Экзосомальные микроРНК-146a и микроРНК-424 как возможные предикторы ответа на терапию ингибиторами иммунных контрольных точек при светлоклеточной почечно-клеточной карциноме

Полный текст

В последние годы произошла существенная эволюция в терапии рака, направленная главным образом на применение иммунотерапевтических подходов, заменяющих классические методы лечения, такие как химиотерапия, лучевая терапия и хирургия, или в сочетании с ними [1]. Ингибиторы контрольных точек иммунитета (ИКТИ) являются хорошо зарекомендовавшими себя высокоэффективными препаратами для лечения различных видов рака, включая светлоклеточную почечно-клеточную карциному (скПКК). Несмотря на прогресс и беспрецедентные достижения в области иммунотерапии рака, резистентность остается серьезной клинической проблемой [2, 3].

Некодирующие РНК в последние несколько лет стали ключевыми игроками в эпигенетической регуляции генов, среди них микроРНК (miRNAs) широко изучаются на предмет их потенциальной роли в регуляции различных клеточных процессов в норме и патологии. МикроРНК – это некодирующие РНК длиной около 22 нуклеотидов, которые являются посттранскрипционными регуляторами экспрессии генов [4]. Способность микроРНК ингибировать трансляцию онкогенов и опухолевых супрессоров предполагает их участие в канцерогенезе [5–7]. Предыдущие исследования показали, что микроРНК стабильны в плазме или сыворотках крови, тканеспецифичны и имеют прогностическую клиническую ценность в качестве биомаркеров [8, 9].

Цель данного исследования – оценка профиля экспрессии экзосомальных микроРНК (микроРНК-424, -146а, -503, -144) у пациентов со светлоклеточной почечно-клеточной карциномой до и после терапии ингибиторами контрольных точек иммунного ответа для поиска дополнительных биомаркеров эффективности иммунотерапии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие 42 пациента с гистологически подтвержденным диагнозом “светлоклеточная почечно-клеточная карцинома”, получавшиx терапию ингибиторами контрольных точек иммунного ответа в период с 2020 по 2023 г., проживающиx на территории Республики Башкортостан. Забор образцов венозной крови у пациентов до и после терапии осуществлялся сотрудниками Республиканского клинического онкологического диспансера, отделения онкологии и урологии клиники Башкирского государственного медицинского университета. От каждого пациента было получено информированное согласие на забор биологического материала и проведение молекулярно-генетического исследования.

Выделение экзосомальных микроРНК из 1 мл плазмы крови, синтез кДНК и количественную ПЦР в реальном времени проводили, как описано ранее [10] с использованием соответствующих наборов miRCURY LNA (Qiagen, Hilden, Германия) на приборе для ПЦР в реальном времени Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden). МикроРНК-16 и микроРНК-1228 были использованы в качестве референсных генов (эндогенный контроль), а UniSp2, UniSp4, UniSp5, UniSp6 и синтетическая микроРНК-39 – в качестве экзогенных контролей выделения, обратной транскрипции и амплификации, входящих в состав наборов (Qiagen, Hilden). Уровень экзосомальных микроРНК оценивали методом 2^–ΔΔCt.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ экспрессии был проведен с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Наблюдалась статистически значимая дисрегуляция экспрессии экзосомальных микроРНК-424 и микроРНК-146а. Уровни экспрессии микро-РНК увеличились после терапии (микро-РНК-424 = Mean ± SEM 1.202 ± 0.15 и микроРНК-146a = 12.22 ± 1.45) по сравнению с уровнями до терапии (микроРНК-424 = Mean ± SEM 0.63 ± 0.17; p-value = 0.03 и микроРНК-146a = 7.03 ± 0.90; p-value = 0.006). Остальные микроРНК не продемонстрировали существенных различий в уровнях экспрессии микроРНК между двумя группами (p-value > 0.05) (рис. 1,а–г; табл. 1).

 

Рис. 1. Уровни экспрессии экзосомальных микроРНК у пациентов с скПКК, получавших терапию ИКТИ. а – miRNA-424; б – miRNA-503; в – miRNA-146a; г – miRNA-144. Уровень значимости p-value рассчитывался с использованием критерия Вилкоксона. bt – до терапии; at – после терапии.

 

Таблица 1. Анализ экспрессии экзосомных микроРНК

МикроРНК	До терапии ИКТИ (Mean ± SEM)	После терапии ИКТИ (Mean ± SEM)	p-value
146a	7.03 ± 0.90	12.22 ± 1.45	0.006
424	0.63 ± 0.17	1.202 ± 0.15	0.03
503	0.77 ± 0.05	0.71 ± 0.05	0.18
144	2.42 ± 0.46	2.58 ± 0.65	0.668

Примечание. Полужирным шрифтом даны статистически значимые результаты.

 

Целевые микроРНК обладают широким спектром биологических функций. Было обнаружено, что многие из изученных генов – функциональные, тесно связанные с ПКК и иммунитетом. Анализ KEGG-путей показал, что микроРНК-424 и микроРНК-146а были значительно обогащены в нескольких путях (табл. 2, рис. 2).

 

Таблица 2. Анализ путей обогащения KEGG для экзосомальных микроРНК-146а и микроРНК-424

FDR	Число генов-мишеней	Число генов сигнального пути	Название сигнального пути
2.9 *10–8	5	89	Экспрессия PD-L1 и сигнальный путь контрольных точек в онкологии
4.8*10–7	4	76	Коклюш
1.1*10–6	4	101	Болезнь Шагаса
2.5*10–5	3	76	Лейшманиоз
1.1*10–6	4	103	Сигнальный путь Toll-подобных рецепторов
1.1*10–6	4	104	Сигнальный путь NF-kappa B
1.4*10–7	5	139	Корь
1.4*10–6	4	112	Токсоплазмоз
1.9*10–7	5	161	Гепатит В
2.8*10–6	4	137	Иерсиниозная инфекция
2.9*10–6	4	141	Алкогольная болезнь печени
2.4*10–7	5	179	Туберкулез
6.7*10–5	3	109	Сигнальный путь HIF-1
4.4*10–7	5	210	Инфекция вируса иммунодефицита человека 1
1.0*10–5	4	197	Инфекция патогенной кишечной палочки
1.0*10–5	4	202	Инфекция вируса Эпштейна-Барр
1.2*10–5	4	214	Липиды и атеросклероз
1.6*10–5	4	232	Коронавирусная инфекция
2.0*10–5	4	249	Инфекция сальмонелл
3.4*10–5	4	294	Сигнальный путь MAPK

 

Рис. 2. Анализ обогащения сигнальных путей GO и диаграмма, отражающая результаты анализа обогащения KEGG-путей, проведенного для микроРНК-146a и микроРНК-424 и их валидированных мишеней.

 

Для оценки участия валидированных генов-мишеней микроРНК-424 и микроРНК-146а в соответствующих сигнальных путях, развивающих иммуновоспалительные реакции при раке, был проведен анализ Gene Ontology (GO) (рис. 3).

 

Рис. 3. Сигнальный путь экспрессии PD-L1 и контрольных точек PD-1, включая валидированные гены-мишени микроРНК-146а и микроРНК-424 (выделены красным цветом), согласно базе данных KEGG.

 

Для оценки диагностической точности экзосомальных микроРНК как маркеров эффективности терапии ИКТИ были построены ROC-кривые. Результаты показали, что площадь под кривой (AUC) микроРНК-424 составляет 0.804 (95% ДИ: 0.7082–0.9006) и обеспечивает 73.8% специфичности и 88.1% чувствительности; диагностическая точность микроРНК-424 выше, чем у комбинации микроРНК (рис. 4).

 

Рис. 4. ROC-анализ для прогнозирования ответа на терапию ИКТИ при скПКК на основе анализа экспрессии экзосомальной микроРНК-424.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на то, что иммунотерапия высокоэффективна при многих видах рака на поздних стадиях, часть пациентов остается резистентной к терапии или вынуждена отменить терапию из-за тяжелых побочных эффектов, связанных с иммунитетом. Ввиду того, что для назначения иммунотерапии используется опухолевая (тканевая) экспрессия PD-L, которая не является специфичным и точным маркером, существует острая потребность в более достоверных биомаркерах для прогнозирования ответа на иммунотерапию, что позволит избирательно стратифицировать пациентов. Экспрессия микроРНК у пациентов, получавших иммунотерапию, и потенциальная роль микроРНК в реакции пациентов на терапию – на сегодняшний день актуальная тема для исследования. Работы по изучению профиля экспрессии экзосомальных микроРНК у пациентов с скПКК, получающих терапию ИКТИ, представлены единичными исследованиями, что требует более детального изучения роли микроРНК в прогнозировании эффективности терапии ИКТИ.

В исследовнии Z. Wang с соавт. сообщалось, что циркулирующая микроРНК-21 функционирует как неинвазивный прогностический биомаркер ответа при иммунотерапии рака [11]. L. Chen с соавт. [12] продемонстрировали, что микроРНК-200 ингибирует PD-L1, предотвращая эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и метастазирование при раке легких. Известно, что p53 регулирует PD-L1 с помощью микроРНК-34a [13], которая непосредственно связывается с 3'-нетранслируемой областью PD-L1 при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ), подавляя экспрессию PD-L1.

Лекарственная устойчивость – одна из наиболее значимых проблем в клинической практике. Было показано, что потеря микроРНК-424(322)/503 способствует развитию химиорезистентности за счет регуляции двух ее мишеней – регулятора апоптоза BCL-2 и рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 IGF1R, а таргетная терапия, блокирующая аберрантную активность этих мишеней, восстанавливает чувствительность к химиотерапии [14].

Имеются данные, что микроРНК-424 участвует в формировании лекарственной устойчивости больных раком желудка, получающих химиотерапию препаратами платины. Одним из генов-мишеней микроРНК-424 является SMURF1, который участвует в убиквитиназной активности. У пациентов, резистентных к цисплатину, снижение экспрессии микроРНК-424 увеличивало экспрессию гена Е3-убиквитин-протеинлигазы SMURF1, а также стимулировало экспрессию гена члена семейства гомологов Ras A RHOA, который играет роль в лекарственной устойчивости [15]. В другом исследовании было показано, что снижение экспрессии микроРНК-424-3p препятствует увеличению экспрессии гена ABCC2, кодирующего белок 2, связанного с множественной лекарственной устойчивостью, и приводит к лекарственной устойчивости и прогрессии опухоли, а противоположные результаты были получены Y. Li с соавт., которые показали, что как in vivo, так и in vitro сверхэкспрессия микроРНК-424-3p играет важную роль в устойчивости клеток рака желудка к цисплатину [16]. Известно, что гипоксия индуцирует экспрессию микроРНК-424, а сверхэкспрессия этой микроРНК подавляет опухолевый супрессор PDCD4, участвующий в апоптозе. В исследовании D. Zhang с соавт. снижение регуляции микроРНК-424 повышало гибель клеток под воздействием доксорубицина, обусловленную усилением апоптоза [17].

В другом исследовании стимуляция экспрессии микроРНК-424-3p способствовала сенсибилизации клеток рака яичников к цисплатину за счет снижения экспрессии белка галектина-3, кодируемого геном LGALS3 [18]. Также был идентифицирован ряд микроРНК (микроРНК-34a, -34b, -187, -199a, -199b, -146a, -15b, -130a, -214, и -424), которые дифференциально экспрессируются при лечении доксорубицином. Исследование биологической значимости идентифицированных микроРНК выявило взаимосвязь с функцией кардиомиоцитов и кардиотоксичностью, что позволит в дальнейшем использовать определенные сигнатуры микроРНК в качестве потенциальных биомаркеров лекарственно-индуцированной кардиотоксичности [19].

Известно, что в формировании лекарственной резистентности при остеосаркоме большую роль играет длинная некодирующая РНК (lncRNA) LINC01116, которая ингибирует экспрессию микроРНК-424-5p, связываясь с геном EZH2, кодирующим гистон-лизин-N-метилтрансферазу, и тем самым повышает устойчивость клеток остеосаркомы к доксорубицину [20]. B. Ralla с соавт. исследовали роль микроРНК-9-5p в резистентности к другой группе препаратов, ингибиторам тирозинкиназ (ИТК), в сравнении с другими клиническими признаками (возраст, пол, стадия опухоли, статус метастазирования и др). Сверхэкспрессия микроРНК-9-5p и пониженная экспрессия микроРНК-489-3p были ассоциированы с отсутствием ответа на терапию ИТК у пациентов с метастатической ПКК [21]. В другом исследовании, проведенном A. Gamez-Pozo с соавт., изучалась прогностическая способность моделей, включающих экспрессию микроРНК, в отношении резистентности к терапии сунитинибом. При сравнении таких моделей с классификацией риска MSKCC для прогнозирования общей выживаемости модель, включающая микроРНК-192, -193-3p и -501-3p, показала хорошую способность выявлять пациентов с плохим ответом на терапию и хорошую точность прогнозирования общей выживаемости [22]. По данным исследования, проведенного J. Kovacova и соавт., микроРНК-376b-3p может быть использована для прогнозирования ответа на терапию сунитинибом при метастатических опухолях [23].

J. He с соавт. [24] предположили, что микроРНК-31-5p, транспортируемая внеклеточными везикулами, участвует в развитии резистентности к мультитаргетному рецептору тирозинкиназ сорафенибу. Y. Liu с соавт. исследовали систему доставки лекарственных средств в виде нановезикул, нагруженных комбинацией анти PD-L1 и микроРНК-424. Эти нановезикулы активировали Т-клетки, которые высвобождали большое количество цитокинов, таких как IFN-γ и IL-2, для активации макрофагов и NK-клеток, что способствовало ингибированию роста подкожно трансплантированной гепатоцеллюлярной карциномы у мышей [25].

Во многих исследованиях микроРНК-146а рассматривается как негативный регулятор иммунной активации, сопоставимый с молекулами иммунных чекпоинтов. Известно, что микроРНК-146a играет центральную роль в оси STAT1/IFNγ в микроокружении меланомы, влияя на миграцию, пролиферацию, функцию митохондрий и уровень PD-L1[26]. Установлено, что при снижении экспрессии микроРНК-146a развиваются заметно более тяжелые иммуноопосредованные нежелательные явления (иоНЯ). А полиморфный вариант (SNP) rs2910164, приводящий к снижению экспрессии микроРНК-146a, ассоциирован с повышенным риском развития тяжелых иоНЯ [27]. В нашей работе мы также подтвердили, что снижение экспрессии микроРНК-146 у больных с скПКК с тяжелыми иоНЯ и SNP rs2910164 коррелируют с повышенным риском развития тяжелых осложнений [10]. Ранее было описано, что регуляция микроРНК-146a играет важную роль в усилении иммунной супрессии путем увеличения популяции регуляторных Т-клеток и может модулировать лекарственную устойчивость опухолевых клеток [28].

В другом исследовании выявили снижение микроРНК-150, -146a и -424 в мононуклеарных клетках периферической крови у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, вероятно ассоциированных с позитивностью аутоантител и разрушением эндогенной остаточной функции бета-клеток, что указывает на участие этих микроРНК в регуляции имунного ответа [29].

X.-X. Peng и соавт. оценили возможность использования экзосомальных микроРНК плазмы крови в качестве биомаркеров у пациентов с НМРЛ, получающих иммунотерапию [30]. В этом исследовании три микроРНК семейства hsa-miRNA-320 (микроРНК-320d, -320c и -320b) были определены как потенциальные предикторы ответа, поскольку их уровни были значительно повышены в группе пациентов с прогрессирующим заболеванием по сравнению с группой пациентов с частичным ответом на исходном уровне до начала лечения. Кроме того, было обнаружено, что уровень микроРНК-125b-5p снижен у пациентов, ответивших на лечение ИКТИ. A.R. Halvorsen с соавт. провели секвенирование следующего поколения (NGS) с профилированием микроРНК в образцах сыворотки крови, собранных у пациентов с НМРЛ до начала иммунотерапии ниволумабом [31]. Они выявили сигнатуру, состоящую из семи микроРНК (микроРНК-215-5p, -411-3p, -493-5p, -494-3p, -495-3p, -548-5p и -93-3p), которая была статистически значимо связана с общей выживаемостью. M. Boeri и соавт. проспективно оценивали экспрессию микроРНК плазмы крови у пациентов с НМРЛ до начала терапии ИКТИ. Анализ профиля ряда микроРНК позволил оценить взаимосвязь с такими показателями как общая частота ответа, выживаемость без прогрессирования и общая выживаемость. Уровень экспрессии микроРНК во время терапии снижался и оставался низким до прогрессирования опухоли у пациентов, отвечающих на терапию. Анализ профиля ряда микроРНК позволил оценить взаимосвязь с такими показателями как общая частота ответа, выживаемость без прогрессирования и общая выживаемость. Уровень экспрессии микроРНК во время терапии снижался и оставался низким до прогрессирования опухоли у пациентов, отвечающих на терапию [32].

N. Rajakumar с соавт. также оценивали профиль экспрессии различных микроРНК при НМРЛ и выявили пять микроРНК (микроРНК-2115-3р, -218-5р,-224-5р,-4676-3р,6503-5р) для оценки риска, позволяющие предсказать общую выживаемость пациентов с НМРЛ IV стадии, получающих монотерапию ингибитором PD-1 [33]. Другие итальянские исследователи признали экзосомальную микроРНК-625-5p новым независимым биомаркером ответа и выживаемости у пациентов, получающих ИКТИ в первой, второй или третьей линии терапии при НМРЛ [34].

Ответ на иммунотерапию, вероятно, определяется сложным взаимодействием между опухолью и иммунозависимыми факторами, что по своей сути ограничивает прогнозирование ответа на основе отдельно взятых биомаркеров и односторонних параметров опухоли. К тому же ограниченность выборки, гетерогенность опухоли, межпопуляционные различия также требуют дальнейшего углубленного изучения для восполнения пробела в знаниях. Очевидно, что выявление и валидация дополнительных прогностических биомаркеров для оценки эффективности и безопасности иммунотерапии будут активным направлением исследований на несколько лет вперед. В эпоху персонализированной медицины необходимы дальнейшие исследования и подтверждение результатов на более крупной независимой когорте пациентов, а также моделирование in vitro и in vivo, что позволит внедрить микроРНК для мониторинга и прогнозирования реакции на лечение и резистентности терапии ИКТИ в клинических условиях.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-00392, https://rscf.ru/project/23-25-00392/.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

Д. Д. Асадуллина

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук; Башкирский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: dilara.asadullina@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054; Уфа, 450008

И. Р. Гилязова

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук; Башкирский государственный медицинский университет

Email: gilyasova_irina@mail.ru
Россия, Уфа, 450054; Уфа, 450008

Е. А. Иванова

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Email: dilara.asadullina@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

С. М. Измайлова

Башкирский государственный медицинский университет

Email: dilara.asadullina@yandex.ru
Россия, Уфа, 450008

Г. Р. Гилязова

Башкирский государственный медицинский университет

Email: dilara.asadullina@yandex.ru
Россия, Уфа, 450008

В. Н. Павлов

Башкирский государственный медицинский университет

Email: dilara.asadullina@yandex.ru
Россия, Уфа, 450008

Э. К. Хуснутдинова

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук; Башкирский государственный медицинский университет

Email: dilara.asadullina@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054; Уфа, 450008

Список литературы

Дополнительные файлы