Анализ эффективности CRISPR/CAS9-редактирования рибонуклеопротеидными комплексами гена GEX2 в протопластах кукурузы

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Белок GEX2 экспрессируется в мембранах гамет кукурузы и необходим при оплодотворении на этапе контакта (адгезии) мембран гамет. Нокаутирование этого гена, предположительно, может привести к нарушению оплодотворения и, как следствие, образованию матроклинных гаплоидных зародышей кукурузы. Целью исследования является анализ эффективности редактирования гена GEX2 после ПЭГ-опосредованной трансфекции протопластов кукурузы рибонуклеопротеидными (РНП) комплексами с разными гидРНК. Впервые созданы конструкции для CRISPR/Cas9-редактирования гена GEX2 кукурузы, эффективность которых доказана на протопластах и достигает 10,7%, в зависимости от подобранной гидРНК, соотношения и количества компонентов в РНП-комплексах.

Полный текст

Кукуруза (Zea mays L.) − одна из наиболее распространенных сельскохозяйственных культур, производство которой в мире во втором десятилетии XXI века выросло более чем в полтора раза по сравнению с 2010 г., а в России с 1985 по 2018 гг. сбор зерна увеличился в девять раз [1]. Исследование явления гиногенеза у кукурузы представляет научный и практический интерес в связи с разработкой эффективных методов получения гаплоидов, необходимых в частности для ускоренного создания гомозиготных линий. У современных сортов кукурузы гиногенез встречается крайне редко (0.01–0.1%) [2, 3]. Обычно для селекции гомозиготных линий кукурузы, необходимо около шести–восьми поколений, для более быстрого их получения используют в качестве опылителей так называемые линии-гаплоиндукторы, при опылении пыльцой которых в потомстве возникают гаплоидные растения в десятки, сотни раз чаще, по сравнению с нормой.

При двойном оплодотворении у покрытосеменных растений из оплодотворенной яйцеклетки развивается диплоидный зародыш. Центральная клетка с двумя полярными ядрами (2n) в результате слияния со вторым спермием (1n) образует триплоидный эндосперм (3n). При нарушении оплодотворения яйцеклетки у покрытосеменных растений может формироваться гаплоидный зародыш (1n). Одним из механизмов его образования является гиногенез, при котором после проникновения спермия в яйцеклетку их ядра не сливаются, и в последующем развитии участвует только ядро яйцеклетки [4].

За последние 5–7 лет были открыты несколько генов кукурузы, экспрессия которых приводит к развитию в потомстве матроклинных гаплоидов [4]. В 2016 г. был описан ген CENH3, влияющий на расхождение хромосом [5]. Нарушения расхождения хромосом в анафазе митоза могут приводить к полной элиминации хромосом отцовского родителя и образованию гаплоидных зародышей. В 2017 г. тремя независимыми научными группами у линии кукурузы Stock 6 был открыт ген гиногенеза, получивший разные названия – MATRILINEAL (MTL) [6], NOT LIKE DAD (NLD) [7], PLA1 [8]. Мы предположили [9], что мутация по гену кукурузы MTL/NLD/PLA1, кодирующему фермент фосфолипазу, может привести к изменениям в составе липидов мембран и, как следствие – к нарушению способности мембраны спермия к взаимодействию и слиянию с мембраной яйцеклетки. Следуя этой логике, мутации, приводящие к нарушению взаимодействия и слияния мембраны спермия с мембраной яйцеклетки, могут привести к нарушению оплодотворения.

При взаимодействии гамет у растений на этапе контакта (адгезии) мембран необходим белок GEX2 (GAMETE EXPRESSED 2) [10, 11], а на этапе слияния мембран – белок HAP2/GCS1 [12]. В 2019 г. доказано, что ген DMP9, специфически экспрессирующийся в мембранах женской и мужской гамет растений и регулирующий их контакт [13], контролирует также гаплоиндукцию у кукурузы [14].

Эффективный перенос CRISPR-конструкций в клетки растения с целью редактирования генома, их сохранность и экспрессия являются актуальными проблемами современной биологии, в частности, в отношении доставки целевых конструкций. Для эффективного редактирования генома растений применяются различные методы доставки, такие как агробактериальная трансформация, биолистическая трансформация, метод погружения цветочных почек, ПЭГ-опосредованная трансформация протопластов, электропорация [15–17]. Существенные трудности возникают при трансформации однодольных растений с низкой регенерационной способностью.

Редактирование геномов растений с введением чужеродной ДНК в клетки вызывает проблемы, связанные с законодательным запретом коммерческого выращивания генетически модифицированных растений в России [18]. Важным преимуществом доставки компонентов CRISPR-системы в клетки в виде комплекса рибонуклеопротеидов (РНП) является возможность редактирования генов без интеграции в геном чужеродной информации [19–22]. РНП-комплексы действуют быстрее, чем генетические конструкции на основе векторов, поскольку комплекс сразу активен в клетке, не требуя внутриклеточной транскрипции и трансляции. Также необходимо отметить, что при использовании РНП-комплексов мутации вне зоны мишени либо вообще отсутствуют [23], либо их частота оказывается существенно ниже [19, 21].

Существуют различные методы доставки комплексов белков с нуклеиновыми кислотами в растительный геном с эффективностью, позволяющей регулировать различные клеточные процессы [24]. Основным препятствием на пути доставки генетического материала в растительные клетки является клеточная стенка, поэтому введение ДНК в клетки растений, лишенные клеточной стенки (протопласты), значительно повышает эффективность трансформации. Показано, что протопласты кукурузы остаются жизнеспособными через несколько суток после трансфекции, что делает возможным дальнейшее культивирование растительных тканей [25]. Трансформация с использованием ПЭГ представляет собой наиболее часто используемый метод трансформации протопластов, применимый к клеткам различных растений.

Цель исследования – анализ эффективности редактирования гена GEX2 после ПЭГ-опосредованной трансфекции протопластов кукурузы РНП-комплексами с разными гидРНК.

Материалом для исследования служили листья кукурузы линии Коричневый маркер (КМ), созданной С. Чейзом [26]. Протопласты выделяли из клеток мезофилла листа кукурузы в два этапа по методике, описанной в работе [27], c модификациями [28]. Подсчет количества протопластов проводили в камере Горяева при увеличении объектива 20× на микроскопе Leica DM 2500 (США).

Последовательности протоспейсеров для направляющей (гид) РНК к гену gex2 (GenBank accession no. MW195549.1, КМline), определенные с помощью ресурса E-CRISP (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html) или CHOP-CHOP (https://chopchop.cbu.uib.no/), приведены на рис. 1, а. ГидРНК синтезировали в двух вариантах: двухкомпонентную гидРНК, состоящую из CRISPR РНК (crRNA) и трансактивирующей РНК (tracrRNA), и единую направляющую РНК (singleguideRNA, sgRNA).

 

Рис. 1. Оценка эффективности работы РНП-комплексов in vitro и в протопластах кукурузы. а – нуклеотидные последовательности участков гена GEX2, содержащие протоспейсеры для гидРНК 1, 2; целевые сайты для гидРНК выделены серым цветом, РАМ-последовательности – черным. б – электрофорез ПЦР-продуктов с фрагмента гена GEX2 после обработки РНП-комплексами in vitro; дорожки: 1 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 1 после инкубации с РНП-комплексом; 2 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 1 (без обработки); 3 – маркер молекулярного веса ДНК; 4 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 2 после инкубации с РНП-комплексом; 5 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 2 (без обработки). в – электрофорез ПЦР-продуктов с целевым локусом для гидРНК 2. Дорожки: 1 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2, полученный с ДНК протопластов кукурузы после трансформации с РНП-комплексами (45 мг нуклеазы/15 мг гидРНК) и обработанный рестриктазой BstMAI (ожидаемые размеры полос после гидролиза ‒ 324 и 183 пн); 2 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2, полученный с ДНК листа кукурузы и обработанный BstMAI; 3 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2 без обработки BstMAI (507 пн, контроль); 4 – маркер молекулярного веса ДНК, шаг 100 пн.

 

ГидРНК 1 со спейсером GCGATGGAAGCAGTAGGTGA (Chr2: 187666031 –187666050) была синтезирована компанией «Синтол» (Россия) в составе РНК-олигонуклеотидов crRNA – GCGAUGGAAGCAGUAGGUGAGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG и tracrRNA – GGAACCAUUCAAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU. Последовательности РНК-олигонуклеотидов были определены как описано в работе [29].

ГидРНК 2 соспейсером GCGCTACGACATCGTCTCCG, 2:188130318) была получена в виде единой направляющей РНК (GCGCUACGACAUCGUCUCCGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU) с использованием набора для проведения T7-транскрипции invitro (Биолабмикс, Россия). ДНК-матрицу для гидРНК 2 получали ПЦР-амплификацией синтезированных олигонуклеотидов (Синтол, Россия) с использованием высокоточной полимеразы Tersus (Евроген, Россия). Последовательности ДНК-олигонуклеотидов определяли с использованием ресурса (https://sgrna.neb.com/#!/sgrna).

Для проверки специфической активности (целевого расщепления) in vitro 10 мкл реакционной смеси, содержащей 200 нг ПЦР-амплифицированного целевого фрагмента гена GEX2 кукурузы, 400 нМ специфической гидРНК и 400 нМ Cas9-NLS (Биолабмикс, Россия) инкубировали в стандартном буфере для проведения реакции в течение 1 ч. при 37°С. Комплекс Cas9/гидРНК 1 должен расщеплять продукт ПЦР (407 пн) с образованием двух фрагментов – 300 и 107 пн, Cas9/гидРНК 2 должен расщеплять продукт ПЦР (507 пн) с образованием фрагментов – 324 и 183 пн. В экспериментах in vitro РНП-комплекс с гидРНК 1 продемонстрировал очень низкую активность (рис. 1, б, дорожка 1), тогда как РНП-комплекс с гидРНК 2 оказался способен к расщеплению ПЦР-продукта, содержащего целевой локус (рис. 1, б).

Для приготовления 50 мкл РНП-комплексов для трансфекции протопластов использовали 7,5–15 мкг гидРНК и 22,5–45 мкг нуклеазы Cas9 (Биолабмикс, Россия). После 15-минутной инкубации при комнатной температуре РНП-комплексы смешивали с 50 мкл суспензии протопластов кукурузы (1–6 × 105 кл/мл), а затем добавляли 220 мкл 40% раствора ПЭГ (40% ПЭГ-4000, 0,6 М маннит, 0,1 М CaCl2) и инкубировали смесь 40 мин. при 25°С в темноте [30]. Далее к раствору добавляли 850 мкл раствора W5 [31], центрифугировали при 100 g 2 мин. ресуспендировали осадок в 500 мкл раствора W1 [31] и инкубировали при 25°С в темноте. Через сутки протопласты собирали центрифугированием при 100 g 2 мин, выделяли ДНК набором “ДНК-экстран-3” (“Синтол”, Россия) или с использованием додецилсульфата натрия [32]. Редактирование определяли по гидролизу специфическими эндонуклеазами рестрикции ПЦР-фрагментов целевых районов гена GEX2 кукурузы [33]. Сайты узнавания рестриктаз AsuHPI или BstMAI (СибЭнзайм, Россия) находились в области 17–18 нуклеотидов подобранной мишени (3 пн от РАМ-последовательности) для гидРНК 1 и 2. Целевой участок гена GEX2, содержащий протоспейсер, амплифицировали при помощи ПЦР. ПЦР-продукты получали с использованием праймеров Gex2-RNA1-F (TCGTTTCCCGTCCTACTCCT)/Gex2-RNA1-R (ACGAGTGCACAGTGTTGGAA), Gex2-RNA2-F (GGACTTCTTCCCTGCGATTGA) / Gex2-RNA2-R (GGCAAGGACCTGGTGTTACA) и высокоточной полимеразы Tersus (Евроген, Россия). Предварительно очищенные (набор для очистки ДНК CleanUpMini (Евроген, Россия)) продукты ПЦР (60 нг) инкубировали 4 ч с эндонуклеазой рестрикции AsuHPI (гидРНК 1) или BstMAI (гидРНК 2). Электрофорез продуктов рестрикции проводили в 2%-ном агарозном геле, анализ плотности свечения полос ДНК проводили с помощью программы Imagej [34], используя формулу для расчета процента эффективности трансформации и редактирования на основе процентного отношения остаточных нерасщепленных фрагментов ПЦР к общему количеству продуктов ПЦР [35].

Нам не удалось зафиксировать редактирование гена GEX2 в протопластах кукурузы в экспериментах с комплексами Cas9/гидРНК 1. В экспериментах с комплексами Cas9/гидРНК 2 эффективное редактирование было достигнуто только при использовании 45 мкг нуклеазы и 15 мкг гидРНК 2 (рис. 1, в), при соотношении 22,5 мкг нуклеазы и 7,5 мкг гидРНК редактирование не было зарегистрировано (данные не показаны).

Как видно из рис. 1, в часть ПЦР-продукта фрагмента гена GEX2 осталась негидролизованной специфической эндонуклеазой рестрикции BstMAI (дорожка 1, верхняя полоса 507 пн), в отличие от полностью гидролизованного ПЦР-продукта в контроле (дорожка 2). Ампликоны с мутантными последовательностями устойчивы к расщеплению BstMAI, поскольку включают сайт узнавания рестрикционного фермента, который нарушен мутацией, индуцированной CRISPR/Cas9. Оценка плотности свечения полос с помощью программы Imagej в двух независимых экспериментах показала, что на долю свечения верхней полосы (507 пн) приходится 6,5 и 10,7% всего свечения ПЦР-продукта. То есть в двух независимых экспериментах, с использованием 45 мкг нуклеазы Cas9 и 15 мкг гидРНК 2 эффективность редактирования гена GEX2 составила 6,5 и 10,7%. Анализ литературных данных показал, что CRISPR-Cas9-редактирование протопластов кукурузы с подобранными гидРНК к гену инозитолфосфаткиназе дает эффективность от 0,85 до 5,85% [35]. В наших экспериментах эффективность трансформации и редактирования протопластов зависела от используемой гидРНК, соотношения и количества компонентов в РНП-комплексе.

Таким образом, можно количественно оценивать эффективности CRISPR/Cas9-редактирования генома протопластов кукурузы РНП-комплексами с разными гидРНК.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ (МК-4527.2022.1.4) и Программы фундаментальных исследований Государственных академий наук на 2021-2023 годы (№ 121031700141-7).

Авторы признательны О.В. Гуторовой за предоставленные семена кукурузы. Авторы признательны рецензентам за конструктивные замечания, улучшившие качество статьи.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Об авторах

Е. М. Моисеева

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049

В. В. Фадеев

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"; Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049; Саратов, 410012

Ю. В. Фадеева

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"; Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049; Саратов, 410012

Ю. С. Гусев

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"; Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049; Саратов, 410012

М. И. Чумаков

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"

Автор, ответственный за переписку.
Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049

Список литературы

  1. Чумаков М.И., Гусев Ю.С., Богатырева Н.В., Соколов А.Ю. Оценка рисков распространения генетически модифицированной кукурузы с пыльцой при выращивании с нетрансформированными сортами (обзор) // С-хоз. биология. 2019. Т. 54. № 3. С. 426−445. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2019.3.426rus
  2. Chase S.S. Monoploid frequencies in a commercial double cross hybrid maize, and its component single cross hybrids and inbred lines // Genetics. 1949. V. 34. № 4. P. 384–392. https://doi.org/10.1134/S1022795422040044
  3. Coe E.H. A line of maize with high haploid frequency // Am. Naturalist. 1959. V. 93. № 873. P. 381–382. https://doi.org/10.1086/282098
  4. Чумаков М.И., Мазилов С.И. Генетический контроль гиногенеза у кукурузы (обзор) // Генетика. 2022. Т. 58. № 4. С. 388–397. https://doi.org/10.1134/S1022795422040044 .
  5. Kelliher T., Starr D., Wang W. et al. Maternal haploids are preferentially induced by CENH3-tailswap transgenic complementation in maize // Front. Plant Sci. 2016. V. 7. P. 414. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00414
  6. Kelliher T., Starr D., Richbourg L. et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction // Nature. 2017. V. 542. P. 105−109. https://doi.org/10.1038/nature20827
  7. Gilles L.M., Khaled A., Laffaire J.B. et al. Loss of pollen-specific phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize // EMBO J. 2017. https://doi.org/10.15252/embj.201796603
  8. Liu C., Li X., Meng D. et al. A 4-bp insertion at ZmPLA1 encoding a putative phospholipase a gene rates haploid induction in maize // Mol. Plant. 2017. V. 10. P. 520−522. https://doi.org/10.1016/j.molp.2017.01.011
  9. Чумаков М.И. Матроклинная гаплоидия и взаимодействие гамет у кукурузы (обзор) // Генетика. 2018. Т. 54 № 10. C. 1120–1124. https://doi.org/10.1134/S1022795418100058
  10. Mori H. Kuroiwa T., Kranz E., Scholten S. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization // Nat. Cell Biol. 2006. V. 8. P. 64−71. https://doi.org/10.1038/ncb1345
  11. Besser V.K., Frank A.C., Johnson M.A., Preuss D. Arabidopsis HAP2(GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization // Development. 2006. V. 133. P. 4761−4769. https://doi.org/10.1242/dev.02683
  12. Mori T., Igawa T., Tamiya G. et al. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis // Curr. Biol. 2014. V. 24. P. 170−175. https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.11.030
  13. Takahashi T., Mori T., Ueda K. et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants // Development. 2018. V. 45. dev170076. doi: 10.1242/dev.170076
  14. Zhong Y., Liu C., Qi X. et al. Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize // Nat. Plants. 2019. V. 5. P. 575–580. https://doi.org/10.1038/s41477-019-0443-7
  15. Paszkowski J., Baur M., Bogucki A., Potrykus I. Gene targeting in plants // The EMBO J. 1988. V. 7. № 13. P. 4021−4026. https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1988.tb03295.x
  16. Banakar R., Eggenberger A.L., Lee K. et al. High-frequency random DNA insertions upon co-delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein and selectable marker plasmid in rice // Sci. Rep. 2019. V. 9. № 1. P. 19902. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55681-y
  17. Sandhya D., Jogam P., Allini V.R. et al. The present and potential future methods for delivering CRISPR/Cas9 components in plant // J. Genet. Eng. Biotechnol. 2020. V. 18. P. 25. https://doi.org/10.1186/s43141-020-00036-8
  18. Богатырева Н.В., Соколов А.Ю., Моисеева Е.М. и др. Правовое положение растений, полученных с использованием технологии редактирования генома: перспективы для России // Экологическая генетика. 2021. Т. 19. № 1. С. 89−101. https://doi.org/10.17816/ecogen42532
  19. Cho S.W., Lee J., Carroll D. et al. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9–sgRNA ribonucleoproteins // Genetics. 2013. V. 195. P. 1177−1180. https://doi.org/10.1534/genetics.113.155853
  20. Woo J.W., Kim J., Kwon S. et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins // Nat. Biotechnology. 2015. V. 33. № 11. P. 1162−1164. https://doi.org/10.1038/nbt.3389
  21. Liang Z., Chen K., Li T. et al. Efficient DNA‐free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes // Nat Com. 2017. V. 8. P. 14261. https://doi.org/10.1038/ncomms14261
  22. De Witt M.A., Corn J.E., Carroll D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein // Methods. 2017. V. 121−122. P. 9−15. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2017.04.003
  23. Svitashev S., Schwartz C., Lenderts B. et al. Genome editing in maize directed by CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein complexes // Nat. Com. 2016. V. 7. P. 13274. https://doi.org/10.1038/ncomms14261
  24. Кулуев Б.Р., Гумерова Г.Р., Михайлова Е.В. и др. Доставка CRISPR/CAS-компонентов в клетки высших растений для редактирования их геномов // Физиол. растений. 2019. Т. 66. № 5. С. 339−353. https://doi.org/10.1134/S0015330319050117
  25. Kanchiswamy C.N. DNA-free genome editing methods for targeted crop improvement // Plant Cell Rep. 2016. V. 35. P. 1469−1474. https://doi.org/10.1007/s00299-016-1982-2
  26. Chase S.S. Monoploids and monoploid-derivatives of maize (Zea mays L.) // The Bot. Review. 1969. V. 35. № 2. P. 117−168. https://doi.org/10.1007/BF02858912
  27. Wolter F., Edelmann S., Kadri A., Scholten S. Characterization of paired Cas9 nickases induced mutations in maize mesophyll protoplasts // Maydica. 2018. V. 62. № 2. P. 1−11.
  28. Красова Ю.В., Фадеев В.В., Моисеева Е.М. и др. Оптимизация методики получения протопластов кукурузы и их нативность после электропорации// Изв. Саратовского у-та. Серия: Химия. Биология. Экология. 2022. Т. 22. Вып. 4. С. 445−454. https://doi.org/10.18500/1816-9775-2022-22-4-445-454
  29. Mekler V., Minakhin L., Semenova E. et al. Kinetics of the CRISPR-Cas9 effector complex assembly and the role of 3’-terminal segment of guide RNA // Nucl. Ac. Res. 2016. V. 44. № 6. P. 2837−2845. https://doi.org/10.1093/nar/gkw138
  30. Sant’Ana R.R.A., Caprestano C.A., Nodari R.O., Agapito-Tenfen S.Z. PEG-delivered CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins system for gene-editing screening of maize protoplasts // Genes. 2020. V. 11. P. 1029−1043. https://doi.org/10.3390/genes11091029
  31. Yoo S.D., Cho Y.H., Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: А versatile cell system for transient gene expression analysis // Nature Protocols. 2007. V. 2. № 7. P. 1565−1572. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.199
  32. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. 408 c.
  33. Shan Q., Wang Y., Li J. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system // Nat. Biotechnol. 2013. V. 31. № 8. P. 686–688. https://doi.org/10.1038/nbt.2650
  34. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nat. Methods. 2012. V. 9. P. 671–675. https://doi.org/10.1038/nmeth.2089
  35. Sentmanat M.F., Peters S.T., Florian C.P. et al. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing // Sci. Reports. 2018. V. 8. P. 888−895. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19441-8

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Оценка эффективности работы РНП-комплексов in vitro и в протопластах кукурузы. а – нуклеотидные последовательности участков гена GEX2, содержащие протоспейсеры для гидРНК 1, 2; целевые сайты для гидРНК выделены серым цветом, РАМ-последовательности – черным. б – электрофорез ПЦР-продуктов с фрагмента гена GEX2 после обработки РНП-комплексами in vitro; дорожки: 1 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 1 после инкубации с РНП-комплексом; 2 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 1 (без обработки); 3 – маркер молекулярного веса ДНК; 4 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 2 после инкубации с РНП-комплексом; 5 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 2 (без обработки). в – электрофорез ПЦР-продуктов с целевым локусом для гидРНК 2. Дорожки: 1 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2, полученный с ДНК протопластов кукурузы после трансформации с РНП-комплексами (45 мг нуклеазы/15 мг гидРНК) и обработанный рестриктазой BstMAI (ожидаемые размеры полос после гидролиза ‒ 324 и 183 пн); 2 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2, полученный с ДНК листа кукурузы и обработанный BstMAI; 3 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2 без обработки BstMAI (507 пн, контроль); 4 – маркер молекулярного веса ДНК, шаг 100 пн.

Скачать (238KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».