “зародышей” настолько велико, что они сталкиваются друг с другом и коалесцируют, образуя частицы финального размера [14, 29]. Стадия агрегации “зародышей” может лимитироваться электростатическим отталкиванием между ними или присутствием в системе молекул стабилизатора, которые увеличивают вязкость водной фазы и, соответственно, снижают скорость диффузии частиц. В случае если рост частиц лимитируется адсорбцией молекул стабилизатора, то финальный размер частиц будет зависеть от концентрации водной фазы [12, 19, 30]. Однако в ряде работ было показано, что концентрация стабилизатора в водной фазе практически не оказывает влияния на размер ПЛГА частиц [14, 17]. Мы полагаем, что несогласованность литературных данных о влиянии концентрации стабилизатора на размер ПЛГА частиц может быть связана с тем, что водные дисперсии частиц, как правило, исследуют методом ДРС не сразу после получения, а после многократных стадий очистки. Поэтому в данной работе водные дисперсии ПВС-стабилизированных ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц дополнительно исследовали перед двукратным центрифугированием (очисткой).

Как видно из рис. 3а и 3б, величины D_h ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi наночастиц в водных дисперсиях сразу после получения практически не зависят от С_{ПВС/вода}, что согласуется с зависимостями, обнаруженными в работах [14, 17]. По-видимому, финальный размер частиц определяется концентрацией органической фазы (С_{ПЛГА/ацетон} = 5 мг/мл во всех случаях) и лимитируется электростатическим отталкиванием между “зародышами” частиц. Однако С_{ПВС/вода} влияет на стабильность ПЛГА частиц в процессе центрифугирования и их способность к ре-диспергированию в воде. Так, малого количества стабилизатора в системе (С_{ПВС/вода} = 2.5 мг/мл, С_{ПЛГА/ацетон} = = 5 мг/мл) оказывается недостаточно для эффективной стабилизации ПЛГА частиц, что приводит к их коалесценции и укрупнению в процессе очистки (рис. 3а и 3б).

 

Рис. 3. Зависимости величин среднего гидродинамического диаметра (D_h, нм) (а, б), индекса полидисперсности (ИП) (в, г) и электрокинетического потенциала (ζ, мВ) (д, е) ПЛГА-Sn (левый столбец) и ПЛГА-Bi (правый столбец) наночастиц от концентрации стабилизатора ПВС в водной фазе (С_{ПВС/вода}, мг/мл) сразу после получения и после двукратной очистки.

 

Зависимости величин ИП свежеприготовленных и дважды центрифугированных ПЛГА частиц обоих типов от С_{ПВС/вода}, в целом, имеют схожий вид (рис. 3в и 3г). Свежеприготовленные ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частицы обладают наибольшим значением ИП, равным 0.20 ± 0.03 и 0.17 ± 0.01 при С_{ПВС/вода} = 5 и 2.5 мг/мл соответственно. Увеличение С_{ПВС/вода} приводит к снижению ИП свежеприготовленных частиц. Отметим, что величины ИП свежеприготовленных частиц, как правило, не превышают или сопоставимы (в рамках экспериментальной погрешности) с соответствующими величинами для центрифугированных частиц (рис. 3в и 3г).

Абсолютные значения ζ-потенциала свежеприготовленных ПЛГА частиц обоих типов оказались меньше соответствующих значений для центрифугированных частиц во всем диапазоне С_{ПВС/вода} (рис. 3д и 3е). Это может быть связано с тем, что часть физически адсорбированного на поверхности ПЛГА ядер ПВС “отрывается” в процессе центрифугирования, что приводит к менее эффективному экранированию способных к диссоциации карбоксильных групп и, соответственно, большим абсолютным величинам ζ-потенциала ПЛГА частиц после очистки. Например, в работе [31] авторы обнаружили, что увеличение скорости центрифугирования водных дисперсий ПЛГА частиц, стабилизированных диметиламинобензальдегидом (ДМАБ) (С_{ДМАБ/вода} = 0.25 масс./об.%) или ПВС (С_{ПВС/вода} =0.25 масс./об.%), приводит к росту абсолютного значения ζ-потенциала частиц обоих типов, что, по-видимому, связано с десорбцией большего количества молекул стабилизатора с поверхности ПЛГА ядер при более высоких скоростях центрифугирования.

Согласно полученным данным, величины D_h, ИП и ζ-потенциала имеют схожую зависимость от С_{ПВС/вода} для ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi частиц. Однако, принимая во внимание использование менее токсичного катализатора BiSS на этапе синтеза исходного сополимера, для получения и исследования частиц, нагруженных модельным лекарственным агентом ДОЦ, использовали сополимер ПЛГА-Bi.

Влияние концентрации стабилизатора ПВС на параметры ПЛГА-Bi частиц, нагруженных модельным лекарственным агентом

ДОЦ-содержащие ПЛГА-Bi наночастицы также получали нанопреципитацией: С_{ПЛГА/ацетон} и С_{ДОЦ/ацетон} оставались постоянными и составляли 10 и 0.5 мг/мл соответственно, С_{ПВС/вода} варьировали в диапазоне от 1 до 15 мг/мл. Загрузку ДОЦ в исследуемые частицы подтверждали с помощью ВЭЖХ. Водные дисперсии ПЛГА-Bi наночастиц, нагруженных ДОЦ, исследовали методом ДРС после двукратной отмывки от несвязанного стабилизатора (табл. 2).

 

Таблица 2. Гидродинамический диаметр (D_h, нм), индекс полидисперсности (ИП), электрокинетический потенциал (ζ, мВ) ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц, полученных при различной концентрации ПВС в водной фазе (С_{ПВС/вода}, мг/мл), и содержание в них модельного лекарственного агента ДОЦ (ω_ДОЦ, вес. %), определенное методом ВЭЖХ

СПВС/вода, мг/мл	Dh, нм	ИП	ζ, мВ	ωДОЦ, вес. %
1	219 ± 6	0.39 ± 0.02	–18 ± 1	4.30
5	163 ± 7	0.30 ± 0.02	–21 ± 6	4.08
10	153 ± 1	0.28 ± 0.05	–17 ± 3	4.05
15	159 ± 5	0.16 ± 0.01	–8 ± 1	4.51

 

Как и в случае ненагруженных частиц (рис. 1б), ДОЦ-содержащие ПЛГА-Bi частицы характеризуются наибольшим значением D_h при недостатке стабилизатора в системе (С_{ПВС/вода} = 1 мг/мл, С_{ПЛГА/ацетон} = 10 мг/мл) (табл. 2). Увеличение С_{ПВС/вода} до 5 мг/мл приводит к снижению величины D_h ДОЦ-нагруженных ПЛГА-Bi частиц, которая практически не меняется с дальнейшим ростом С_{ПВС/вода} вплоть до 15 мг/мл (табл. 2). Значения ИП и ζ-потенциала (по модулю) ПЛГА-Bi частиц, нагруженных ДОЦ, снижаются с увеличением С_{ПВС/вода} (табл. 2), что согласуется с данными для ненагруженных ПЛГА-Bi частиц (рис. 1б, рис. 2). Отметим, что загрузка ДОЦ в исследуемые частицы не приводила к изменению их физико-химических параметров (данные не приведены).

По данным ВЭЖХ содержание ДОЦ в ПЛГА-Bi наночастицах практически не зависит от С_{ПВС/вода} (табл. 2). По-видимому, ключевым фактором, влияющим на загрузку гидрофобного лекарственного агента в ПЛГА частицы, является концентрация органической фазы, определяющая размер гидрофобного ПЛГА ядра, которая в данном эксперименте оставалась постоянной (С_{ПЛГА/ацетон} = 10 мг/мл).

Одним из требований, предъявляемым к ПЛГА частицам – потенциальным носителям лекарственных средств, является их способность к лиофилизации и последующему ре-диспергированию в воде/солевом растворе/буфере до исходных размеров, поскольку при хранении ПЛГА частиц в виде дисперсии существует риск их гидролиза и, соответственно, преждевременного высвобождения загруженного лекарственного агента. Как правило, процедуру лиофилизации ПЛГА частиц проводят с применением различных крио-протекторов (спиртов, олигосахаридов и др.) [11]. В данной работе методом ДРС исследовали влияние С_{ПВС/вода} на способность ДОЦ-нагруженных ПЛГА-Bi наночастиц к лиофилизации и ре-диспергированию в воде как без добавления криопротектора, так и с добавлением D(–)-маннитола (рис. 4).

 

Рис. 4. Распределения интенсивности рассеяния света по гидродинамическим диаметрам (D_h, нм) ДОЦ-нагруженных ПЛГА-Bi частиц, полученных при концентрации стабилизатора ПВС в водной фазе, равной (а) 1, (б) 5, (в) 10 и (г) 15 мг/мл: 1 – в исходной дисперсии (до лиофилизации), 2 – после лиофилизации без криопротектора и последующего ре-диспергирования в воде, 3 – после лиофилизации в присутствии криопротектора D(–)-маннитола и последующего ре-диспергирования в воде.

 

Как видно из рис. 4а, ДОЦ-содержащие ПЛГА-Bi частицы, полученные при С_{ПВС/вода} = 1 мг/мл, после лиофильной сушки в отсутствие криопротектора не способны к ре-диспергированию в водной среде до исходных размеров: на ДРС-распределении наблюдается лишь фракция крупных микронных агрегатов, размер которых существенно превышает величину D_h наночастиц в исходной дисперсии. ДРС-распределения для ДОЦ-нагруженных ПЛГА-Bi частиц, полученных при С_{ПВС/вода} = 5, 10 и 15 мг/мл и ре-диспергированных в воде, носят бимодальный характер, причем с увеличением С_{ПВС/вода} возрастает интенсивность рассеяния света наноразмерной фракции, что свидетельствует об увеличении ее весового количества в дисперсии (рис. 4б–г). В свою очередь, введение в систему криопротектора D(–)-маннитола позволяет успешно лиофильно высушивать и ре-диспергировать до исходных размеров (ИП < 0.2) в водной среде ДОЦ-нагруженные ПЛГА-Bi частицы, полученные нанопреципитацией при избытке ПВС (С_{ПВС/вода} =15 мг/мл, С_{ПЛГА/ацетон} =10 мг/мл), при равном соотношении ПЛГА и ПВС (С_{ПВС/вода} = С_{ПЛГА/ацетон} = 10 мг/мл) и даже при недостатке стабилизатора (С_{ПВС/вода} = 5 мг/мл, С_{ПЛГА/ ацетон} = 10 мг/мл) (рис. 4).

Исследование цитотоксичности ПЛГА-Bi наночастиц in vitro

На первом этапе исследовали цитотоксическую активность как ненагруженных ПЛГА-Bi наночастиц, полученных без стабилизатора, так и ПВС-стабилизированных (С_{ПВС/вода} = 5 мг/мл) ПЛГА-Bi наночастиц в отношении клеточных линий карциномы толстой кишки мыши CT26 и фибробластов легкого эмбриона человека WI-38. Известно, что лекарственный агент ДОЦ не обладает избирательным эффектом, поэтому цитотоксическую активность исследуемых наночастиц оценивали в отношении как опухолевых (CT26), так и нормальных (WI-38) клеток. Кроме того, использование опухолевых клеток линии СТ26 позволит в дальнейшем проводить исследования in vivo на мышах.

Как видно из рис. 5, в случае ненагруженных ПЛГА-Bi частиц обоих типов выживаемость клеток линий CT26 и WI-38 составляет порядка 100%. В случае ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц их цитотоксический эффект в отношении обеих клеточных линий оказался меньше по сравнению с эффектом чистого ДОЦ в широком диапазоне исследуемых концентраций, что может быть связано с пролонгированным характером высвобождения препарата из ПЛГА частиц. Полученные по графикам выживаемости значения IC₅₀ приведены в табл. 3.

 

Рис. 5. Цитотоксический эффект на клеточных линиях (а) CT26 и (б) WI-38 для: 1 – свободного ДОЦ, 2 – ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц, полученных при С_{ПВС/вода} = 1 мг/мл, 3 – ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц, полученных при С_{ПВС/вода} =5 мг/мл, 4 – ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц, полученных при С_{ПВС/вода} = 10 мг/мл, 5 – ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц, полученных при С_{ПВС/вода} = 15 мг/мл, 6 – ненагруженных ПВС-стабилизированных ПЛГА-Bi наночастиц (C_{ПВС/вода} = 5 мг/мл), 7 – ненагруженных ПЛГА-Bi наночастиц, полученных без ПВС.

 

Таблица 3. Результаты оценки цитотоксичности свободного ДОЦ и ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц, полученных при различной концентрации ПВС (С_{ПВС/вода}, мг/мл), in vitro

Образец	Значение IC50, нмоль
	CT26	WI-38
Свободный ДОЦ	47.2 ± 4.1	25.9 ± 3.7
ДОЦ-содержащие ПЛГА-Bi
СПВС/вода, мг/мл	CT26	WI-38
1	203.1 ± 9.9	176.6 ± 5.7
5	203.1 ± 8.5	167.3 ± 7.4
10	176.6 ± 8.3	198.7 ± 3.5
15	167.0 ± 11.3	90.8 ± 5.4

 

Как видно из табл. 3, цитотоксичность ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц в отношении линии опухолевых клеток СТ26 слабо зависит от С_{ПВС/вода}. В случае линии нормальных клеток WI-38 концентрация стабилизатора, варьируемая от 1 до 10 мг/мл, также слабо влияет на величину IC₅₀ ДОЦ-нагруженных ПЛГА-Bi наночастиц, однако при С_{ПВС/вода} =15 мг/мл наблюдается практически двукратное снижение значения IC₅₀. Отметим, что цитотоксический эффект in vitro чистого ПВС зависит от его концентрации [32], поэтому для объяснения полученной в работе зависимости величины IC₅₀ ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц в отношении клеточной линии WI-38 от С_{ПВС/вода}, используемой на этапе приготовления частиц, необходимо определить количество ПВС, адсорбированного на ПЛГА частицах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе изучено влияние концентрации стабилизирующего агента ПВС на характеристики получаемых нанопреципитацией частиц на основе биоразлагаемых сополимеров ПЛГА-Sn (ЛА/ГК = 70/30 мол.%, M_w =97 000 г/моль) и ПЛГА-Bi (ЛА/ГК = 75/25 мол.%, M_w = 97 000 г/моль). Исследование свежеприготовленных водных дисперсий ПЛГА наночастиц, полученных при варьируемой С_{ПВС/вода} от 2.5 до 15 мг/мл (при постоянной С_{ПЛГА/ацетон} = 5 мг/мл), показало, что на этапе формирования ПЛГА частиц их финальный гидродинамический диаметр (D_h) практически не зависит от С_{ПВС/вода}. Однако при дальнейшем центрифугировании (с целью удаления несвязанного стабилизатора и остатков органического растворителя) водных дисперсий ПЛГА частиц, полученных при малой С_{ПВС/вода} = 2.5 мг/мл, происходит их коалесценция и укрупнение вследствие, по-видимому, недостатка стабилизатора и неэффективного экранирования поверхности ПЛГА ядер, тогда как при более высоких С_{ПВС/вода} величина D_h частиц при центрифугировании не меняется. Обнаружено, что содержание ПВС в водной фазе влияет на величины ИП и ζ-потенциала (по модулю) ПЛГА-Sn и ПЛГА-Bi наночастиц: увеличение С_{ПВС/вода} приводит к снижению значений ИП и ζ-потенциала исследуемых частиц как в свежеприготовленных, так и в очищенных дисперсиях. Установлено, что содержание модельного гидрофобного препарата ДОЦ в ПЛГА-Bi частицах практически не зависит от С_{ПВС/вода}. Показано, что С_{ПВС/вода} слабо влияет на цитотоксический эффект in vitro ДОЦ-содержащих ПЛГА-Bi наночастиц в отношении линии клеток карциномы толстой кишки мыши CT26 и фибробластов легкого эмбриона человека WI-38. Однако содержание ПВС в водной фазе оказывает существенное влияние на способность ДОЦ-нагруженных ПЛГА-Bi наночастиц к лио- филизации и ре-диспергированию в водной среде. Показано, что при данных условиях получения частицы, сформированные при С_{ПВС/вода} = 2.5 мг/мл, не ре-диспергируются до исходных размеров как в присутствии, так и в отсутствии криопротектора D(–)-маннитола в отличие от частиц, полученных при более высоких С_{ПВС/вода}.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа проведена в рамках выполнения государственного задания НИЦ «Курчатовский институт».

БЛАГОДАРНОСТИ

Коллектив авторов благодарит Ресурсные Центры «Оптика» и «Полимер» НИЦ «Курчатовский институт» за возможность проведения ДРС и ВЭЖХ экспериментов.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

E. V. Kuznetsova

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Author for correspondence.
Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128

A. E. Tyurnina

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128

E. A. Konshina

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128; Институтский пер., 9, Долгопрудный, 141701

A. A. Atamanova

Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, ул. Профсоюзная, 70, 117393

K. T. Kalinin

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128; ул. Профсоюзная, 70, 117393

S. V. Aleshin

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128

V. G. Shuvatova

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128

G. A. Posypanova

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128

S. N. Chvalun

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт»; Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН

Email: kuznetsova.kate992@gmail.com
Russian Federation, пл. Академика Курчатова, 1, Москва, 123128; ул. Профсоюзная, 70, 117393

References

Supplementary files