Особенности взаимодействия лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Исследовано взаимодействие лизоцима белка куриного яйца с блок-сополимерами поли(L-глутаминовой кислоты натриевой соли) и полиэтиленгликоля (PGLU10–PEG, PGLU100–PEG) в водной среде и на границе вода–воздух. При проведении исследований применяли широкий спектр физико-химических методов: турбидиметрия, тензиометрия, флуориметрия, КД-спектроскопия, электрофоретическое светорассеяние, просвечивающая электронная микроскопия. Обнаружено, что на границе вода–воздух возможно образование смешанных адсорбционных слоев при мольных соотношениях блок-сополимер: фермент, не превышающих 2 : 1. В водной среде возможно образование комплексов блок-сополимера PGLU10–PEG и лизоцима со структурой типа ядро–оболочка и комплексов блок-сополимера PGLU100–PEG: лизоцим состава 1 : 1 или 2 : 1 (по молям). Возможность регулировать свойства продуктов взаимодействия фермента и блок-сополимеров позволяет разрабатывать стратегии получения антибактериальных препаратов.

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Белки (ферменты) – это природные полиэлектролиты, которые обладают уникальными свойствами, включая способности к денатурации и ренатурации, образованию гелей и нановолокон. Большое количество ферментов обладает терапевтическими свойствами, однако они, как правило, неустойчивы в физиологических условиях, что обусловливает потребность в иммобилизации биокатализаторов. Иммобилизованные на полимерах препараты ферментов широко используются в пищевой промышленности, при доставке лекарств, в изготовлении биосенсоров [1–4].

Блок-сополимеры полиаминокислот и полиэтиленгликоля (PEG) используют в качестве носителей для иммобилизации ферментов и белков. Установлено, что они взаимодействуют с белками и ферментами с образованием полиионных комплексов, которые представляют собой супрамолекулярные структуры типа ядро–оболочка. Общепринятой моделью таких структур являются те, в состав ядра которых входят белок и полиаминокислота, а оболочка состоит из PEG. Движущей силой взаимодействия белка с полимером является энтропийный фактор, обусловленный высвобождением в раствор противоионов. Роль PEG заключается в увеличении растворимости в водной среде полиионных комплексов, подавлении агрегации частиц комплексов, а также защите от протеолиза включаемых в комплексы белков и понижении их иммуногенности [5–10].

Лизоцим белка куриного яйца – небольшой глобулярный белок (14.3 кДа) с высоким значением изоэлектрической точки (11.35). Лизоцим – распространенный фермент в организме человека и животных: он содержится в грудном молоке, слюне, слезной жидкости, сыворотке крови, а также в слизистых оболочках органов пищеварения, дыхания, мочеполовой системы [11–15]. Лизоцим гидролизует β-1,4 гликозидные связи между N–ацетилмурамовой кислотой и N–ацетил–d–глюкозоамином в пептидогликане клеточных стенок грамположительных микроорганизмов (Clostridium tyrobutyricum, Staphylococcus aureus, Bacillus stearothermophilus, Micrococcus luteus). Свойства лизоцима изучены достаточно хорошо, поэтому его часто используют в качестве модельного белка в физико–химических, структурных и кинетических исследованиях [11, 15, 16].

В данной работе изучено взаимодействие блок-сополимеров PGLU–PEG (с переменной длиной PGLU) с антимикробным ферментом лизоцимом. Исследование взаимодействия лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG может способствовать пониманию подходов к получению самособирающихся функциональных наноматериалов с антимикробным действием. Как было сказано выше, лизоцим входит в состав физиологических жидкостей и слизистых оболочек (например, слезы, слюна, слизь дыхательных путей), которые контактируют с внешней средой. Понимание особенностей структуры и функционирования наноматериалов как в объеме жидкости, так и на границе раздела жидкость–воздух является важной фундаментальной и прикладной задачей. В качестве простейших моделей жидкой фазы и границы раздела можно рассмотреть водную фазу и границу вода–воздух. Цель работы – установить влияние длины фрагмента PGLU на физико-химические параметры взаимодействия между лизоцимом и блок-сополимерами PGLU–PEG в водной фазе и на границе вода–воздух.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

В работе использовали лизоцим белка куриного яйца (диализованный и лиофилизованный, L6876), M. lysodeikticus ATCC No. 4698 (M3770), соли для приготовления буферных растворов фирмы Sigma (США); блок-сополимеры полиэтиленгликоля и поли(L-глутаминовой кислоты натриевой соли) фирмы Alamanda polymers (США). Молекулы блок-сополимеров характеризуются наличием блока поли(L-глутаминовой кислоты натриевой соли) переменной молекулярной массы (PGLU10 1.5 кДа и PGLU100 15.0 кДа) и полиэтиленгликоля массой 5 кДа (114 структурных звеньев): PGLU10–PEG (Mw 6.5 кДа), PGLU100–PEG (Mw 20.0 кДа). По данным производителя, кривые молекулярно-массового распределения обоих полимеров, полученные с помощью гель-проникающей хроматографии, имеют унимодальную форму, коэффициент полидисперсности составляет 1.0–1.2, что соответствует монодисперсной системе.

Получение комплексов лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG

Свежеприготовленный водный раствор PGLU–PEG разбавляли свежеприготовленным водным раствором лизоцима необходимой концентрации в объемном соотношении 9 : 1. Смеси лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG инкубировали 24 ч при 4°C (низкую температуру выбрали с целью избегания инактивации фермента), были получены образцы с концентрацией лизоцима 7.0 · 10–6 М и концентрациями PGLU–PEG от 7.8 · 10–6 М до 2.0 · 10–3 М. Для проведения тензиометрии, спектроскопических исследований, измерения ζ-потенциала и размера частиц рН растворов с рН ниже 7.0 доводили до 7.4–7.5 при помощи растворов NaOH в концентрации 1 М и 0.1 М. Исследования объемных и поверхностных свойств растворов проводили через 24 ч после смешения компонентов.

Изучение влияния блок-сополимеров PGLU–PEG на активность лизоцима

Активность лизоцима определяли методом турбидиметрии по изменению мутности суспензии клеток M. lysodeikticus во времени при длине волны 600 нм. В фосфатно-солевом буфере готовили суспензии клеток M. lysodeikticus, содержащие PGLU–PEG (концентрация от 7.8 · 10–6 М до 5.0 · 10–4 М). 0.5 мл суспензии клеток помещали в кварцевую кювету, которую инкубировали 3 мин в термостатируемом кюветном отделении спектрофотометра Beckman Coulter DU720 (Beckman Coulter, США) для прогрева клеточной суспензии до 25°С и регистрации фонового лизиса. Далее к суспензии клеток добавляли аликвоту водного раствора лизоцима (концентрация фермента в реакционной смеси была 3.5 · 10–7 М) и регистрировали уменьшение мутности во времени до окончания лизиса. Активность фермента рассчитывали как тангенс угла наклона начального участка на кривой зависимости мутности от времени за вычетом фона.

Исследование взаимодействия лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG на границе вода–воздух

Поверхностное натяжение растворов смесей лизоцима (7.0 · 10–6 М) с блок-сополимерами PGLU–PEG (концентрация от 7.8 · 10–6 М до 2.0 · 10–3 М) измеряли методом отрыва кольца. В качестве контроля измеряли поверхностное натяжение водных растворов лизоцима и блок-сополимеров без добавок в аналогичных концентрациях.

Исследование взаимодействия лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG в объеме раствора

Спектры флуоресценции для лизоцима (7.0 · 10–6 М) в смесях с PGLU–PEG (от 7.8 · 10–6 М до 5.0 · 10–4 М) регистрировали с использованием спектрофлуориметра Spectramax M5 (Molecular Devices, США) при 25°С, длине оптического пути 10 мм, диапазоне длин волн от 290 до 400 нм с шагом 1 нм (λex = 280 нм). Спектры кругового дихроизма при этих же концентрациях фермента и блок-сополимеров регистрировали при помощи КД-спектрометра Jasco–J815 (JASCO Corporation, Япония) при скорости сканирования 2 нм/с и длине оптического пути 1 мм.

ζ-потенциал смесей лизоцима с PGLU–PEG (водная среда, 7.0 · 10–6 М лизоцима, от 7.8 · 10–6 М до 5.0 · 10–4 М PGLU–PEG) измеряли на анализаторе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания). Использовали U-образные пластиковые кюветы с интегрированными золотыми электродами.

Для визуализации изображений частиц использовали просвечивающий электронный микроскоп JEM-1011 (JEOL Ltd, Япония) с боковой цифровой фотокамерой ORIUS SC1000W, работающей под управлением программы Digital Micrograph (GATAN, США). 10 мкл водного раствора образца наносили на медную сетку (диаметр 3 мм, 300 ячеек), покрытую ультратонкой углеродной пленкой, и выдерживали 2 мин. Избыток жидкости удаляли фильтровальной бумагой, сеточки с нанесенными образцами обрабатывали 1% раствором уранилацетета и снова выдерживали 2 мин. Избыток жидкости снова удаляли фильтровальной бумагой. Исследование образцов проводили при ускоряющем напряжении 80 кВ и 300000-кратном увеличении. Для определения размеров частиц и статистической обработки данных использовали программу ImageJ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изотермы поверхностного натяжения блок-сополимеров PGLU–PEG и их смесей с лизоцимом на границе вода–воздух

Было исследовано поверхностное натяжение трех серий растворов бинарных смесей блок-сополимеров PGLU–PEG с лизоцимом (концентрация лизоцима 7.0 · 10–6 М, концентрация блок-сополимеров от 7.8 · 10–6 М до 2.0 · 10–3 М), растворов лизоцима и блок-сополимеров. Поверхностное натяжение раствора лизоцима cоставляет 68.5±1.5 мН/м при концентрации фермента 7.0 · 10–6 М. Полученное значение хорошо коррелирует с данными, приведенными в литературе. Для лизоцима в сопоставимых концентрациях 5.0 · 10–6 М и 3.5 · 10–6 М методом Вильгельми были получены значения поверхностного натяжения 70 и 62.5 мН/м соответственно [17, 18].

Линейные гидрофильные диблок-сополимеры PGLU10–PEG, PGLU100–PEG (от 7.8 · 10–6 М до 2.0 · 10–3 М) проявляют поверхностную активность в водных растворах, понижая поверхностное натяжение (рис. 1а, 1б) до определенного постоянного значения в 62–63 мН/м, которое сопоставимо со значениями, создаваемыми карбоксил-содержащими анионными полимерами [19].

Показано, что поверхностная активность полиакриловой кислоты массой 250 кДа зависела от состояния ее ионизации при 30°C, концентрации полимера 3 · 10–9 М. Наиболее высокую поверхностную активность полимер проявлял в кислых средах при небольшой степени ионизации. При рН 3.35 (степень ионизации 0.0) поверхностное натяжение на границе вода–воздух составляло ~68 мН/м, при рН 3.70 (степень ионизации 0.025) поверхностное натяжение было равно ~69 мН/м. При рН 6.34 (степень ионизации 0.3), 7.82 (степень ионизации 0.5), 11.0 (степень ионизации 1.0) полиакриловая кислота проявляла более низкую поверхностную активность. Это выражалось в том, что равновесное значение поверхностного натяжения находилось в диапазоне от ~71 мН/м (рН 6.34) до ~72.8 мН/м (рН 11.0) [19]. Увеличение степени ионизации карбоксильных групп полиакриловой кислоты затрудняло ее диффузию к границе раздела фаз из-за электростатического отталкивания молекул полимера от одноименно заряженной межфазной границы, создаваемой первыми адсорбированными молекулами [19–21]. Можно предположить, что по этой причине сильного снижения поверхностного натяжения блок-сополимерами (относительно поверхностного натяжения воды) не происходит. Известно, что при адсорбции высокомолекулярных соединений на границе раздела фаз их молекулы приобретают сложные конформации с образованием петель и хвостов [20].

На изотермах поверхностного натяжения PGLU10–PEG или PGLU100–PEG в смеси с лизоцимом можно выделить два участка: на первом поверхностное натяжение ниже поверхностного натяжения блок-сополимера и на втором поверхностное натяжение смеси не отличается от натяжения свободного блок-сополимера (рис. 1а, 1б). При Z 1 : 1 или 2 : 1 поверхностное натяжение смеси лизоцима с PGLU10–PEG или с PGLU100–PEG равно или немного ниже поверхностного натяжения лизоцима и блок-сополимера. Это означает, что на границе раздела фаз находится фермент или смешанный адсорбционный слой. При концентрациях PGLU10–PEG или PGLU100–PEG выше или равных 3.1 · 10–5 М (Z 4 : 1) происходит полное вытеснение лизоцима с границы раздела фаз и поверхностное натяжение определяется блок-сополимером. Можно заключить, что в смесях лизоцима с блок-сополимерами на границе раздела фаз практически всегда находится блок-сополимер. Наиболее вероятно, что при концентрациях PGLU10–PEG или PGLU100–PEG выше или равных 3.1 · 10–5 М независимо от длины PGLU весь лизоцим связывается с блок-сополимерами и находится в объеме раствора.

 

Рис. 1. Изотермы поверхностного натяжения для растворов блок-сополимеров PGLU10–PEG (а), PGLU100–PEG (б) в свободном состоянии и в смеси с лизоцимом (7.0 · 10–6 М) в водной среде при 25°С. Серые значки – лизоцим, черные значки – блок-сополимеры, белые значки – смеси лизоцима и блок-сополимеров.

 

Взаимодействие лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG в объеме раствора

Известно, что блок-сополимеры PGLU–PEG при взаимодействии с белками образуют блок-иономерные комплексы с ядром из поли(L-глутаминовой кислоты), содержащим биомолекулы, и оболочкой из PEG [1–4, 7]. Эта концепция была взята за основу при исследовании взаимодействия лизоцима (7.0 · 10–6 М) с блок-сополимерами PGLU–PEG (от 7.8 · 10–6 М до 5.0 · 10–4 М) при мольных соотношениях полимер: фермент (Z) от 1 : 1 до 70 : 1.

Растворы смесей лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG имеют слабокислую или слабощелочную реакцию среды в зависимости от мольного соотношения блок-сополимер: фермент (рН 6.3 при Z 1 : 1, рН 7.7 при Z 70 : 1, рис. 2). Натриевая соль поли(L-глутаминовой кислоты) – полиэлектролит, карбоксильные группы структурных звеньев которого могут связывать протоны из водной среды (растворы блок-сополимеров имеют слабощелочную реакцию среды, рН ~8). Раствор лизоцима (7.0 · 10–6 М) имеет слабокислый рН~6. При смешивании растворов лизоцима и блок-сополимеров PGLU–PEG рН образующегося раствора при малых Z близок к рН раствора лизоцима, при высоких Z – к рН растворов блок-сополимеров. Еще раз отметим, что для проведения исследований рН растворов лизоцима с блок-сополимерами с рН ниже 7.0 доводили до значения 7.4–7.5.

 

Рис. 2. Зависимость рН среды смесей лизоцима с блок-сополимерами от концентрации блок-сополимера. Черные столбцы – лизоцим с PGLU10–PEG, белые столбцы – лизоцим с PGLU100–PEG.

 

При рН смесей лизоцима с блок-сополимерами молекулы фермента и блок-сополимеров характеризуются зарядами противоположного знака. Положительная величина заряда лизоцима обусловлена наличием заряженных групп, принадлежащих 6 остаткам лизина, 11 остаткам аргинина, 1 остатку гистидина. Заряд молекулы фермента при рН 7.5 составляет +7.0 [22]. При указанном рН молекула лизоцима характеризуется значением ζ-потенциала в +10–15 мВ [23].

Блок-сополимеры PGLU10–PEG и PGLU100–PEG характеризуются значениями ζ-потенциала в –15 ± 1 и –40 ± 2 мВ соответственно. Отрицательные значения ζ-потенциала обусловлены наличием ионизованных карбоксильных групп в молекулах PGLU–PEG.

При взаимодействии лизоцима с PGLU–PEG происходит частичная нейтрализация отрицательных зарядов карбоксильных групп блок-сополимеров положительными зарядами аминогрупп лизоцима. Это выражается в том, что ζ-потенциалы продуктов взаимодействия лизоцима с блок-сополимерами характеризуются небольшими отрицательными значениями, находящимися между ζ-потенциалами лизоцима и блок-сополимеров (рис. 3). ζ-потенциал продуктов взаимодействия лизоцима с PGLU10–PEG соответствует ζ-потенциалу комплексов блок-сополимеров и белка со структурой типа ядро–оболочка, в ядро которых входят молекулы белка и PGLU, а оболочка состоит из PEG [24]. Продукты взаимодействия лизоцима с PGLU100–PEG имеют достаточно высокий ζ-потенциал, это означает, что вероятнее всего образуются “обычные” комплексы полимер–белок.

 

Рис. 3. Зависимость ζ-потенциала смесей лизоцима с блок-сополимерами от концентрации блок-сополимера. Черные столбцы – лизоцим с PGLU10–PEG, белые столбцы – лизоцим с PGLU100–PEG. Планки погрешностей обозначают разброс среднего значения ζ-потенциала.

 

По мере увеличения концентрации блок-сополимера PGLU10–PEG при постоянной концентрации лизоцима ζ-потенциал падает и при Z 4 : 1 принимает постоянное значение. При взаимодействии лизоцима с блок-сополимером PGLU100–PEG выход ζ-потенциала на плато наблюдается при Z 2 : 1. Появление постоянного значения ζ-потенциала может означать окончание связывания лизоцима.

Молекулы диблок-сополимеров в растворе ведут себя по-разному в зависимости от длины PGLU. Диблок-сополимер PGLU10–PEG образует сферические или эллипсоидальные ассоциаты диаметром 10–15 нм c узким распределением по размерам. Блок-сополимер PGLU100–PEG не склонен к ассоциации, в растворе находятся очень мелкие частицы диаметром 1–2 нм (рис. 4а, 5а). Молекулы блок-сополимеров PGLU100–PEG обладают высоким значением ζ-потенциала, и межмолекулярное электростатическое отталкивание, вероятно, препятствует образованию ассоциатов.

 

Рис. 4. ПЭМ–изображения и распределения частиц по размерам для блок-сополимера PGLU100–PEG (а) и лизоцима с блок-сополимером PGLU100–PEG, Z 18 : 1 (б).

 

Рис. 5. ПЭМ-изображения и распределения частиц по размерам для блок-сополимера PGLU10–PEG (а) и лизоцима с блок-сополимером PGLU10–PEG, Z 18 : 1 (б).

 

При взаимодействии лизоцима с PGLU100–PEG и PGLU10–PEG значительного увеличения размеров частиц (по сравнению с размерами блок-сополимера) не наблюдается (рис. 4б, 5б). Взаимодействие PGLU100–PEG c лизоцимом (Z 18 : 1) приводит к укрупнению частиц от 1–2 нм (для PGLU100–PEG) до 3–10 нм. Частицы ассоциатов с ζ-потенциалом в –30 мВ отталкиваются друг от друга, что предотвращает их укрупнение. Частицы со средним диаметром в 12–17 нм и образуются при взаимодействии лизоцима с PGLU10–PEG (Z 18 : 1), как уже было сказано выше, это, скорее всего, комплексы со структурой по типу ядро–оболочка.

Можно заключить, что при взаимодействии лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG есть возможность регулирования физико-химических свойств образующихся комплексов путем изменения количественного состава молекул блок-сополимеров. Наноразмерные комплексы ядро–оболочка получаются при взаимодействии лизоцима с PGLU10–PEG. С блок-сополимерами PGLU100–PEG лизоцим образует комплексы без мицеллоподобной структуры.

Флуоресцентная спектроскопия широко используется при исследовании взаимодействия белков с разными лигандами. Как правило, флуоресцентную спектроскопию используют для детектирования изменений третичной структуры белков. Молекула лизоцима содержит 6 остатков триптофана: Trp28, Trp62, Trp63, Trp108, Trp111, Trp123. Флуоресценция лизоцима обусловлена почти на 80% флуоресценцией Trp62 и Trp108, флуоресценция Trp63, Trp111 и Trp123 гасится из-за наличия рядом дисульфидных связей Cys76–Cys94 и Cys6–Cys127 [25, 26]. Trp62, Trp63 и Trp108 расположены в активном центре лизоцима, Trp28 и Trp111 расположены во внутренней гидрофобной области, Trp12 расположен на внешней стороне белковой глобулы [27].

Спектр флуоресценции лизоцима характеризуется наличием максимума эмиссии флуоресценции (λmax) при длине волны 339 ± 2 нм. Взаимодействие лизоцима с PGLU10–PEG, PGLU100–PEG вызывает колебания положения максимума флуоресценции фермента (λmax) в пределах погрешности измерения (рис. 6а). Слабое тушение флуоресценции лизоцима (возрастание RFU0/RFU, где RFU0 – число единиц флуоресценции лизоцима при длине волны 339 нм, RFU – число единиц флуоресценции при 339 нм для лизоцима в комплексе с блок-сополимером) начинается при Z 1 : 1 (для PGLU100–PEG) или при Z 2 : 1 (для PGLU10–PEG) и далее с увеличением Z остается постоянным. Увеличение длины PGLU способствует усилению тушения флуоресценции лизоцима от 7–10% (для PGLU10–PEG) до 30–40% (для PGLU100–PEG) (рис. 6б). Отсутствие зависимости тушения триптофановой флуоресценции лизоцима от концентрации блок-сополимеров означает, что межмолекулярные взаимодействия фермента и блок-сополимеров носят локальный характер. Более того, так как тушение слабое и нет смещения максимума эмиссии флуоресценции для фермента при взаимодействии с блок-сополимерами, то можно заключить, что третичная структура лизоцима сохраняется.

 

Рис. 6. Влияние блок-сополимеров на положение максимума интенсивности флуоресценции лизоцима (а), влияние блок-сополимеров на интенсивность максимума флуоресценции лизоцима (б). Черные значки – лизоцим с PGLU10–PEG, белые значки – лизоцим с PGLU100–PEG. λmax – длина волны максимума интенсивности флуоресценции; RFU0 – число единиц флуоресценции лизоцима при длине волны 339 нм (при λmax); RFU – число единиц интенсивности флуоресценции лизоцима с блок-сополимером при длине волны 339 нм. RFU0/RFU (λmax) – отношение величины интенсивности максимума флуоресценции свободного лизоцима к величине интенсивности флуоресценции лизоцима с блок-сополимером при длине волны 339 нм.

При ассоциации лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG не происходит изменения формы и интенсивности сигнала спектров КД для фермента (рис. 7). Это означает, что не происходит изменения вторичной структуры молекул фермента.

 

Рис. 7. КД-спектры свободного лизоцима и фермента в составе ассоциатов с блок-сополимерами PGLU10–PEG, PGLU100–PEG. Черная линия – свободный лизоцим, черный пунктир – лизоцим с PGLU100–PEG (Z 18 : 1), серый пунктир – лизоцим с PGLU10–PEG (Z 18 : 1).

 

Самым важным свойством лизоцима является его бактерицидное действие, фермент специфичен к грамположительным микроорганизмам. Было исследовано влияние блок-сополимеров на антимикробную активность лизоцима с использованием в качестве субстрата клеток M. lysodeikticus. Влияние полианионов на активность лизоцима исследовалось и ранее. Гликопротеин муцин из желудка свиньи вследствие своей высокой способности к адгезии к клеточным стенкам блокировал доступ лизоцима к пептидогликану, и активность фермента существенно падала [23]. Альгинаты высокой и низкой вязкостей формировали прочные комплексы с лизоцимом и создавали стерические затруднения при взаимодействии фермента с клеточной стенкой [28]. Блок-сополимеры PGLU–PEG не оказывают существенного влияния на активность лизоцима (активность фермента сохраняется на уровне 80–100%) во всем диапазоне исследуемых концентраций (вплоть до 5.0 · 10–4 М) вне зависимости от длины PGLU (рис. 8). Эти данные согласуются с тем, что активный центр фермента не вовлечен во взаимодействие между ним и блок-сополимерами.

 

Рис. 8. Влияние блок-сополимеров на активность лизоцима. Черные столбцы – лизоцим с PGLU10– PEG, белые столбцы – лизоцим с PGLU100–PEG.

 

Ранее было установлено, что включение лизоцима в комплексы с PEG12k–pAsp34–NH2 (аналогом PGLU–PEG) со структурой по типу ядро–оболочка приводило к увеличению активности фермента при гидролизе NP–(GlcNAc)4 за счет накопления этого субстрата в ядре [9]. Пептидогликан клеточных стенок представляет собой гигантскую полимерную сетку, и его накопление в наночастицах невозможно. В связи с этим важно исследовать активность лизоцима именно при гидролизе высокомолекулярного субстрата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При взаимодействии лизоцима белка куриного яйца с блок-сополимерами PGLU10–PEG, PGLU100–PEG поверхностное натяжение на границе раздела вода–воздух определяется блок-сополимером при мольном соотношении блок-сополимер: фермент выше 2 : 1. При мольном соотношении ниже или равном 2 : 1 возможно существование смешанных адсорбционных слоев. При взаимодействии лизоцима с блок-сополимерами PGLU–PEG в объеме раствора образуются наноразмерные комплексы с отрицательным ζ-потенциалом. Выявлена возможность регуляции размеров комплексов и их структуры путем изменения длины PGLU в молекулах блок-сополимеров. С блок-сополимерами PGLU100–PEG лизоцим образует комплексы, в которых на одну молекулу фермента приходится 1–2 молекулы блок-сополимера. PGLU10–PEG при взаимодействии с лизоцимом образует комплексы с оболочкой из PEG и ядром из PGLU и лизоцима, при этом на одну молекулу фермента приходится 2–4 молекулы блок-сополимера. Взаимодействие с блок-сополимерами сопровождается сохранением вторичной и третичной структуры фермента и не приводит к изменению бактерицидной активности лизоцима.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена по госбюджетной тематике НИР 123032300028-0.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

В работе использовалось оборудование общефакультетской лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова. Центр коллективного пользования “Электронная микроскопия в науках о жизни”.

×

About the authors

Л. Ю. Филатова

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Author for correspondence.
Email: luboff.filatova@gmail.com

Химический факультет

Russian Federation, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119991

Н. Г. Балабушевич

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Email: luboff.filatova@gmail.com

Химический факультет

Russian Federation, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Москва, 119991

References

  1. Basso А., Serban S. Industrial applications of immobilized enzymes–A review // Molecular Catalysis. 2019. V. 479. P. 110607. https://doi.org/10.1016/j.mcat.2019.110607
  2. Dong–Mei L.,Chen D. Recent advances in nano–carrier immobilized enzymes and their applications // Process Biochemistry. 2020. V. 92. P. 464–475. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2020.02.005
  3. Bilal M., Hussain N., Heloisa J., Américo–Pinheiro P., Almulaiky Y., Iqbal H.M.N. Multi–enzyme co–immobilized nano–assemblies: Bringing enzymes together for expanding bio–catalysis scope to meet biotechnological challenges // International Journal of Biological Macromolecules. 2021. V. 186. P. 735–749. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2021.07.064
  4. Tan Z., Cheng H., Chen G., Ju F., Fernández–Lucas J., Zdarta J., Jesionowski T., Bilal M. Designing multifunctional biocatalytic cascade system by multi–enzyme co–immobilization on biopolymers and nanostructured materials // International Journal of Biological Macromolecules. 2023. V. 227. P. 535–550. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2022.12.074
  5. Wu F.G., Jiang Y.W., Chen Z., Yu Z.W. Folding behaviors of protein (lysozyme) confined in polyelectrolyte complex micelle // Langmuir. 2016. V. 32. № 15. P. 3655–3664. https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.6b00235
  6. Zhao Y., Haney M.J., Klyachko N.L., Li S., Booth S.L., Higginbotham S.M., Jones J., Zimmerman M.C., Lee Mosley R., Kabanov A.V., Gendelman H.E., Batrakova E.V. Polyelectrolyte complex optimization for macrophage delivery of redox enzyme nanoparticles // Nanomedicine. 2011. V. 6. № 1. P. 25–42. https://doi.org/10.2217/nnm.10.129
  7. Lee Y., Ishii T., Cabral H., Kim H.J., Seo J–H., Nishiyama N., Oshima H., Osada K., Kataoka K. Charge–conversional polyionic complex micelles – efficient nanocarriers for protein delivery into cytoplasm // Angewante Chemie International Edition. 2009. V. 48. № 29. P. 5309–5312. https://doi.org/10.1002/anie.200900064
  8. Jundi A. El., Buwalda S.J., Bakkour Y., Garric X., Nottelet B. Double hydrophilic block copolymers self–assemblies in biomedical Applications // Advances in Colloid and Interface Science. 2020. V. 283. P. 102213. https://doi.org/10.1016/j.cis.2020.102213
  9. Yuan X., Yamasaki Y., Harada A., Kataoka K. Characterization of stable lysozyme–entrapped polyion complex (PIC) micelles with crosslinked core by glutaraldehyde // Polymer. 2005. № 18. V. 46. P. 7749–7758. https://doi.org/10.1016/j.polymer.2005.02.121
  10. Harada A., Kataoka K. Novel polyion complex micelles entrapping enzyme molecules in the core: preparation of narrowly–distributed micelles from lysozyme and poly(ethylene glycol)–poly(aspartic acid) block copolymer in aqueous medium // Macromolecules. 1998. V. 31. № 2. P. 288–294. https://doi.org/10.1021/ma971277v
  11. Ferraboschi P., Ciceri S., Grisenti P. Applications of lysozyme, an innate immune defense factor, as an alternative antibiotic // Antibiotics. 2021. V. 10. № 12. P. 1534. https://doi.org/10.3390/antibiotics10121534
  12. Liu Y., Sun Y., Xu Y., Feng H., Fu S., Tang J., Liu W., Sun D., Jiang H., Xu S. Preparation and evaluation of lysozyme–loaded nanoparticles coated with poly–γ–glutamic acid and chitosan // International Journal of Biological Macromolecules. 2013. V. 59. P. 201–207. http://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2013.04.065
  13. Vilcacundo R., M´endez P., Reyes P., Romero H., Pinto A., Carrillo W. Antibacterial activity of hen egg white lysozyme denatured by thermal and chemical treatments // Scientia Pharmaceutica. 2018. V. 86. № 4. P. 48. https://doi.org/10.3390/scipharm86040048
  14. Cegielska–Radziejewska R., Le´snierowski G., Kijowski J. Properties and application of egg white lysozyme and its modified preparations – a review // Polish Journal of Food and Nutrition Sciences. 2008. V. 58. № 1. P. 5–10.
  15. Aminlari L., Mohammadi Hashemi M., Aminlari M. Modified lysozymes as novel broad spectrum natural antimicrobial agents in foods // Journal of Food Science. 2014. V. 79. № 6. P. R1077–R1090. https://doi.org/10.1111/1750-3841.12460
  16. Avila M., G´omez–Torres N., Hern´andez M., Garde S. Inhibitory activity of reuterin, nisin, lysozyme and nitrite against vegetative cells and spores of dairy–related Clostridium species // International Journal of Food Microbiology. 2014. V. 172. P. 70–75. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2013.12.002
  17. Tihonov M.M., Kim V.V., Noskov B.A. Impact of a reducing agent on the dynamic surface properties of lysozyme solutions // Journal of Oleo Sciences. 2016. V. 65. № 5. P. 413–418. https://doi.org/10.5650/jos.ess15247
  18. Миляева О.Ю. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов белков и полиэлектролитов. Дисс. канд. хим. наук. 2015.
  19. Ishimuro Y., Ueberreiter K. The surface tension of poly(acrylic acid) in aqueous solution // Colloid and polymer Science. 1980. V. 258. P. 928–931. https://doi.org/10.1007/BF01584922
  20. Айдарова С.Б., Алимбекова Г.К., Оспанова Ж.Б., Мусабеков К.Б., Миллер Р. Поверхностное натяжение водных растворов поливинилового спирта и его бинарных смесей с Тритоном Х-100 // Известия Национальной Академии Наук Республики Казахстан. Серия химии и технологии. 2012. № 2. С. 49–55.
  21. Файнерман В.Б. Кинетика формирования адсорбционных слоев на границе раздела раствор–воздух // Успехи химии. 1985. Т. 54. № 10. С. 1613-1631. https://doi.org/10.1070/RC1985v054n10ABEH003150
  22. Guseman A.J., Speer S.L., Perez Goncalves G.M., Pielak G.J. Surface–charge modulates protein–protein interactions in physiologically–relevant environments // Biochemistry. 2018. V. 57. № 11. P. 1681–1684. https://doi.org/10.1021/acs.biochem.8b00061
  23. Filatova L., Emelianov G., Balabushevich N., Klyachko N. Supramolecular assemblies of mucin and lysozyme: Formation and physicochemical characterization // Process Biochemistry. 2022. V. 113. P. 97–106. https://doi.org/10.1016/j.procbio.2021.12.022
  24. Shin S.H.R., McAninch P.T., Henderson I.M., Gomez A., Greene A.C., Carnes E.C., Paxton W.F. Self–assembly/disassembly of giant double–hydrophilic polymersomes at biologically–relevant pH // Chemical Communications Journal. 2018. V. 54. № 65. P. 9043–9046. https://doi.org/10.1039/C8CC05155K
  25. D’Auria S., Staiano M., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. The combined use of fluorescence spectroscopy and X–ray crystallography greatly contributes to elucidating structure and dynamics of proteins // Reviews in Fluorescence 2005. Boston: Springer, 2007. https://doi.org/10.1007/0-387-23690-2_2
  26. Chen B., Zhang H., Xi W., Zhao L., Liang L., Chen Y. Unfolding mechanism of lysozyme in various urea solutions: Insights from fluorescence spectroscopy // Journal of Molecular Structure. 2014. V. 1076. P. 524–528. https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2014.08.023
  27. Blake C.C., Koenig D.F., Mairv G.A., North A.C., Phillips D.C., Sarma V.R. Structure of hen egg–white lysozyme: A three–dimensional Fourier synthesis at 2 Å resolution // Nature. 1965. V. 206. № 4986. P. 757–761. https://doi.org/10.1038/206757a0
  28. Filatova L., Balabushevich N., Klyachko N. A physicochemical, structural, microbiological and kinetic study of hen egg white lysozyme in complexes with alginate and chitosan // Biocatalysis and Biotransformation. 2022. V. 40. № 5. P. 327–340. https://doi.org/10.1080/10242422.2021.1909001

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Isotherms of surface tension for solutions of block copolymers PGLU10–PEG (a), PGLU100–PEG (b) in a free state and mixed with lysozyme (7.0 · 10-6 M) in an aqueous medium at 25 ° C. Gray icons are lysozyme, black icons are block copolymers, white icons are mixtures of lysozyme and block copolymers.

Download (113KB)
Indexing metadata
3. Fig. 2. Dependence of the pH of the medium of mixtures of lysozyme with block copolymers on the concentration of the block copolymer. The black columns are lysozyme with PGLU10–PEG, the white columns are lysozyme with PGLU100–PEG.

Download (91KB)
Indexing metadata
4. Fig. 4. TEM images and particle size distributions for PGLU100–PEG block copolymer (a) and lysozyme with PGLU100- PEG block copolymer, Z 18:1 (b).

Download (450KB)
Indexing metadata
5. Fig. 5. TEM images and particle size distributions for PGLU10-PEG block copolymer (a) and lysozyme with PGLU10-PEG block copolymer, Z 18:1 (b).

Download (367KB)
Indexing metadata
6. Fig. 6. The effect of block copolymers on the position of the maximum intensity of the fluorescence of lysozyme (a), vli‑ the effect of block copolymers on the intensity of the maximum fluorescence of lysozyme (b). Black icons are lysozyme with PGLU10–PEG, white icons are lysozyme with PGLU100–PEG. λmax is the wavelength of the maximum fluorescence intensity; RFU0 is the number of units of lysozyme fluorescence at a wavelength of 339 nm (at λmax); RFU is the number of units of intensity of fluorescence of lysozyme with a block copolymer at a wavelength of 339 nm. RFU0/RFU (λmax) is the ratio of the intensity of the maximum fluorescence of free lysozyme to the intensity of fluorescence of lysozyme with a block copolymer at a wavelength of 339 nm.

Download (149KB)
Indexing metadata
7. Fig. 7. CD spectra of free lysozyme and enzyme in the composition of associates with block copolymers PGLU10–PEG, PGLU100–PEG. The black line is a free lysozyme, the black dotted line is a lysozyme with PGLU100–PEG (Z 18 : 1), the gray dotted line is a lysozyme with PGLU10–PEG (Z 18 : 1).

Download (61KB)
Indexing metadata
8. Figure 8. The effect of block copolymers on lysozyme activity. The black columns are lysozyme with PGLU10– PEG, the white columns are lysozyme with PGLU100–PEG.

Download (87KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2024 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».