Процессы самоорганизации и гелеобразования в цистеин-серебряном растворе с участием хитозана и электролита

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Супрамолекулярная химия является быстро развивающимся направлением в науке. При этом особый интерес ученых привлекают супрамолекулярные гидрогели, структурными единицами которых являются низкомолекулярные вещества (аминокислоты, пептиды и др. – супрамономеры), поскольку гелеобразование в таких системах является результатом молекулярной самосборки, регулируемой слабыми нековалентными взаимодействиями, такими как водородные связи, металл-лиганд координация, гидрофобные, металлофильные, электростатические взаимодействия, взаимодействия Ван-дер-Ваальса и др. [1–4]. Супрамономеры в результате самосборки выстраиваются в волокна, которые из-за взаимного зацепления при определенной концентрации способны образовывать пространственную 3D-сетку, иммобилизующую молекулы растворителя. Такие материалы интересны не только процессами самосборки, ведущими к формированию гель-сетки, но и с точки зрения практического применения. Например, возможно конструировать стимул-чувствительные супрамолекулярные гели, проявляющие свойства биосовместимости и биодеградации [5–7]. Использование супрамолекулярных структур открывает новые возможности в получении наноматериалов в комбинации с хитозаном [8, 9].

Хитозан является линейным полисахаридом, имеющим в своем строении два структурных звена: D-глюкозамин и N-ацетил-D-глюкозамин, которые соединены β (1→4) гликозидной связью. Получение хитозана основано на деацетилировании хитина (химический аналог хитозана) в щелочной или кислой среде. Молекула ХЗ содержит одну –NH₂ группу и две –OH группы на каждый гликозидный остаток (рис. 1).

 

Рис. 1. Структурная формула хитозана.

 

Хитозан относится к перспективным природным полимерам, который проявляет антимикробную и антиоксидантную активность, свойства биодеградации, биосовместимости и мукоадгезивности [10]. Положительный заряд молекул данного биополимера способствует тому, что он может взаимодействовать с отрицательно заряженными функциональными группами белков, анионными полисахаридами и нуклеиновыми кислотами. При взаимодействии хитозана с ДНК в клетках патогенных микрорганизмов предотвращается синтез их молекул РНК. Кроме этого, хитозан может проявлять и анестезирующие свойства. В области воспаления обычно образуется избыток катионов водорода, обуславливающих боль. Хитозан за счет аминогрупп способен связывать протоны и тем самым оказывать обезболивающее действие [11, 12]. В настоящий момент ХЗ применяется при разработке различных лекарственных форм. Например, композиция на основе хитозана, фосфата кальция β-гидроксиапатита (β-TCP) и гидроксиапатита используется для регенерации клеток тканей человека [13]. Нанесение ХЗ на поверхность титановых костных имплантов придает им большую коррозийную устойчивость и улучшает остеоинтеграцию – процесс вживления титанового импланта в костную ткань [14], а гидрогели на основе модифицированного хитозана, например, N,N,N-триметилхитозана или N-сукцинилхитозана, применяются для заживления ран [15]. Следует отметить, что хитозан является pH-чувствительным полимером, изменяющим свою конформацию в зависимости от pH среды [16], что позволяет использовать его в качестве носителя для точечной адресной доставки лекарственных средств, например, к раковым клеткам, имеющим низкий pH [17]. Получение наночастиц хитозана и его производных с инкапсулированным внутри лекарственным веществом открывает новые возможности применения в медицине благодаря их способности проникать внутрь клетки [18]. Кроме того, хитозан может выступать в качестве стабилизатора наночастиц серебра [19]. Таким образом, добавление ХЗ в различные системы позволяет расширить область применения композиций на его основе в биомедицине.

В данной работе исследуется влияние хитозана на процесс гелеобразования в низкоконцентрированном цистеин-серебряном растворе, имеющим супрамолекулярную природу. ЦСР – гель-прекурсор – получают путем смешения водных растворов аминокислоты L-цистеин и нитрата серебра при условии избытка ионов серебра, молярное соотношение Ag⁺/Cys равняется 1.27, концентрация исходных компонентов составляет C_L-Cys – 3.00 мМ, C_AgNO3 – 3.75 мМ [20]. ЦСР относится к анион-чувствительным системам, гелеобразование в которых инициируется введением электролитов с различными анионами: SO₄^2–, SO₃^2–, Cl^–, WO₄^2–, MoO₄^2– [21]. Природа аниона (сульфаты, хлориды и др.) влияет на структурно-механические свойства (вязкость, устойчивость во времени) гидрогелей [22].

Экспериментальными и расчетными методами было установлено [21, 23], что ЦСР состоит из положительно заряженных кластеров меркаптида серебра, которые имеют структуру «ядро–оболочка». При этом внутренняя структура кластеров стабилизируется за счет сильно взаимодействующих атомов серы и серебра, а на поверхности сосредоточены функциональные группы NH₃⁺ и COO^–, малая часть SAg-групп присутствует на поверхности супрамономеров МС [21, 23]. Межмолекулярные взаимодействия между функциональными группами (NH₃⁺, COO^–) цвиттер-ионов меркаптида серебра разных кластеров способствует формированию фрагментов пространственной сетки [21].

Введение в цистеин-серебряный раствор хитозана представляет практический интерес, поскольку расширяется область потенциального применения ЦСР гидрогелей, а с научной точки зрения интересным является изучение процессов самосборки в системе на основе низкомолекулярных соединений под влиянием положительно заряженных макромолекул полисахарида. В работе [24] детально исследованы антибактериальные свойства ЦСР-ХЗ композиций с различным содержанием исходных компонентов и установлена их эффективность в подавлении роста тестовых культур. Синтезировать ЦСР-ХЗ и ЦСР-ХЗ-Na₂SO₄ гидрогели удалось только при использовании низкомолекулярного водорастворимого полисахарида (М = 30 кДа) и электролита с сульфат-анионом, с хлорид-анионом в ЦСР-ХЗ системах происходила коагуляция [25]. Однако возник новый вопрос: каково влияние катиона электролита на структурно-механические свойства ЦСР-ХЗ-SO₄^2– гидрогелей. В данной работе в качестве инициатора гелеобразования использовали сульфат меди, поскольку ионы Cu(II), обладая комплексообразующими свойствами, способствуют синтезу наиболее прочных гелей на основе ЦСР не только с сульфат- [26], но и хлорид-анионами [27]. Таким образом, целью работы является изучение процессов самосборки и гелеобразования в цистеин-серебряном растворе – гель-прекурсоре – под влиянием поликатиона хитозана и сульфата меди.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использованы реактивы: серебро азотнокислое (ч. д. а.); L-цистеин, 99%, (Acros); хитозан низкомолекулярный (М = 30 кДа), водорастворимый (ЗАО «Биопрогресс»), ТУ 9289-067-00472124-03, степень деацетилирования 87%; сульфат меди безводный (х. ч.). Все растворы были приготовлены с использованием бидистиллированной воды.

Для изучения влияния ХЗ на строение и свойства гидрогелей, полученных на основе ЦСР, была синтезирована серия образцов различного композиционного состава: ЦСР-ХЗ, ЦСР-ХЗ-CuSO₄, ЦСР-CuSO₄. Концентрация раствора хитозана равнялась 0.5 мг/мл, а его pH – 4.34. Цистеин-серебряный раствор, в котором концентрация исходных компонентов составляет C_L-Cys – 3.00 мМ, C_AgNO3 – 3.75 мМ, синтезировали по методике [21, 22], молярное соотношение Ag⁺/Cys равнялось 1.27. В предварительных опытах было установлено, что наиболее прочный ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гель образуется при условии, что ХЗ и электролит добавляют в равных объемах – 1 : 1. Концентрация хитозана в образцах, исследованных в работе, изменялась в пределах от 0.0075 мг/мл до 0.0175 мг/мл, концентрация CuSO₄ – 0.3–0.7 мМ. При синтезе ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей в ЦСР сначала добавляли определенный объем раствора ХЗ, а затем раствор электролита, после добавления каждого компонента образец энергично перемешивали встряхиванием. Следует заметить, что последовательность введения хитозана и электролита в ЦСР имеет большое значение, изменение этой последовательности приводит к понижению механической прочности гидрогелей. Образцы хранили в недоступном для света месте.

Динамическую вязкость гидрогелей измеряли с помощью вибрационного вискозиметра SV-10 фирмы “A&D” (Япония), в поликарбонатных кюветах объемом 10 мл. В процессе измерения вязкости две покрытые золотом сенсорные пластины, погруженные в образец, осциллируют с частотой 30 Гц и амплитудой в 1 мм. Длительность каждого эксперимента составляет 30 мин, температура измерения – 25^°С. Схема эксперимента по измерению вязкости следующая: сначала измеряли вязкость свежеприготовленных образцов – через 30 мин после синтеза, а затем измерение вязкости тех же образцов проводили через 3, 6 и 10 дней (разное время хранения). Образцы между измерениями хранились в герметично упакованных кюветах без доступа света.

Спектральные измерения гидрогелей в УФ- и видимом диапазонах проведены на спектрометре “Evolution Array” фирмы “Thermo Scientific” (США) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 и 2 мм.

Исследования методом динамического светорассеяния (ДСР) выполнены на анализаторе размера частиц Zetasizer “Nano ZS” фирмы “Malvern” c Не-Ne-лазером (633 нм) мощностью 4 мВт при 25^°С в конфигурации обратного рассеяния (173^°). Для этого эксперимента были синтезированы модельные образцы, содержание в которых исходных компонентов в 4 раза ниже, чем в гелеобразующих системах.

Размер частиц в образцах рассчитывался по формуле Стокса–Эйнштейна:

$D\mathit{=}kT\text{/}6\mathrm{\pi \eta }R,$

где k – константа Больцмана, T – абсолютная температура, η – вязкость среды, R – радиус рассеивающих частиц. Индекс полидисперности (Pi) в измерениях всех образцов находился в диапазоне от 0.399 до 0.601. Измерение электрокинетического потенциала (ζ-потенциала) частиц в различных образцах на основе ЦСР осуществляли методом электрофоретического светорассеяния на этом же приборе.

Величину pH цистеин-серебряного раствора и гидрогелей на его основе измеряли с помощью pH-метра “SevenMult”, “Mettler Toledo”, с использованием универсального электрода InLab415.

Морфологию образцов исследовали на сканирующем электронном микроскопе “JEOL JSM 6610LV” в режиме вторичных электронов с использованием углеродного проводящего скотча; на поверхности исследуемых образцов создавали проводящий слой Pt толщиной 20 нм; ускоряющее напряжение составляло 15 кВ при давлении 10^–4 Па. С помощью аналитической приставки “Oxford INCA” Energy 350 проведен рентгеновский энергодисперсионный микроанализ образцов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 2 показаны фотографии ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей с различным содержанием ХЗ и электролита через 5 дней после синтеза, из которых видно, что гель-структуру, не разрушающуюся при переворачивании флакона, в этот момент имеют образцы 2 и 3. В образце 5 наблюдаются признаки коагуляции (мутность). С помощью такой визуальной оценки установлено, что существует определенный, довольно узкий, концентрационный диапазон ХЗ и электролита, в котором происходит образование устойчивых во времени гидрогелей.

 

Рис. 2. Фото ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей через 5 дней после синтеза. Содержание ХЗ и CuSO₄ в образцах (V мл/1 мл ЦСР): 0 – ЦСР (контроль); 1 – С_хз = 0.0075 мг/мл, C_CuSO4 = 0,3 мМ; 2 – С_хз = 0.0100 мг/мл, C_CuSO4 = 0,4 мМ; 3 – С_хз = 0.0125 мг/мл, C_CuSO4 = 0,5 мМ; 4 – С_хз = 0.0150 мг/мл, C_CuSO4 = 0,6 мМ; 5 – С_хз = 0.0175 мг/мл, C_CuSO4 = 0,7 мМ. ХЗ и электролит в образцы добавляли в равных объемах – 1:1.

 

Установлено, что pH гидрогелей с концентрацией С_хз = 0.0100–0.0150 мг/мл, C_CuSO4 = 0.4–0.6 мМ, изменяется в диапазоне 2.67–2.71 для ЦСР-ХЗ-CuSO₄ образцов и 2.62–2.67 для ЦСР-CuSO₄ систем, pH ЦСР – 2.60. Как мы видим, при добавлении в ЦСР хитозана и электролита сильного изменения значений кислотности не происходит, и повышение рН в ЦСР-ХЗ-CuSO₄ системах по сравнению с ЦСР-CuSO₄ образцами связано, скорее всего, с протонированием аминогрупп хитозана. Поскольку структурные элементы ЦСР – кластерные цепочки цвиттер-ионов меркаптида серебра – имеют положительный заряд, образование полиэлектролитных комплексов с молекулами полисахарида в ЦСР-ХЗ-CuSO₄ и ЦСР-ХЗ гидрогелях не происходит.

Кроме визуальной оценки прочности гидрогелей путем переворачивания флакона, были проведены вискозиметрические испытания, которые позволили получить количественную оценку механической прочности (структурированности) образцов. Для вискозиметрических исследований были выбраны образцы 2 и 3, как наиболее устойчивые во времени. Динамическая вязкость ЦСР гидрогелей была измерена в разные моменты времени: через 30 мин после синтеза (свежеприготовленные образцы), а затем через 3, 6 и 10 дней, в зависимости от типа образца. На рис. 3а и 3б представлены зависимости динамической вязкости от времени хранения для ЦСР-ХЗ образцов с разной концентрацией ХЗ [25]. Как мы видим из рисунка, значение вязкости гидрогелей с концентрацией ХЗ (С_хз = 0.0100 мг/мл) мало зависит от времени хранения с момента синтеза (рис. 3а). Увеличение C_хз до 0.0125 мг/мл приводит к снижению вязкости свежеприготовленного образца (рис. 3б, кривая 1) по сравнению с соответствующим образцом 0.0100 мг/мл на рис. 3а (кривая 1) и возрастанию вязкости через 6 дней, значение которой становится сопоставимо со значением вязкости образца с меньшим содержанием ХЗ. Следует отметить, что величина динамической вязкости ЦСР ~ 3.0 мПа·с.

 

Рис. 3. Зависимость динамической вязкости от времени хранения для гидрогелей а, б – ЦСР-ХЗ [25]; в, г – ЦСР-ХЗ-CuSO₄; д, е – ЦСР-CuSO₄. Концентрация ХЗ и CuSO₄ в образцах: а, в, д – С_хз= 0.0100 мг/мл, C_CuSO4=0,4 мМ; б, г, е – С_хз=0.0125 мг/мл, C_CuSO4=0,5 мМ. 1 – через 30 мин после синтеза, 2 – через 3 дня после синтеза, 3 – через 6 дней после синтеза, 4 – через 10 дней после синтеза.

 

Теперь рассмотрим, как изменяется вязкость ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей (образцов 2 и 3) в зависимости от времени (рис. 3в, 3г). Следует напомнить, что при синтезе этих образцов растворы ХЗ и CuSO₄ добавляли в ЦСР в равных объемах – 1 : 1. Значение динамической вязкости образца 2 в процессе 30-минутного измерения в режиме осцилляций сенсорных пластин вибровискозиметра мало изменяется в свежеприготовленном образце и после хранения в течение 3 дней (рис. 3в, кривые 1 и 2). Незначительный рост η образца 2 в процессе измерения наблюдается через 6 дней (рис. 3в, кривая 3), что свидетельствует о структурировании образца, возрастании числа межмолекулярных контактов между фрагментами гель-сетки в результате изменения расстояний между ними из-за осцилляции сенсорных пластин. Если анализировать значение вязкости в начальный момент измерения (t = 0 мин), то можно отметить лишь незначительное увеличение η ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогеля в зависимости от времени хранения.

При увеличении концентрации ХЗ и CuSO₄ в гидрогеле (образец 3) характер зависимости вязкости от времени изменяется (рис. 3г). Наблюдается заметный рост вязкости ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогеля в начальный момент измерения (t = 0 мин) через 3 дня после синтеза (рис. 3г, кривая 2), что особенно очевидно при сравнении с η образца 2 (рис. 3в, кривая 2). Кроме того, вязкость образца 3 через 3 и 10 дней хранения в процессе измерения понижается, предположительно в результате частичной деструкции гель-сетки, однако разрушения 3D-сетки до уровня свежеприготовленного образца или ЦСР (η = 3.0 мПа·с) не происходит.

Для выяснения роли ХЗ в структурировании ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей были исследованы образцы, содержащие ЦСР и сульфат меди (рис. 3д и 3е). Обнаружено сходство в характере концентрационной зависимости вязкости от времени для ЦСР-CuSO₄ и ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей, следовательно, именно присутствие в образце сульфата меди (инициатора гелеобразования) определяет характер структурированности гидрогелей. Таким образом, роль катиона электролита в процессе гелеобразования в ЦСР-системах становится очевидной благодаря вискозиметрическим испытаниям. Установлено, что вязкость ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей выше вязкости ЦСР-ХЗ-Na₂SO₄ образцов в одном и том же концентрационном диапазоне [25], вероятнее всего, благодаря комплексообразующей способности ионов Cu(II) [26, 27]. Ионы меди, координируясь с депротонированными карбоксильными группами цвиттер-ионов различных кластеров, создают дополнительные точки зацепления между супрамолекулярными цепочками, что приводит к формированию более развитой гель-сетки, кроме того, не исключается возможность комплексообразования ионов Cu(II) с молекулами ХЗ [28, 29].

Следует отметить, что концентрационная зависимость вязкости от времени хранения имеет куполообразный характер как для ЦСР-ХЗ-CuSO₄, ЦСР-CuSO₄, так и ЦСР-ХЗ-Na₂SO₄ гидрогелей [25]. Можно предположить, что промежуточные значения концентраций ХЗ и электролита в ЦСР-ХЗ-SO₄^2– гидрогелях позволят реализовать оптимальный баланс межмолекулярных взаимодействий электростатической природы, что приведет к формированию наиболее устойчивой гель-структуры, что требует дополнительных исследований.

Влияние ХЗ на процессы самосборки в цистеин-серебряном растворе анализировали с помощью метода УФ-спектроскопии, исследуя образцы различного композиционного состава (рис. 4).

 

Рис. 4. Электронные спектры образцов в зависимости: от состава (а) – ЦСР (1), ЦСР-ХЗ (2), ЦСР-ХЗ-CuSO₄ (3), ЦСР-CuSO₄ (4) С_хз=0.0100 мг/мл, C_CuSO4=0,4 мМ, толщина кюветы – 1 мм, через 2 дня после синтеза; от концентрации ХЗ (б) – (0 (1), 0.0100 (2), 0.0150 (3) мг/мл) (3), толщина кюветы – 2 мм, через 7 дней после синтеза; от состава (в) – ЦСР (1), ЦСР-ХЗ-CuSO₄ (2), ЦСР-CuSO₄ (4), С_хз = 0.0150 мг/мл, C_CuSO4 = 0,6 мМ; толщина кюветы – 2 мм, через 7 дней после синтеза.

 

В электронных спектрах ЦСР, ЦСР-ХЗ, ЦСР-ХЗ-CuSO₄ и ЦСР-CuSO₄ образцов (рис. 4а) наблюдаются две полосы поглощения с максимумами ~316 и ~390 нм, в области которых обнаружены различия. Согласно нашим исследованиям [21, 23, 30], природа полос поглощения связана с формированием кластерных цепочек, состоящих из молекул меркаптида серебра. Полосы поглощения с максимумами ~316 и 390 нм можно отнести к полосам переноса заряда с лиганда (L-цистеин) на серебро в нанокластерах меркаптида серебра (ligand-to-metal charge transfer) и возникновением аргентофильного взаимодействия Ag(I)---Ag(I) в [---Ag-S(R)---]_n в кластерных цепочках (R – остаток аминокислоты) [31, 32]. Как было указано выше, кластеры в ЦСР имеют структуру “ядро–оболочка”, при этом внутренняя структура кластеров стабилизируется за счет взаимодействующих атомов серы и серебра, а на поверхности кластеров сосредоточены функциональные группы NH₃⁺ и COO^–.

Влияние ХЗ на структуру ЦСР проявляется в зависимости электронных спектров ЦСР-ХЗ образцов от концентрации полисахарида (рис. 4б). Как мы видим, увеличение концентрации ХЗ приводит к уменьшению поглощения полосы ~390 нм. Кроме того, в результате добавления ХЗ в ЦСР поглощение падает и в области полосы ~316 нм (рис. 4а, спектр 2). Можно предположить, что молекулы ХЗ, заряженные положительно, будут распределяться в растворе так, чтобы избегать контактов с положительно заряженными цепочечными фрагментами ЦСР. И тогда основной эффект ХЗ на ЦСР будет состоять в перераспределении противоионов (нитрат-анионов) для компенсации заряда молекул ХЗ. В ЦСР-ХЗ образцах формируются две подсистемы – ЦСР и ХЗ, и при повышении концентрации ХЗ под влиянием молекул ХЗ изменяется геометрия цепочек, нарушается баланс электростатических взаимодействий, в результате чего происходит изменение электронной конфигурации кластерных цепочек.

Электронные спектры гель-образцов, содержащих электролит, ЦСР-ХЗ-CuSO₄ и ЦСР-CuSO₄, были зарегистрированы на толщине поглощающего слоя, равной 2 мм (рис. 4в). Из рисунка видно, что добавление сульфата меди в ЦСР вызывает рост поглощения в спектре в исследуемом диапазоне, при этом наблюдается и изменение формы полосы в области 390 нм. Поглощение в спектре трехкомпонентной ЦСР-ХЗ-CuSO₄ системы меньше, чем в спектре ЦСР-CuSO₄ образца, вследствие влияния хитозана как поликатиона на структуру положительно заряженных фрагментов гель-сетки.

Результаты, полученные с помощью метода динамического рассеяния света (рис. 5), помогут разобраться в этих эффектах.

 

Рис. 5. Распределение рассеивающих частиц по размерам: а) ЦСР (1) после добавления сульфат-аниона в зависимости от времени: 2 – 5, 3 – 30, 4 – 120 мин; C_L-Cys – 0,750 мМ, C_AgNO3 – 0,953 мМ, C_CuSO4 – 0,025 мМ. б) в ЦСР (1), 2 – ХЗ (2), 3 – ЦСР-ХЗ (3), C_L-Cys – 0.750 мМ, C_AgNO3 – 0.938 мМ, С_хз=0.0019 мг/мл [25].

 

Установлено, что через 5 мин после добавления в ЦСР раствора CuSO₄ фиксируется уменьшение размеров кластеров с 44 до 8 нм (рис. 5а, распределения 1 и 2). Однако с течением времени наблюдается рост размеров частиц – до 18 нм через 30 мин и до 1473 нм через 2 ч, что свидетельствует о формировании фрагментов пространственной сетки. Сульфат-анион, как противоион, сначала уменьшает заряд нанокластеров, что вызывает их агрегацию вследствие уменьшения кулоновских сил отталкивания, и одновременно с этим двухзарядный анион выполняет роль линкера между кластерами различных цепочек. Таким образом, анион электролита инициирует процессы формирования пространственной гель-сетки.

Влияние ХЗ на ЦСР демонстрирует рис. 5б [25], на котором показано распределение рассеивающих частиц по размерам в образцах ЦСР, ХЗ, ЦСР-ХЗ. В растворе ЦСР достаточно широкое распределение нанокластеров по размерам с максимумом ~180 нм (рис. 5б, распределение 1). Раствор ХЗ характеризуется бимодальным распределением частиц с размерами ~90 и ~400 нм (рис. 5б, распределение 2). В ЦСР-ХЗ образце, как и в хитозане, наблюдается два типа частиц, однако их размеры увеличились до 100 и 650 нм (рис. 5б, распределение 3). В ЦСР-ХЗ образце существуют две подсистемы – кластерные цепочки МС и молекулы хитозана. Предположительно, вокруг макромолекул хитозана образуется анионное облако противоионов (нитрат ионов), которое позволяет цепочкам МС и молекулам хитозана, как двум положительно заряженным объектам, находиться в растворе в равновесии.

Значения ζ-потенциала различных образцов (табл. 1) подтверждают электростатическую природу взаимодействий, инициирующих процесс гелеобразования в цистеин-серебряном растворе.

 

Таблица 1. ζ-потенциал частиц в анализируемых системах*

Образец	ζ, мВ	Стандартное отклонение, мВ
ЦСР	+56,2	±4,01
ЦСР-CuSO4	+43,6	±4,07
ЦСР-ХЗ-CuSO4	+44,7	±3,33
ХЗ	+11,5	±6,30

*Разбавление образцов 1:4. C_L-Cys – 0,750 мM, C_AgNO3 – 0,953 мM, C_CuSO4 – 0,025 мM, С_хз = 0.0019 мг/мл.

 

Как мы видим, ζ-потенциал кластеров ЦСР понижается после добавления CuSO₄ с +56.2 до +43.6 мВ, что согласуется с результатами, полученными с помощью ДСР (рис. 5а), согласно которым, сульфат-анион как противоион уменьшает заряд кластеров и выступает в роли линкера, образуя связи между кластерами различных цепочек. ζ-потенциал ЦСР-ХЗ-CuSO₄ системы (+44.7 мВ) соизмерим с величиной заряда ЦСР-CuSO₄ образца (+43.6 мВ). Хотя макромолекулы хитозана в водном растворе имеют положительный заряд, равный +11.5 мВ, их влияние на заряд агрегатов в ЦСР-ХЗ-CuSO₄ образце оказывается незначительным. Вероятнее всего, часть сульфат-анионов аккумулируется вблизи макромолекул ХЗ и частично нейтрализует заряд его групп.

Результаты, полученные с помощью метода СЭМ, позволяют визуализировать изменения морфологии ЦСР (рис. 6а) под влиянием хитозана и электролита. В ЦСР-CuSO₄ гидрогеле мы наблюдаем формирование высокопористой сетчатой структуры, характерной для пространственной гель-сетки (рис. 6б). Морфология ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогеля отличается от структуры ЦСР-CuSO₄ образца уменьшением пористости и образованием под влиянием хитозана сферических агрегатов. Такие изменения в структуре ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогеля могут быть связаны с перераспределением сульфат-анионов между кластерами ЦСР и молекулами ХЗ, вследствие чего в образце формируются более короткие цепочки и более фрагментированная гель-сетка, что подтверждается ПЭМ-изображением ЦСР-ХЗ-Na₂SO₄ образца [25]. ПЭМ-изображению ЦСР-Na₂SO₄ гидрогеля, в котором формируется волокнообразная пространственная сетка [25], соответствует пористая структура ЦСР-CuSO₄ образца (рис. 6б). Таким образом, существенные различия в морфологии ЦСР-ХЗ-CuSO₄ и ЦСР-CuSO₄ гидрогелей, вызванные влиянием поликатиона ХЗ, сводятся к перераспределению сульфат-аниона между двумя подсистемами: ЦСР и ХЗ.

 

Рис. 6. СЭМ-микрофотографии образцов: а – ЦСР; б, г – ЦСР-CuSO₄; в – ЦСР-ХЗ-CuSO₄; г – ЦСР-ХЗ.

 

Данные энергодисперсионного анализа ЦСР-ХЗ образца (рис. 6г, табл. 2) подтверждают наши предположения о существовании двух подсистем – кластерных цепочек МС и молекул хитозана. На рисунке мы видим два типа структур: сферические агрегаты с повышенным содержанием серы/серебра (спектры 1–3), предположительно цепочечные кластеры меркаптида серебра в ЦСР, и волокнообразные структуры на основе хитозана (спектры 4–6), характеризующиеся пониженным содержанием серы/серебра.

 

Таблица 2. Энергодисперсионный анализ ЦСР-ХЗ образца, атомные проценты (к рис. 6г)

Спектр	C	N	O	S	Ag
Спектр 1	40.43	23.94	18.81	7.48	9.34
Спектр 2	38.67	26.34	16.34	9.02	9.63
Спектр 3	42.34	27.74	17.73	5.60	6.58
Спектр 4	48.04	23.02	24.21	2.43	2.30
Спектр 5	44.38	19.31	27.59	3.88	4.85
Спектр 6	65.09	11.35	20.79	1.56	1.20

 

Таким образом, в работе удалось синтезировать и исследовать гидрогели супрамолекулярной природы различного композиционного состава: ЦСР-ХЗ, ЦСР-ХЗ-CuSO₄, ЦСР-CuSO₄. Установлено, что гелеобразование в ЦСР системах, содержащих ХЗ и CuSO₄, происходит в узком концентрационном диапазоне (C_хз = 0.0100–0.0150 мг/мл), C_CuSO4 = 0.4–0.6 мМ). Результаты энергодисперсионного анализа ЦСР-ХЗ образца (рис. 6г, табл. 2) подтверждают существование в гидрогеле двух подсистем – кластерных цепочек МС, формирующих пространственную гель-сетку, и молекул хитозана. В ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелях предположительно происходит перераспределение сульфат-анионов между кластерами ЦСР и ХЗ, вследствие чего формируется более фрагментированная пространственная гель-сетка. Введение в ЦСР-ХЗ образцов сульфата меди способствует формированию более прочного гидрогеля за счет ассоциации с сульфат-анионом кластеров меркаптида серебра и молекул ХЗ, а также координации ионов Cu(II) с депротонированными карбоксильными группами различных кластеров МС [27], при этом не исключается возможность комплексообразования ионов Cu(II) с молекулами ХЗ [28, 29]. Роль катиона электролита в процессе гелеобразования в ЦСР системах установлена благодаря вискозиметрическим испытаниям: вязкость ЦСР-ХЗ-CuSO₄ гидрогелей выше ЦСР-ХЗ-Na₂SO₄ образцов в одном и том же концентрационном диапазоне [25], как следствие комплексообразующей способности ионов Cu(II). Подобные системы можно рассматривать не только как перспективную матрицу для разработки материалов биомедицинского назначения, но и как объект для изучения процессов самосборки и гелеобразования в ЦСР системе под влиянием полимерных молекул.

Данная работа выполнена на оборудовании лабораторий спектроскопии и электронной микроскопии ЦКП ТвГУ.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Данная работа финансировалась за счет средств бюджета университета. Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

Г. Р. Зеников

ФГБОУ ВО “Тверской Государственный Университет”

Author for correspondence.
Email: zenikov.german@mail.ru
Russian Federation, 170100, Тверь, ул. Желябова, 33

С. Д. Хижняк

ФГБОУ ВО “Тверской Государственный Университет”

Email: zenikov.german@mail.ru
Russian Federation, 170100, Тверь, ул. Желябова, 33

А. И. Иванова

ФГБОУ ВО “Тверской Государственный Университет”

Email: zenikov.german@mail.ru
Russian Federation, 170100, Тверь, ул. Желябова, 33

П. М. Пахомов

ФГБОУ ВО “Тверской Государственный Университет”

Email: zenikov.german@mail.ru
Russian Federation, 170100, Тверь, ул. Желябова, 33

References

Supplementary files